尾气在线检测分析在发酵中的应用_刘仲汇

发酵科技通讯第41卷

发酵中尾气组分浓度变化反映了整个发酵过程物质的变化情况。特别是尾气中CO2和O2的变化，包含了非常有价值的过程反应信息。CO2是细胞呼吸和分解代谢的终产物,还是某些合成代谢的基质。几乎所有发酵均产生大量CO2。CO2的产生是一种重要的生长指标，特别适用于早期生长阶段。在对数生长期CO2的释放在一定条件下与细胞量成正比。监测CO2的生成是跟踪生长活动的有效方法。氧是构成细胞本身及代谢产物的组分之一。对于好氧发酵，无论是基质的氧化、菌体的生长或是产物的代谢均需要大量的氧[1-2]。通过发酵尾气中的CO2及O2在线检测分析，可以获取发酵过程重要的呼吸代谢参数，如CO2释放速率（CER）、摄氧率（OUR）、呼吸商（RQ）等。这些参数反映了微生物的代谢状况，尤其能提供从生长向生产过渡或主要基质间的代谢过渡指标。CO2释放率(Carbon-dioxideEscapeRate，CER)是指单位时间、单位体积发酵液细胞释放的CO2量。摄氧率（OxygenUptakeRate,OUR）是指单位时间、单位体积发酵液细胞消耗的氧。OUR取决于菌体浓度，也与发酵液的营养成分、溶解氧水平、菌体的生长速率以及碳源的种类和浓度等因素有关。CER除以OUR所得的商称为呼吸商(RespiratoryQuotient,RQ)。呼吸商是各种碳源在发酵过程中代谢状况的指示值。在碳源限制且供氧充分的情况下，各种碳源都趋向于完全氧化，呼吸商应接近于其理论值。而供氧不足时，碳源不完全氧化，可使呼吸商偏离理论值[3-5]。

目前发酵尾气CO2和O2检测分析技术已日臻成熟。其性能稳定，可靠性高，可实现连续在线检测。因是从尾气取气分析，对发酵无任何影响；

也无需高温灭菌，故为其应用创造了有利条件。

近年来，尾气分析在发酵中的应用研究越来越广泛深入。这些对于深入研究发酵过程机理，摸索、优化发酵工艺，全面控制发酵过程具有重大意义；尤其在基因工程、生物制药领域，能够大大加快新品研发及产业化，稳定生产，提高产率。

1发酵过程状态识别微生物发酵是个复杂的生化过程。在宏观上表现为整个发酵过程的有规律性，即一般都经过迟滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。然而由于诸多因素的影响，又使各个发酵阶段与具体的时间关系表现为无规律性。这给发酵过程的准确控制带来困难。因此正确辨识发酵各个阶段对于过程优化控制具有重要意义。

研究表明,无论对于霉菌、酵母菌、细菌，单液相体系、双液相体系,纯种发酵、混合菌发酵，CER

的变化与体系状态的变化有着密切联系，根据CER的变化规律可以有效、准确地把握发酵过程。李强等对青霉素、古龙酸、二元酸和葡萄糖酸发酵四个体系CER的变化规律进行研究，分析了

尾气在线检测分析在发酵中的应用刘仲汇史建国朱思荣扬艳高广恒李雪梅（山东省科学院生物研究所山东省生物传感器重点实验室山东济南250014）

摘要：通过尾气在线检测分析可获取发酵过程重要的呼吸代谢参数CER,OUR,RQ等。这些参数反映了微生物的代谢状况，无论对动力学研究还是优化工艺、全面控制发酵过程、提高产量产率都具有重大意义。本文综合论述了其在发酵各方面的应用。

关键词：发酵尾气CO

2O2CEROURRQ

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CO2释放与发酵各个阶段的关系，证明CER用于过程判断及控制是可行的[6]。李元广等在十三碳烷烃生产十三碳二元酸发酵中发现随着菌体生长，CER不断增大，当菌体生长基本停止时，CER达到最大值，然后便开始下降。据此可以通过CER来及时确定进入产酸期的最佳时间，即CER达到最大值时[7]。杨强大等利用在线检测OUR对特定发酵阶段的比生长率进行预估，再利用预估值进行发酵阶段的在线辨识，并应用于100L诺西肽发酵。依据辨识得到的发酵阶段为0h~13h为延迟期,13h~38h为指数生长期，38h以后为稳定期。该结果与实际过程相一致。这种估计方法无延迟,非常适合在线应用[8]。间歇发酵放罐时机的准确识别对提高产量和产率，降低能耗和成本有实际意义。傅春生等利用在线检测的尾气CO2变化率、DO变化率，辅以离线检测的总糖浓度变化率、氨基氮浓度变化率及pH，并根据某抗生素生产数据，建立了该发酵过程放罐时机识别与预报模型及计算机实时识别系统。5批实验表明模型判断比人工更及时，且模型判断的产量对于发酵终点的相对值高于人工判断[9]。安居白等依据尾气CO2、O2及DO等在线参数,运用Bayes数据融合计算菌体生长状态概率，建立了在线识别菌体生长状态的柠檬酸发酵控制专家系统，在1.5m3试验罐上提高产物对底物的比近十个百分点[10]。2优化供氧对于好氧发酵，为确保生产菌获得适量的溶氧，将溶氧控制在临界氧浓度之上即可。这样既避免了细胞因供氧不足发生代谢异常，也可避免过度供氧引起的能量消耗和对细胞可能的伤害。根据OUR的变化可以很方便确定临界氧浓度。其原理是：当发酵罐在一定操作系统下，体积传氧系数Kla保持恒定时，随着OUR上升，DO呈下降趋势，当OUR下降，则DO上升，OUR与DO存在相反的变化趋势。而当DO降到临界氧浓度以下时，OUR随DO的下降而下降。由于发生在此变化的时间内，菌体浓度变化可忽略，OUR的变化可看做是呼吸强度（即比耗氧速率）的变化。所以如果存在OUR与DO变化一致的阶段，即为溶解氧低于临界值的阶段，从而可确定此时的临界氧水平。戴剑漉等在30L发酵罐上研究了必特螺旋

霉素基因工程菌发酵中OUR、CER及DO等参数变化的相关性，发现当DO与OUR的趋势具有相反性时,限制因素为细胞水平的菌体代谢问题；若DO与OUR的趋势具有同一性,限制性因素为工程水平的氧传递因素,表明溶氧处于临界氧以下；

并据此判断发酵前期临界氧浓度应在25%，为其发酵放大工艺研究提供了依据[11]。

通气量的调节很多是凭借经验。在安装溶氧电极时可根据临界氧来调控。谌颉在阿维菌素发酵中用尾气数据进行通气量控制，发现在产素期当通气量由1600m3/h降到1400m3/h时,CER

、

OUR立即开始下降,RQ则是先升后降，说明供氧对代谢的限制已经显现。后来测定的产素速率也在此时下降。以此确定产素期通气量临界值为1600m3/h[12]

。

3指导流加补料流加发酵可在系统中维持很低的基质浓度，

从而避免发生阻遏效应，并按设备能力维持适当供氧，减缓代谢有害物的不利影响。因而可对发酵过程进行控制，提高生产水平。利用尾气在线检测分析可以合理控制流加时间、流加速率，进而实现流加的反馈控制。

Cooney曾基于CO2总释放量的积分，推导出

精确的菌体量，据此来控制糖的流加速率[13]。

陈冠胜等根据多批青霉素生产测得的CER,

采用模糊控制技术，在青霉素生产期将CER作为控制参数进行补糖。该控制算法能针对菌丝的瞬间代谢情况流加糖，使菌丝对糖的利用能力大大加强，效率提高了10%左右[14]。

固定化酵母发酵中，载体的存在使葡萄糖扩散受阻。如不能对糖浓度变化快速反应，载体中的细胞就会出现缺糖现象。这种体系的特殊性也很难用估计糖浓度的方法来进行预测。潘小飞利用CER和CO2释放量来估计载体内菌体对糖的饥

饱程度，从而控制葡萄糖流加速率，使乙醇连续平稳地生产，平均转化率为0.42g乙醇/g葡萄糖[15]。

4生物量预测及预估CER是呼吸代谢参数，与生物生长有密切联系，可用来估计生物质浓度和产物浓度。而且这种估计的是反应活性生物质浓度或产物浓度，排除

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了培养基固体成分和死细胞的干扰。KGbewonyo等人在800L反应器上,曾研究利用在线的CER数据估计前期的菌体生长量,并且取得良好的对应关系[16]。姜长洪等在50m3谷氨酸发酵罐上利用CER在线估算菌体量,并用实测数据进行校正,使估算值接近实际值,同时运用先进的过程控制策略,对谷氨酸发酵的主要参数进行控制，运行后糖酸转化率稳定提高,产酸率提高1.5%[17]。Horiuchi等在大肠杆菌分批培养中，用尾气CO2来估算细胞、葡萄糖、乙酸的浓度和比生长速率[18]。桑海峰等基于在线检测OUR，提出了一种比生长率与生物量浓度的在线连续估计方法。在诺西肽发酵应用中,估计值与实验值吻合度好[19]。固态发酵已广泛应用于生物农药、饲料等行业，但生物量的测定是面临的问题。在液态发酵容易做到的生物量离线测定，在此也因无法使菌体与培养基分离难以获得。利用CO2在线检测是比较有效的方法。张洁等人在木霉T6固态发酵产淀粉酶及产木聚糖酶中，分别研究了CO2与淀粉酶及木聚糖酶活力的关系，发现尾气中CO2浓度曲线与比淀粉酶活力曲线变化一致，且同时达到最大值；而木聚糖酶的合成与CO2含量之间存在滞后关系,CO2浓度在发酵26h达到最高值,木聚糖酶活力在39h才达峰值。说明尾气CO2含量变化可以作为固态发酵某些产物合成的研究参数[20-21]。5作为研究优化发酵工艺的手段尾气检测分析目前已经成为优化发酵工艺非常有效的手段。庄英萍等在50L发酵罐上进行梅岭霉素的发酵过程研究，通过对OUR、CER、RQ及氧传递系数等进行在线检测及相关分析，对原工艺不断调整，实现了梅岭霉素发酵的初步优化，使发酵效价从原来的150u/ml提高到520u/ml,为实现其工业化规模生产奠定了基础[22]。朱校适等在50L发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验，分别将全程温度控制在24℃、26℃、28℃。通过对发酵各阶段的CER、OUR和RQ进行对比分析,发现温度对棒状链霉菌的生长和代谢有重要影响,降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾，进而提出了发酵过程的变温控制,使克拉维酸的产量由原来3950mg/L提高到4500mg/L,增产11.5%[23]

。

在谷氨酸发酵中，控制CO2固定反应与乙醛酸循环的比率，对谷氨酸的产率影响尤为关键。杨玉岭等人试验合理控制CO2排放量,使CO2含量处于既维持菌体正常呼吸,又确保更多的CO2固定,从而提高发酵转化率。试验结果，6m3罐将CO2控制在7%~8%比不控制提高转化率1.81%

；

75m3罐控制在8%~9%，提高转化率1.4%[24]

。

6故障预判发酵过程周期长，投入大。特别是对于工业发酵，可以通过尾气在线检测参数较早发现异常，及时补救，将损失降至最低。

谌颉在阿维菌素发酵中发现非正常批次OUR的特征：OUR明显偏高，菌体快速生长阶段出现的OUR首个峰值超过对照批次约25%，且在100h前数值基本都高于正常批次20mol/m3.h

。

而非正常批次的产素速率仅为对照批次的50%

左右。这是由于呼吸强度过高,菌体初级代谢过旺,

虽用于合成的原料增加,但出于竞争关系,最后进入合成途径的反而减少,甚至因为初级代谢物的阻遏作用而完全抑制合成途径，所以造成产素速率低下。这样就可以通过前期的OUR及时发现问题，进行补救[25]。