长链非编码RNA在肾移植急性排斥反应早期诊断的作用要点

史堡墨宣整焦盘查！！！！生！旦箜！！鲞筮！翅堡丛！』Ｑ！ｇ垫！！！！！Ｐ！塑！！丛！！尘！！！！！ｙ！！：！！！盟Ｑ：ｊ长链非编码ＲＮＡ在肾移植急性排斥反应早期诊断的作用唐良友卢一平随着多种新型高效、低毒免疫抑制剂在ｌ临床中使用，肾移植后急性排斥（ＡＲ）的发生率已经大大降低，但ＡＲ仍是导致早期移植物丢失及慢性移植物功能丧失的主要原因［１。２］。移植肾活检虽然仍是ＡＲ诊断的金标准，但因其为有创检查故在ｌ临床中的应用受到限制。因此，在过去数十年中，众多研究者不断探讨ＡＲ诊断的新方法和指标，包括蛋白组学和基因组学。但是，不论从最初热衷于蛋白编码基因到近年的微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）研究，都未能达到上述目的。近年来，随着长链非编码ＲＮＡ（１０ｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ＩｎｅＲＮＡ）的发现及其在免疫调节中的巨大潜力，日益增多的研究发现，ＩｎｅＲＮＡ有可能成为肾移植后ＡＲ早期诊断的指标。本文就近年来ｌｎｃＲＮＡ在肾移植领域的研究进展做如下综述。一、ＩｎｅＲＮＡ的定义、分类、功能及作用机制１．ＩｎｃＲＮＡ的定义及分类：人类基因组计划成果显示，在人类基因组３０亿个碱基对序列中仅有１．５％的核酸序列用于蛋白质编码，而９８．５％的基因不表达蛋白质，这些不表达蛋白质的ＲＮＡ被称为非编码ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）ｃ３｜。ｎｃＲＮＡ曾被认为是基因组转录的“废弃物”，没有生物学功能而未引起研究者的关注。直到２００７年，Ｒｉｎｎ等［４］发现了２．２ｋｂ长的功能性ＩｎｃＲＮＡ：ＨＯＴＡＩＲ。ＨＯＴＡＩＲ可以与多梳蛋白抑制复合体２（ＰｏｌｙｃｏｍｂＲｅｐｒｅｓｓｉｖｅＣｏｍｐｌｅｘ２，ＰＲＣ２）相互作用，修饰染色质，抑制ＨＯＸ基因的转录，并进而调节生物体的生长发育。这一发现引起了研究人员的浓厚兴趣，并迅速致力于对ｎｅＲＮＡ的研究。近年来的研究发现了大量具有重要生理病理功能的长链非编码ＲＮＡ基因，使得人们对ｌｎｃＲＮＡ的认识发生了质的飞越。２００２年Ｏｋａｚａｋｉ首次提出，ＩｎｅＲＮＡ是指长度≥２００个核苷酸，并且具有基因表达调节功能但不能编码产生蛋白质的一类ＲＮＡ［５【。这种说法后来得到世界的公认，即把ｎｃＲＮＡ根据其转录本的大小粗略地分为小非编码ＲＮＡ（如ｍｉｃｒｏＲＮＡ，＜２００ｎｔ）和长链非编码ＲＮＡ（１０ｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎｃＲＮＡ，＞／２００ｎｔ）。后来，为进一步区分ｎｃＲＮＡ的功能将其分为持家非编码ＲＮＡ（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ）和调控性非编码ＲＮＡＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—１７８５．２０１６．０３．０１３基金项目：四川省科技厅基金（２０１４ＪＹＯｌ３８）；成都市科技局基金（２０１４～ＨＭ０１～００３０１～ＳＦ）作者单位：６１００４１成都．ＮＪｒｌ大学华西医院泌尿外科通信作者：卢一平，Ｅｍａｉｌ：ｙｉｐｉｎｇｌｕ＠１６３．ｃｏｍ・１８３・・综述・（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｏｎｅｏｄｉｎｇＲＮＡｓ）［６］，ＩｎｃＲＮＡ属于后者。根据ＩｎｃＲＮＡ在基因组中的不同位置又可分为：正义ＩｎｃＲＮＡ（ｓｅｎｓｅｌｎｃＲＮＡ）、反义ｌｎｃＲＮＡ（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅｌｎｃＲＮＡ）、双向

ＩｎｅＲＮＡ（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｎｃＲＮＡ）、基因间ＩｎｃＲＮＡ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｌｎｅＲＮＡ）、基因内ｌｎｃＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎｉｃｌｎｃＲＮＡ）５种类型［６］。２．１ｎｃＲＮＡ的功能及作用机制：继发现ｍｉｃｒｏＲＮＡ在炎症及自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等的发病机制中对众多基因及信号通路具有显著的调节作用之后，近年来另一大类非编码ＲＮＡ即ｌｎｃＲＮＡ在分子生物学领域的效应亦受到极大关注。越来越多的研究发现，ＩｎｃＲＮＡ参与了多种不同的生物学过程，如表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等，并且在众多生命活动中发挥重要作用，显示了其强大的调节功能。ＩｎｃＲＮＡ类型的多样性和核苷酸长度决定了其功能的多样性。研究者推测ｌｎｃＲＮＡ的功能可能包括有以下几方面Ｌ７ｊ：（１）在编码蛋白基因的上游启动子区进行转录，从而干扰邻近蛋白编码基因的表达（如酵母ＳＥＲ３基因）；（２）抑制ＲＮＡ聚合酶Ⅱ或介导染色质重构和组蛋白修饰，从而影响基因表达；（３）ＩｎｃＲＮＡ与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）的剪切，进而产生不同的剪切形式；（４）ＩｎｃＲＮＡ与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Ｄｉｃｅｒ酶作用下产生内源性小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），进而调控基因表达水平；（５）ｌｎｃＲＮＡ与特定蛋白质相结合并调节相应蛋白的活性；（６）作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；（７）与特定蛋白相结合，从而改变该蛋白的胞质定位；（８）可作为小分子ＲＮＡ（如ｍｉｃｒｏＲＮＡ）的前体分子。研究表明Ｌ８ｊ，ｌｎｃＲＮＡ发挥生物学功能的主要机制包括：基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、ｍＲＮＡ降解和翻译调控等，从而在表观遗传、转录水平以及转录后水平发挥其调节效应。３．１ｎｃＲＮＡ在免疫炎症中的调控作用：器官移植后抗原递呈细胞被激活，将异体抗原递呈给宿主Ｔ淋巴细胞，从而启动免疫应答。树突状细胞（Ｄｃ）是人体免疫系统内功能最强的抗原递呈细胞，其能灵敏地感知与识别入侵的外源性病原体，快速启动免疫应答，从而清除病原体。近来发现，ＩｎｃＲＮＡ在免疫细胞的增殖及活化中起着重要的作用，包括天然免疫及获得性免疫。２００９年，Ｇｕｔｔｍａ等［９１首先证实了ｌｎｃＲＮＡ在天然免疫中的作用。他们用ｔｏｌｌ样受体４（ＴＬＲ－４）特异受体激动剂刺

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激小鼠骨髓ＣＤｌｌＣ＋树突状细胞后发现，有２０条ＩｎｅＲＮＡ的表达明显上调，而８００Ａ被诱导上调的ｌｎｃＲＮＡ都位于核因子ＫＢ（ＮＦ＿ＫＢ）信号传输丛。其中变化最明显的是位于其中一个ＪｎｃＩ州Ａ下游５１个碱基的蛋白编码基因ＣＯＸ一２

（Ｐｔｇｓ２），它是一个关键的炎症调节因子，通过ＴＬＲ－４刺激，直接由ＮＦ－ＫＢ诱导。张飞飞等［１０］发现，ＩｎｃＲＮＡＮＥＡＴｌ可通过调节ＴＬＲ－２信号通路，在先天免疫反应中发挥重要作用。Ｌｉ等［１１］发现，ｌｎｅｌ９９２为许多免疫反应基因表达所必需，包括细胞因子、ＴＮＦ＿值转录与转录后调控因子。Ｋｒａｗｅｚｙｋ等［１２］发现，细菌脂多糖ＬＰＳ刺激人乳腺上皮细胞和单核细胞／巨噬细胞后，Ｃｏ也转录起始点上游的ｌｎｃＲＮＡ、ＰＡＣＥＲ表达上调，促进Ｃｏ）（２启动子区ＮＦ－ＪｃＢ信号通路活化，从而促进炎症反应。２０１４年Ｗａｎｇ等［１３］关于ｌｎｃＲＮＡ在ＤＣ分化发育与功能调控中作用的研究成果在Ｓｃｉｅｎｃｅ上发表。他们首先使用基因芯片、深度测序技术及定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）在人外周血单核细胞诱导分化的１３（３中鉴别并验证了特异性表达的ｌｎｃＲＮＡ，并将其命名为ｌｎｃ－ＤＣ。在探索ｌｎｃ－ＤＣ在ＤＣ分化过程中的作用时发现，将人ＤＣ中的ｌｎｃ－ＤＣ沉默后，ＤＣ功能相关基因下调；１３（３中多种激活Ｔ淋巴细胞的关键蛋白也出现下调。该研究还发现，在鼠骨髓细胞内沉默１ｎｃ—ＤＣ同源基因也会破坏鼠ＤＣ的分化。上述结果说明，ｌｎｃ－ＤＣ的缺失会改变ＤＣ的分化趋势，进而影响ＤＣ的功能。研究者在探讨ｌｎｅ－ＤＣ实现其调控ＩＸ；分化的分子机制发现，ｌｎｅ－ＤＣ可以阻止磷酸酶ＳＨＰｌ与ＳＴＡＴ３的结合，保护Ｙ７０５磷酸化状态，增强ＤＣ中的ＳＴＡＴ３信号通路，实现其维持与促进人１３（２发育成熟和激活Ｔ淋巴细胞免疫应答的能力，最终对ＤＣ分化发育、抗原递呈与免疫激活功能起到至关重要的调节作用。２００９年Ｐａｎｇ等［１４］发现，ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞表达数百种ｌｎｃＲＮＡ，大多数都具有特异性，并随着淋巴细胞的分化及活化而动态变化。大量ｎｃＲＮＡ的表达基因与免疫相关蛋白编码基因的结构关系说明了其可能的作用机制。由ＣＤ８＋Ｔ细胞表达的大多数ＩｎｃＲＮＡ与ｍｉｅｒｏＲＮＡ和ｓｉＲＮＡ相互重叠，提示ＩｎｅＲＮＡ可能通过被加工成更小的分子而发挥作用。研究还发现，这些ｌｎｃＲＮＡ具有进化保守性，复杂的二级结构具有调节启动子的作用，提示它们的某种功能可能在获得性免疫中发挥关键性调控作用。Ｈｕ等［１５］利用高通量检测技术检测了从原始Ｔ细胞到分化为终末外周Ｔ淋巴细胞亚群过程中４２种不同Ｔ细胞亚群的互补脱氧核糖核酸（ｅＤＮＡ）序列，发现了１５２４个产生ＩｎｃＲＮＡ的基因区，并且随着Ｔ细胞的发育分化ｌｎｃＲＮＡ的表达模式处于动态变化之中，具有明显的细胞特异性和阶段特异性。这些ＩｎｃＲＮＡ的基因区位于具有显著免疫调节功能的编码基因附近，提示这些ｌｎｃＲＮＡ基因与蛋白编码基因可能共表达。该研究还发现，这些基因区受Ｔ淋巴细胞的关键转录因子（Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＳＴＡＴ４和趼ＡＴ６）的调节，ｌｎｃＲ—Ｃｃｒ２—５７ＡＳ与ＧＡＴＡ＿３都是Ｔ．２细胞特异基因表达及迁徙的关键调节因子。此外，Ｚｈａｏ等［１６］研究证实，ＩｎｃＲＮＡＨＵＬＣ通过直接下调ｐ１８来调节调节性Ｔ淋巴细胞（Ｔｒｅｇ细胞）的功能。二、ｌｎｃＩⅢＡ与肾移植一直以来ＡＲ都被认为是导致慢性移植肾病最重要的免疫因素，也是造成术后１年移植物丢失最常见原因ｆ１７－２０］。因此，寻找无创、灵敏、高效的诊断ＡＲ的新方法和指标一直是移学家努力的方向和目标。Ｆｌｅｃｈｎｅｒ等［２妇于２００４年利用基因芯片技术研究了外周血淋巴细胞与移植肾活检组织内ＤＮＡ水平的相关性后发现，肾移植后不同状态，包括无ＡＲ且功能正常、发生ＡＲ以及无ＡＲ但功能受损患者的外周血与移植肾活检组织中ＤＮＡ水平的变化均有明显的相关性。据此他们认为，可利用一种无创的监测肾移植患者分子变化的检测手段来预测移植肾发生ＡＲ的风险。但是到目前为止，尚无早期诊断肾移植后ＡＲ的良好指标。近年来，ｌｎｃＲＮＡ已成为研究热点。除了在肿瘤方面已取得诸多显著进展之外，近来学者们也对ＩｎｃＲＮＡ在器官移植时的表达变化进行了研究。Ｌｉｕ等［２２］结扎Ｃ５７Ｂｌ／６小鼠冠状动脉左前降支建立心肌缺血一再灌注模型，采用微阵列检测ＩｎｃＲＮＡ表达谱变化发现，有６４个ｌｎｃＲＮＡ上调和８７个ＩｎｃＲＮＡ下调。进一步对ＩｎｃＲＮＡ靶基因相关途径分析显示，ＩｎｃＲＮＡ作用的靶基因主要参与细胞因子一细胞因子受体相互作用趋化因子信号传导通路，还参与核苷酸寡聚化结构域样受体信号转导通路等，这些传导通路均与心肌缺血／再灌注损伤密切相关。Ｃｈｅｎ等心３］对Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠肝脏缺血再灌注研究发现，利用ＲＮＡ干扰技术沉默ＩｎｃＲＮＡ：ＡＫｌ３９３２８后，可通过活化Ａｋｔ信号通路并抑制ＮＦ－出信号