细胞迁移和侵袭能力测定
细胞迁移和侵袭能力测定
细胞迁移性测定
①常规消化细胞，用无胎牛血清的DMEM 培养基洗细胞3次，配制细
胞悬液，调整浓度为5×105细胞/ml，于Transwell 小室（见图B）的上室中加入不同的细胞悬液（MDA-MB-231/syk 、MDA-MB-231/pcDNA3.1 和MDA-MB-231）200 μl，每组设3 个复孔。
②下室加入600 μl 含50 ml/L 胎牛血清的DMEM 培养基。
③37℃，5% CO2培养箱中孵育20~24 h。
④滤膜上的微孔允许肿瘤细胞穿越，迁移的细胞可黏附于膜下层，取出
Transwell 小室，用PBS 洗2 遍，棉拭子擦去膜上面未迁移的细胞，计数并比较穿过膜的细胞数，可在一定程度上反应肿瘤细胞的迁移能力。
⑤细胞显色：95%乙醇固定Transwell 小室上的聚碳酸酯滤膜30min，
PBS 冲洗2 次，每次3 min 苏木精染色5.5 min，自来水冲洗1~2 min 1%盐酸酒精分化数秒钟，自来水冲洗1~2 min 伊红染色80 s，自来水冲洗1~2 min 梯度乙醇脱水：70%乙醇10 s，80%乙醇10 s，90%乙醇 1 min，95%乙醇1 min，无水乙醇15 min 将滤膜撕下来，有细胞的一面向上放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂封片在400 倍高倍镜下记数，每张片子随机记录 5 个视野的迁移细胞数，将 5 个数值加起来表示迁移细胞数
细胞侵袭试验
①基质胶的准备：将冻存于-20℃冰箱的Matrigel 胶4℃放置过夜，变成液态。并预冷枪头。
②用400 μl 无胎牛血清DMEM 培养基稀释50 μl Matrigel胶原液（1:8稀释），混匀（冰上操作）。向Transwell 小室的上室中分别加入50 μl 稀释液，放入37℃培养箱中孵育4~5 h，此间经常观察，当出现“白色层”时，说明Matrigel 胶已变为固态。
③加100μl无血清培养基浸润凝固的胶，吸弃，后续步骤与迁移实验相同。通过计数穿膜细胞数来反应细胞的侵袭能力。
miR-130b对胃癌细胞BGC823迁移和侵袭能力的影响
论著 ｍｉＲ－１３０ｂ对胃癌细胞ＢＧＣ８２３迁移和侵袭能力的影响 陈华一胡海军一单爱军 ?摘要?一目的一探讨ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１３０ｂ(ｍｉＲ－１３０ｂ)对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响及作用机制? 方法一体外培养ＢＧＣ－８２３胃癌细胞?通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００试剂盒将培养基二ｍｉＲ－１３０ｂ错义链二ｍｉＲ－ １３０ｂ抑制剂?分别转染进入正常组二对照组二抑制组肿瘤细胞株中?应用３－(４?５－二甲基噻唑－２)－２?５－ 二苯基四氮唑溴盐实验法(ＭＴＴ)检测转染后胃癌细胞存活率增殖能力变化?划痕实验(ｗｏｕｎｄ－ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ)和侵袭实验(Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎｃｈａｍｂｅｒａｓｓａｙ)检测肿瘤细胞迁移二侵袭能力变化?ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验检 测肿瘤细胞迁移二侵袭相关蛋白分子(Ｓｌｕｇ二ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９(ＭＭＰ－９))表达变化情况?结果一 ＢＧＣ－８２３胃癌细胞转染后?与正常组和对照组比较?抑制组细胞增殖能力二迁移和侵袭能力均明显降低(Ｐ <０.０１)?同时?抑制组细胞迁移二侵袭能力相关蛋白表达水平较正常组和对照组降低(Ｐ<０.０５)?结论一 靶向抑制ｍｉＲ－１３０ｂ可以降低ＢＧＣ－８２３胃癌细胞的增值二迁移和侵袭能力? ?关键词?一胃癌细胞?一ｍｉＲ－１３０ｂ?一迁移?一侵袭 ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉＲ－１３０ｂｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ一ＣＨＥＮＨｕａ.一Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｅｏｐｌｅ'ｓＨｏｓｐｉｔａｌ/２ｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｓｈｅｎｚｈｅｎ?Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ?５１８０２０Ｃｈｉｎａ. ?Ａｂｓｔｒａｃｔ?一Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ一ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ－１３０ｂ(ｍｉＲ－１３０ｂ)ｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ.Ｍｅｔｈｏｄｓ一ＧａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒＢＧＣ－８２３ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏ ａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ?ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗｉｔｈｍｅｄｉｕｍ?ｍｉＲ－１３０ｂｍｉｓｓｅｎｓｅｃｈａｉｎ ａｎｄｍｉＲ－１３０ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｕｓｉｎｇＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００Ｒｅａｇｅｎｔ.Ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙ３－(４?５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ)－２?５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ (ＭＴＴ)ａｓｓａｙ.Ｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙａｗｏｕｎｄ－ｈｅａｌｉｎｇａｓｓａｙａｎｄＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎｃｈａｍｂｅｒａｓｓａｙ?ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ(ｓｌｕｇａｎｄ ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９(ＭＭＰ－９))ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ一Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒＢＧＣ－８２３ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ (Ｐ<０.０１)ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ.Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｇｒｏｕｐｃｅｌｌｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０１).Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｏｔｉｌｉｔｙｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ一Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍｉＲ－１３０ｂｃａｎｒｅｄｕｃｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒＢＧＣ－８２３ｃｅｌｌｓ. ?Ｋｅｙｗｏｒｄｓ?一Ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ?一ｍｉＲ－１３０ｂ?一Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?一Ｉｎｖａｓｉｏｎ 一一胃癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一?国际癌症研究机构公布的全球最新癌症数据显示?２０１５年全世界新增胃癌发病例数超过１３０万例?位居全部癌症发病率第５位?其中因胃癌死亡的患者约８１.９万人?高居癌症死因的第３位?而我国是全世界胃癌发病率最高的地区国家之一?约４７％的胃癌患者发生在中国?并有逐年上升的趋势[１]?据统计２０１５年我国新增胃癌发病人数约为６７.９万人?死亡４９.８万人?发病率和死亡率在全部肿瘤中均居第２位[２]?尽管随着手术二化疗二放疗及分子靶向治疗技术的发展和综合治疗应用?延长了部分胃癌患者的生存期?但是大部分胃癌患者早期没有明显的临床症状?加上我国胃癌早期筛查体系尚不完善?当得到确诊时一一基金项目:深圳市科技计划项目(ＪＣＹＪ２０１７０３０７１００３５９３９０)?深圳市卫生计生系统科研项目(ＳＺＦＺ２０１７０７３) 一一作者单位:５１８０２０广东深圳?暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院急诊科(陈华二单爱军)?胃肠外科(胡海军)往往已是进展期或晚期?对于晚期无法切除二胃癌 伴远处转移以及术后复发患者?化疗(联合放疗二靶 向二生物二免疫等综合治疗)是其主要治疗手段?但是 效果有限?中位生存期仅仅只有４~１２个月?５年生 存率仅为１０~２０％?尤其是伴有远处转移的晚期胃癌 患者?预后非常差[３]?因此?需要进一步深入研究胃癌的发病机制和探索新的治疗手段? 有研究发现?相对于癌旁正常组织?原发性胃癌 患者肿瘤组织中ｍｉＲ－１３０ｂ表达水平异常升高?其对 胃癌细胞的生存和增殖能力有促进作用[４]?而我们之前的研究发现?靶向抑制ｍｉＲ－１３０ｂ可以显著减少ＢＧＣ－８２３胃癌细胞的增殖能力[５]?但是?ｍｉＲ－１３０ｂ在胃癌细胞迁移侵袭中的作用?迄今为止尚未有报道?尤其重要的是肿瘤细胞的迁移侵袭能力和肿瘤的转移复发有着密切关系?是导致肿瘤患者的５年生存率降低的主要原因之一?本实验研究通过靶向抑制ｍｉＲ－１３０ｂ的表达?观察并探讨其在胃癌细胞迁移侵袭中的作用及机制?
细胞迁移侵袭实验操作步骤
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
实验中细胞铺板的方法
于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板 [实验步骤] 1、准备工作用 75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。 2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。 3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37°消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含5%血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min. 5、弃上清。用PBS 3ml 洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗2次，离心1000rpm,3min.弃上清。 6、配细胞稀释液（BSA 终浓度为0.1%）每种细胞需3ml稀释液,共6个样品，所以配20ml稀释液(无血培20ml+10%BSA 200ul.) 7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。 8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次，算均值。（8个大格总数/8=数值*104） 9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。 普通的细胞计数及铺板(免疫荧光，WB等不需定量) [实验步骤] 1、准备工作用75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。2）将 培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显 微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。 2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。 3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37°消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多，则需稀释。 5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血清的新鲜培养基，混匀。 6、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次，算均值。 7 、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血清的新鲜 培养基补。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
Transwell侵袭实验全面总结
Transwell侵袭实验全面总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要
可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养 液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
细胞迁移划痕实验
细胞迁移实验技术 —划痕实验 一、基本原理 细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。 二、操作步骤 1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2．在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。 3．第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。 4．PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5．放入37℃5%CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。 6.统计方法：使用ImageJ软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。
三、注意事项： 1.在用PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。 3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
细胞侵袭实验(transwell)
Cell Invasion Assay (transwell) 细胞侵袭实验 1. Put transwell chambers in 24-well plate. 2 .Prepare Matrigel(dilute to desired concentration using serum-free medium) 3. Pipet to mix well. Add 100 μl Matrigel in chamber. 4. Incubate at 37℃overnight for gelling. 5. Add 750 μl culture medium (with serum) in lower chamber. 6. Place 200 μl cell (2.5*10^5/ml in serum-free medium) in the chamber. 7. Place transwell into lower chamber. Incubate at 37℃for 12-16 hours. 8. Remove medium and wash twice by PBS. 9. Fix cells by formaldehyde (3.7% in PBS).Fix cells at room temperature for 2 minutes. 10. Remove formaldehyde and wash twice by PBS. 11. Permeabilize cells by 100% methanol. Permeabilization at room temperature for 20 minutes. 12. Remove methanol and wash twice by PBS. 13. Giemsa stain at room temperature for 15 minutes. 14. Remove Giemsa stain and wash twice by PBS. 15. Scrape off non-invasive cells with cotton swabs. 16. Count invasive cells under a light microscope.
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(cell migration assay) 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径与经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤: 1材料准备: 可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster与Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM与1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1%(g/ml)PBS结晶紫) 2步骤与流程 2、1基质胶铺板: 用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2、2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1－2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2、3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基,特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2、4结果统计 直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。 0、1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (1)Transwell chamber: 24-well, 8、0-μm pore membranes (Corning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10％血清培养基,PBS,0、02％EDTA
transwell实验原理与步骤
一、Tran swell 小室制备 1. 无基质胶Tran swell 小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。 另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Tran swell 小室制备 Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基 重悬。调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多 过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点， 所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。 个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证 对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100 —200 加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小 室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200卩l。 ②24孔板下室一般加入500 □含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同 要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一 旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出 现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12 —48 h (主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Tran swell , 处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组 细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可 能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达， 到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点 研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞 在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成 团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培 养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1—2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
细胞运动及迁移检测方法的比较与选择
细胞运动及迁移检测方法的比较与选择关键词：细胞仪器分析仪试剂标准物质北京标准物质网 一.transwell试验 transwell技术是检测细胞运动能力的经典方法，由于其原理简单、操作相对简便，该法目前已被广泛用于检测不同类型细胞的运动能力。内室底部的薄膜是整个实验装置的核心部分，待测细胞的直径决定了薄膜孔径的选择。通常情况下，薄膜的孔径应略小于细胞的直径以防止细胞直接漏入到外室。transwell试验对细胞运动和迁移能力的评价主要依赖于对转移至底膜外侧细胞的染色和计数。甲紫是transwell试验中常用的细胞染料，在染色前需要使用棉签将底膜内侧的细胞拭去以免残余的细胞着色后影响最终的细胞计数和统计。然而，通常使用棉签很难将膜内侧的细胞全部拭去，因此这是制约本试验精确度的主要因素之一。同时，甲紫染色后的细胞计数常由操作者在显微镜下完成，导致实验的最终结果缺乏稳定性和准确度。此外，该方法只适宜于终点检测法，难以实时检测细胞的运动变化。 目前已有改良的方法或实验装置可弥补以上几点不足。如在对发生迁移的细胞进行定量分析时，可以荧光染料将细胞着色，而后将底膜外侧的细胞经处理(如胰酶等)转移至计数板内，使用电子计数器对细胞总数进行定量分析。又如Roche 和AceaBio公司联合开发的xcELLigenee系统，将经典的transwell实验装置与微电子阻抗感应系统整合，实现了对细胞运动的实时监测。微电子阻抗系统所检测到的微电阻与细胞的数量，伸展状态，贴壁紧密程度等多项生理指标密切相
关，将其整合于内室底部微孔膜的下表面上，当细胞迁移至微孔膜底面时，则可引起细胞微电阻的升高，通过记录微电阻的变化可精确的反映细胞的运动状态。该系统提高了传统transwell的精确度，同时可以获取细胞运动的实时动态数据。然而，由于该系统需要借助于特殊的仪器设备，且成本相对较高，因此常应用于大规模及高通量的筛选工作。 二、二维平面内细胞运动的检测方法 1.划痕试验原理简单，操作便捷，不需要借助特殊的实验仪器，适用于任何具有贴壁特性的细胞，因此在细胞运动的检测中应用广泛。本方法中，细胞运动的能力反映为划痕宽度的变化，通常情况下划痕由实验操作者以移液器的吸管端划出，导致划痕的宽度并不均一，因此在一定程度上影响了划痕愈合度的评估。同时，有观点认为超过24小时的检测并不能排除细胞增殖对划痕愈合的影响，尽管在实验过程中通过降低培养基的血清浓度可在一定程度上削弱细胞增殖的影响，但划痕试验中观察时间点的设置仍宜控制在24小时以内。此外，在人为制造划痕时可对周围细胞产生一定的机械损伤，可能会影响划痕边界周围细胞的活性和运动潜能。同时，脱落的部分细胞可能在培养板静置后重新在无细胞区域定植和迁移，从而制造划痕愈合的假象。 目前，Applied BioPhysics公司推出了基于微电阻感应系统的划痕试验装置。借助于整合在细胞培养板l的电极，通过电流的脉冲刺激可产生宽度恒定均一的无细胞区域。同时通过检测无细胞区域的微电阻的增加，可以判断细胞向内迁移的数量。这种改良后的装置实现了实验条件的标准化和实验结果统计的精准化，但其对设备器材的要求和成本均相对较高。
细胞迁移侵袭试验技术
五、迁移实验（cell migration assay） 实验材料 （1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning) （2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养基，PBS，0.02％EDTA （3）固定液：甲醇 （4）染色液：Giemsa染液 （5）封片剂：中性树胶 （6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片 操作步骤 （1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育； （2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml；（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时； （4）用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟； （5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中，室温染色15－30分钟； （6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞； （7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；（8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。 注意事项 （1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径； （2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well，迁移时间12≈36小时；（3）由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）；（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具体可查阅相关文献；
(完整版)Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
细胞增殖迁移和侵袭的影响作用研究
中国肿瘤临床2010年第37卷第3 期 转化生长因子-β和干扰素-γ对黑色素瘤细胞 增殖迁移和侵袭的影响作用研究* 摘要目的：观察转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素-γ（IFN-γ）对黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法：体外培养黑色素瘤细胞，待细胞长到80%融合度时，加入TGF-β（浓度为5ng/mL）和IFN-γ（浓度为10ng/mL）因子，将黑色素瘤细胞分为对照组、TGF-β组、IFN-γ组和TGF-β+IFN-γ组，然后各组分别采用磺酰罗丹明B（SRB）增殖测定法观察黑色素瘤细胞培养后8h、16h、24h、32h、40h和48h时间点的增殖情况，于540nm吸光度下比 色读取吸光度（A540）来表示细胞的增殖变化。采用200μL吸头对各组细胞的表面进行划痕处理，随后于12h观察划痕之间距离（即代表肿瘤细胞迁移的能力）的变化。采用测Transwell系统孔外膜上细胞的595nm吸光度（A595）来表示肿瘤细胞的侵袭能力。采用明胶酶谱法观察各组肿瘤细胞的MMP-2、MMP-9活性水平，用图像分析软件测定聚丙烯酰胺凝胶中MMP-2、MMP-9的条带灰度（代表MMPs的活性水平）。结果：TGF-β可以增强黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05），IFN-γ则抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05），二者同时处理则对黑色素瘤细胞的影响作用微弱或消失（P>0.05）。结论：体外实验中，TGF-β可以干扰IFN-γ对黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用，本研究可为炎症和肿瘤的相互关系研究奠定实验基础。 关键词黑色素瘤转化生长因子-β干扰素-γ增殖迁移侵袭 doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2010.03.004 Effects of TGF-βand IFN-γon the Proliferation,Migration and Invasion of Melanoma Cells DONG Xueyi,GU Qiang,SUN Tao,ZHAO Nan,ZHAO Xiulan,NI Chunsheng,CHE Na,SUN Baocun Corresponding author:SUN Baocun,E-mail:sunbaocun@https://www.360docs.net/doc/fa17350260.html, 1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin300070,China 2Department of Pathology,Cancer Institute and Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin300060,China Grant support:National Natural Science Foundation of China(30830049)and International Cooperation of China and Sweden(09ZCZDSF04400) Abstract Objective:To investigate the influence of TGF-βand IFN-γon the proliferation,migration and invasion of melanoma cells.Methods:Melanoma cells were cultured in vitro.When tumor cells were confluent about80%degree,cytokines were added into cell culture media.The concentration of TGF-βand IFN-γwas 5ng/mL and10ng/mL,respectively.Melanoma cells were divided into free-cytokine group,TGF-βgroup, IFN-γgroup,TGF-βand IFN-γgroup.Tumor cells in each group were then incubated for8h,16h,24h,32h, 40h and48h,respectively.After incubation,fixing and staining with SRB,the optical densities and percentage viability were then determined by absorption at540nm(A540).The scarification of tumor cells in each group on the surface was created by a200μL pipette tube.The motility of tumor cells in each group was assessed by measuring the distance between scarifications.The speed of the scuffing closure was monitored after12h. The invasive ability of melanoma cells was observed by transwell cultivation.The tumor cells that invaded through the Matrigel and adhered to the bottom of the outside membrane were determined by absorption at 595nm(A595).Gelatin zymography assay was used to examine the levels of matrix metalloproteinases-2 (MMP-2)and matrix metalloproteinases-9(MMP-9)activity when the tumor cells were treated with cytokines after24h.MMP-2and MMP-9activity was demonstrated by gradation in the sodium dodecyl sulfate polyacryl-amide gel electrophoresis(SDS-PAGE)gelatin.MMP-2and MMP-9activity was determined by Image analy- 本文课题受国家自然科学基金（编号：30830049）和中瑞国际合作项目基金资助（编号：09ZCZDSF04400） ①天津医科大学在读研究生②天津医科大学附属肿瘤医院 通讯作者：孙保存sunbaocun@https://www.360docs.net/doc/fa17350260.html,