曲霉检测方法
黄曲霉素的检测方法及预防措施
２０１９．２０科学技术创新黄曲霉素的检测方法及预防措施陈靖文（四川大学华西公共卫生学院，四川成都610061）黄曲霉素所引起的污染事件频频出现，食品安全已成为当今社会上消费者们关心的热点问题，各类有关部门对食品安全及人体健康问题越发重视。
因此各国对食品及农产品内黄曲霉素含量进行限量设定。
在我国制定出了严格规范的食品中黄曲霉素含量限量标准（ＧＢ－２７６１－２０１１）。
１黄曲霉素的基本概述黄曲霉素（ａｆｌａｔｏｘｉｎ，ＡＦＴ）为毒性极强的剧毒物质，是一种由黄曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）、寄生曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）和集峰曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｏｍｉｕｓ）通过聚酮方法产生的次生代谢产物。
已知种类包括：Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ２ａ、Ｍ１、Ｍ２、Ｐ１等十几种。
其中Ｂ１是毒性为最强，根据研究结果中实验数据显示黄曲霉素Ｂ１毒性为氰化钾毒性的１０倍，相当于砒霜毒性的６８倍，其致癌性是奶油黄的９００倍，二甲基亚硝酸铵的７５倍，苯并芘的４０００倍，并且在天然食物中最为常见。
黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，世界卫生组织（ＷＨＯ）划定为１类致癌物。
黄曲霉素含量标准在３０～５０ｍｇ／ｋｇ为低毒，而５０～１００ｍｇ／ｋｇ为中毒，１００～１０００ｍｇ／ｋｇ为高毒，１０００ｍｇ／ｋｇ以上为极毒。
２黄曲霉素的检测方法２．１薄层分析法（ＴＬＣ）薄层分析法，该方法是测黄曲霉毒素最为经典的方法，在早前的检测中最为常见———是我国黄曲霉素检测的国标方法之一，并且中外检测机构至今仍使用这种方法进行检测。
该方法原理为：在一定条件下，黄曲霉素可以被符合条件并适宜用量的萃取剂从各种不同试样中萃取出来，通过柱层析将被萃取分离出来的黄曲霉素进行净化，在薄板上展开从而进行分离并分析。
利用试样的荧光斑点颜色强弱程度与试样含量呈线性正相关，可与标准品中荧光斑点颜色强弱进行比较从而确定出试样中黄曲霉素的含量（可利用双向展开对组分复杂的试样进行分析），从而提高灵敏度。
花生油黄曲霉毒素检测标准
花生油黄曲霉毒素检测标准花生油黄曲霉毒素检测标准引言花生油是人们日常生活中常用的食用油之一，然而，由于一些不良生产过程和储存条件，花生油中可能会存在黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的有害物质，对人体健康有一定的危害。
因此，为了保障消费者的健康，需要制定相应的黄曲霉毒素检测标准，以确保花生油的质量和安全性。
一、检测物质黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。
在花生油中的主要检测物质为黄曲霉毒素B1 和黄曲霉毒素B2。
二、检测方法1. 样品准备：从市场上购买花生油样品，按照一定比例随机选择样品。
将样品放入密封袋中，保存在低温环境下，以避免黄曲霉菌生长。
2. 提取：将样品取出，进行样品提取。
将样品与适量的溶剂混合，经过一定的提取过程，获得提取液。
3. 净化：利用净化柱或其他净化方法，对提取液进行净化，去除样品中的杂质和干扰物质。
4. 分离和检测：利用色谱柱进行样品的分离，然后使用高效液相色谱-荧光检测仪器对黄曲霉毒素进行定性和定量检测。
5. 数据处理：将检测得到的数据进行计算和对比，得出样品中黄曲霉毒素的含量。
三、检测标准为了确保花生油的质量和安全性，制定以下花生油黄曲霉毒素检测标准：1. 黄曲霉毒素B1 的限量标准为10μg/kg。
2. 黄曲霉毒素B2 的限量标准为5μg/kg。
3. 样品中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的含量不能同时超过15μg/kg。
4. 若花生油中检测到黄曲霉毒素超过上述限量标准，视为不合格产品，不能上市销售。
5. 检测结果需进行备案并向相关部门报告，以便监管部门对不合格产品进行处理和追溯。
四、风险分析与控制1. 建立健全的花生油生产和储存规范，严格控制原材料的质量，避免含有黄曲霉菌的花生被投入生产。
2. 加强对花生油生产过程的监控和管理，确保生产环境的卫生和安全。
3. 售卖前，对花生油进行严格的质量检测，确保产品符合黄曲霉毒素检测标准。
黄曲霉M1酶联免疫法检测方法
黄曲霉毒素M1酶联免疫测试1．概述REA GEN ™黄曲霉毒素M1酶联免疫反应测试盒可用于检测乳酪，牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1的残留。
黄曲霉毒素M1是黄曲霉素素B1羟基化的产物。
黄曲霉毒素已被确认是最常见的致癌物。
该试剂盒特点包括：样品无需前处理提取，可直接用于检测。
应用于牛奶检测时有高灵敏度（0.005ng/g或ppb）低检测限（0.005ng/g或ppb）。
高重现性。
2．试剂盒原理REA GEN ™黄曲霉毒素M1酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，相关的抗体已经包被于微孔板上。
药物分析时，样品加入微孔孵育，洗板后加入酶标记物，若样品残留有黄曲霉M1就会竞争包被抗体，抑制HRP酶标与包被抗体结合，加入TMB后显色反应，颜色显色强度与样品中靶毒素的含量成反比。
3.试剂盒组成部分和储存内容物规格保存条件黄曲霉毒素M1包被板(Aflatoxin M1 Plate) 96孔板（12×8 孔）2-8℃黄曲霉毒素M1标准品(Standards)：0ng/ml阴性质控(Negative control)0.005ng/mL0.015ng/mL0.03 ng/mL0.09ng/mL0.27ng/mL回收用10ng/ml(Spiking，可选) 1.8mL1.8mL1.8mL1.8mL1.8mL1.8mL1.8ml2-8℃HRP-酶标记物(HRP-Conjugate) 12mL2-8℃20×浓缩洗液(Wash Solution) 28mL终止液(Stop Buffer) 14mLTMB底物(TMB Substrate) 12mL10x PBS缓冲液（可选）25mL10x 牛奶提取液（可选）5mL本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。
如果一个月内不使用试剂盒，黄霉素毒素M1标准品和HRP-酶标应置于-20℃或者冷冻保藏。
4.样品检测下限检测物质检测下限（ng/g）牛奶0.005奶粉0.005（按1:10稀释成液体奶）乳酪0.05酸奶0.015.交叉反应数据药物交叉反应率（%）黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1) 100黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1) 46黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2) 35黄曲霉毒素M2(Aflatoxin M2) 29黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1) 27黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2) 66．未提供的设备或材料1)酶标仪(450nm)2)微量加样器(10、20、100和1000μL各一支)3)多道枪：50-300μL4)黄曲霉M1清洗试剂（可选）7.注意事项实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。
黄曲霉素的检测方法--王慧
• 中药材的采收、加工、销售、直到使用需要一段相当长 的时间，如果储存环境不合理，会造成药材或饮片发霉变 质，特别是含油脂比较丰富的种子类药材，更容易发生变 质，产生大量黄曲霉素。
• 2010版《中国药典》，修改增加了很多项目，尤其是增 加了安全性控制指标，其中首次增加黄曲霉素控制。
•
在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、
• 黄曲霉毒主要存在于发霉的粮、油、花生中，它是黄
曲霉及寄生曲霉的代谢产物，毒性极强，可致肝癌，由于 黄曲霉素是一种热稳定的化学物质，所以在烹调过程中不 易破坏。预防措施主要是防霉。但如果食品已霉变产毒，则应
采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾轧法及水 搓法；植物油可用加碱去毒法等。
• 目前已分离鉴定出18种，它们的化学结构类似，都是 二G等砒2霜氢，以的B呋及16为8喃由倍毒香,B被性1豆、列及B素入2在致的严体癌管衍内的性生特经最物剧过强，毒羟1M0G1倍1、、、M2
难溶于水易溶于油、甲 醇、丙酮、氯仿等有机溶 剂
免疫亲和层析净化荧光光度法IAC/SFB
• 黄曲霉毒素速测仪 —农业部油料及制品质检中心中国农业科学院油料作物 研究所根据 GB/T18979-2003研制成042NYART型黄曲霉毒素速测仪 , 本仪 器采用的是免疫亲和层析净化荧光光度法
• 该方法的原理是利用各种黄曲霉素的荧光特性差异用荧光光度计测定试样 中黄曲霉素的含量。
ELISA法具有特异性强、干扰小，样品的预处理简便， 且快速、灵敏、高效等特点，而且回收率高，提取方法简 单，可以进行定性和定量测定，并且对设备装置的投资比 HPLC降低了许多，大大节约了测试的成本，因而ELISA已 广泛用于食品中黄曲霉毒素的测定。
重复性差，假阳性概率较 高,需要配置专门的酶标仪, 且对一些富含盐和脂肪的试 样需进行额外的处理.
玉米中的黄曲霉毒素及检测方法研究
玉米中的黄曲霉毒素及检测方法研究玉米是世界上一种重要的粮食作物，也是非常重要的人类和动物的饲料来源。
玉米中常常存在一种称为黄曲霉毒素的有害物质。
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌产生的一类毒素，主要包括黄曲霉酸（OTA）、赭曲霉酮（ZON）、黄曲霉素（FB1、FB2、FB3）等。
黄曲霉毒素对人体和动物有很大的危害，可以引起急性或慢性毒性效应。
长期暴露于黄曲霉毒素会导致免疫抑制、肝脏和肾脏损伤、生殖系统异常等。
对玉米中的黄曲霉毒素进行检测是非常必要的。
目前，对玉米中黄曲霉毒素的检测方法主要包括物理方法、化学方法和生物学方法等。
物理方法主要通过目测或显微镜观察黄曲霉菌的生长情况来判断玉米中是否存在黄曲霉毒素。
化学方法则是通过色谱仪、质谱仪等仪器对黄曲霉毒素进行定量分析。
生物学方法则是利用细胞或动物模型来评估黄曲霉毒素的毒性。
对于黄曲霉毒素的检测，有一些专门的试剂盒可以用于快速检测。
这些试剂盒通常基于抗体-抗原反应原理，将黄曲霉毒素与试剂盒中的抗体反应产生可见光。
通过检测可见光的强度，可以评估玉米中黄曲霉毒素的浓度。
目前存在一些问题。
由于黄曲霉毒素种类繁多，目前常用的试剂盒只能检测部分种类的黄曲霉毒素，对于其他种类黄曲霉毒素的检测还需要进一步研发。
试剂盒方法通常具有一定的误差，需要进行进一步的验证。
我们需要不断研究新的检测方法，提高检测的准确性和可靠性。
一种可能的解决方案是开发新的化学分析方法，如液相色谱-质谱联用技术，可以更准确地检测出不同种类的黄曲霉毒素。
另一种可能的解决方案是研发新的生物学方法，如基因诊断技术，可以通过检测黄曲霉菌的特定基因来评估玉米中黄曲霉毒素的存在。
玉米中的黄曲霉毒素对人体和动物健康有很大的危害，因此对其进行准确的检测十分重要。
目前的检测方法有一定的局限性，需要进一步研究和改进。
相信随着科技的进步，我们将能够开发出更准确、高效的方法来检测玉米中的黄曲霉毒素，保障食品安全和动物健康。
黄曲霉素测试方法
黄曲霉素测试方法
黄曲霉素测试方法有以下几种：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：使用高效液相色谱仪分离和定量黄曲霉素。
首先将样品提取，然后经过样品处理和净化后，采用逆相或正相高效液相色谱柱进行分离，最后利用紫外检测器检测和定量黄曲霉素的浓度。
2. 液相色谱-质谱联用法（LC-MS）：将黄曲霉素样品经过提取和净化，然后使用液相色谱-质谱联用仪器进行分析和鉴定。
该方法可以同时检测和定量黄曲霉素及其代谢物。
3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：利用黄曲霉素特异性抗体与黄曲霉素结合，通过颜色反应或发光反应来定量黄曲霉素的浓度。
这种方法具有快速、简单、高效和灵敏的特点。
4. 荧光检测法：将黄曲霉素样品与荧光标记的黄曲霉素结合物相互作用，通过荧光信号的强度和特征来测定黄曲霉素的含量。
这种方法具有高灵敏度和特异性。
总结：目前常见的黄曲霉素测试方法包括HPLC、LC-MS、ELISA和荧光检测法。
这些方法的选择取决于实验室设备和分析要求。
食品中黄曲霉毒素检测方法概述
食品中黄曲霉毒素检测方法概述黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌（Aspergillus flavus和Aspergillus parasiticus）产生的毒素，它可以污染多种食品，包括谷物、坚果以及某些油脂和调味品。
黄曲霉毒素对人体有害，会导致多种健康问题，包括肝脏损害、免疫抑制以及致癌作用。
对食品中黄曲霉毒素的检测非常重要，以保证食品的安全性。
目前，主要的黄曲霉毒素检测方法包括生物学法、免疫学法和化学分析法。
生物学法是一种常见的黄曲霉毒素检测方法，它主要利用病毒、细菌或真菌的特定反应来间接检测黄曲霉毒素。
可以利用小鼠进行毒素的生物学检测，通过观察小鼠是否出现中毒症状来判断食品中是否存在黄曲霉毒素。
这种方法简单易行，但需要较长的时间，并且受到动物个体差异的影响。
免疫学法是一种常用的黄曲霉毒素检测方法，它利用抗体与黄曲霉毒素结合来进行检测。
免疫学法可以分为免疫层析法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法等多种方法。
免疫层析法是最常用的方法之一，它通过将样品添加到免疫层析膜条上，然后观察膜条上是否出现特定的颜色带来判断食品中黄曲霉毒素的含量。
这种方法具有便捷、快速和灵敏的优点，但需要有特异性的抗体。
化学分析法是一种精确度较高的黄曲霉毒素检测方法，它通过化学反应来检测毒素的存在。
常用的化学分析方法包括高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）。
这些方法可以通过分析样品中黄曲霉毒素的浓度来确定食品中黄曲霉毒素的含量，但需要较为复杂的实验操作和仪器设备。
食品中黄曲霉毒素的检测方法多种多样，可以根据需要选择适合的方法进行检测。
免疫学法和化学分析法是较为常用和常见的方法，它们可以实现快速、准确和灵敏的检测，有助于确保食品的安全性。
食品中黄曲霉毒素的检测方法
关键词：食品安全；黄曲霉毒素；检测；致毒；致癌
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄 生曲霉等霉菌生成的代谢产物，是该 类物质的总称。其不仅存在于发霉的 谷 物、 坚 果、 米 面、 牛 奶 等 食 物 中， 而且在土壤中也会存在，当环境的温、 湿度到达一定程度时，食物会发生霉 变产生黄曲霉，并代谢出黄曲霉毒素。 黄曲霉毒素通常的危害是损害肝脏， 严重时可引起肝癌甚至死亡，常见的 黄曲霉毒素是粮谷中的 b1 以及牛奶中 的 m1，而 b1 则被列为其中的“头号 杀手”，通过专家研究，它的毒性是 砒霜的 68 倍，致癌性是二甲基亚硝胺 的 75 倍。此外，黄曲霉霉素还有抑制 人体免疫特性的作用，例如抑制肝脏 蛋白质的合成造成代谢的紊乱。对于 人类来说，黄曲霉霉素能够引起体内 器官的病变，而对于动植物来说，黄 曲霉毒素也极大阻碍了它们的有效生 长。因此，为了有效控制黄曲霉毒素 对食品的感染，减少对人体的危害， 研究科学、有效、准确的检测方法至 关重要。
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曲霉检测方法
曲霉是一种条件致病菌，人体对曲霉有极强免疫力，只有在人体免疫功能降低时才能致病，曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统为主，除此之外还可感染眼部、外耳道、皮肤等部位。
除直接感染和变态反应引起曲霉病外，曲霉可产生毒素引起食物中毒，有些曲霉毒素还具有致癌作用，如黄曲霉素、杂色曲霉素。
一、曲霉致病性
曲霉感染是一种免疫相关性疾病，吸入曲霉孢子导致疾病是常见的感染途径，曲霉感染主要包括3种形式：侵袭性曲霉病、慢性曲霉病、过敏性曲霉病。
侵袭性曲霉病多发生在免疫缺陷患者中，是一种较为严重的深部真菌感染性疾病。
引起侵袭性曲霉病的致病菌主要包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉。
近年来，随着免疫抑制剂、广谱抗菌药的广泛使用，器官移植等侵入性诊疗技术的普遍开展，以及恶性肿瘤、获得性免疫缺陷综合征患者人数的不断增加，侵袭性曲霉病的发病率呈逐年上升趋势。
侵袭性曲霉病在常见的医院获得性真菌感染中排名第2位，仅次于侵袭性念珠病，其预后往往较差，死亡率高达50%以上，曲霉感染后是否发病及病情轻重
与宿主的基础疾病和免疫功能密切相关。
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慢性曲霉病一般指慢性肺曲霉病，是一种复杂且无临床特异性病症的肺部疾病，常伴有肺结核感染、非结核分枝杆菌感染、结节或肺癌手术等，因此易造成误诊、漏诊，导致发病率较高。
慢性肺曲霉病主要由烟曲霉引起，是以肺实质缓慢进行性破坏为特征的疾病，其形式表现为单发或多发空洞、结节、浸润或纤维化，伴或不伴曲霉菌球。
过敏性曲霉病以过敏性支气管肺曲霉病为代表，其致病曲霉以烟曲霉最常见，黄曲霉、稻曲霉、土曲霉偶可见到。
过敏性支气管肺曲霉病较常发生于哮喘患者，与其他过敏性疾病常见于儿童不同，其发病率在成年人最高。
由于临床对该病认识不足，常会被漏诊，往往发展至疾病晚期出现不可逆结构改变才被确诊。
二、曲霉检测方法
近年来，随着曲霉病诊疗技术的发展，抗真菌药物和辅助药物为临床治疗曲霉病提供了有力的武器。
然而，由于曲霉病患者往往同时患有其他疾病或者不具有特异性病症，因此难以早期得到诊断而延误病情。
由此可见，曲霉感染的快速、精确检测十分必要。
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曲霉的实验室检测方法主要有：显微镜检查、分离培养与鉴定、血清学抗原抗体检测、聚合酶链反应（PCR）等，各检测方法特异性、灵敏度及检测条件不同，具有不同优缺点，对临床诊断曲霉感染具有不同意义。
组织病理学和无菌部位的真菌培养被认为是诊断曲霉病的金标准。
但是这类传统实验室诊断方法操作繁琐，耗时长，对试验操作技术和样本取材有着较高要求，阳性率低，而且缺乏敏感性和特异性的问题。
半乳甘露聚糖是曲霉细胞壁的组成成分，当曲霉感染时，血液和体液中的半乳甘露聚糖会显著增高，故检测半乳甘露聚糖可用于曲霉感染的早期诊断。
2016年美国感染病学会《曲霉菌病诊治指南》推荐，对于血液系统恶性肿瘤及造血干细胞移植患者，建议将血清和肺泡灌洗液中的半乳甘露聚糖作为侵袭性曲霉病的精确诊断标志物。
针对曲霉菌特异性IgE或总IgE的检测可作为过敏性曲霉菌病的诊断指标，治疗过程中还可动态监测总IgE水平用以指导药物调整。
烟曲霉血清沉淀素或特异性IgG对过敏性支气管肺曲霉病的诊断特异性不高，但如果患者出现高滴度的曲霉特异性IgG抗体，同时伴有胸膜纤维化或持续性肺部空洞形成，则提示为慢性肺曲霉病。
近年来分子生物学技术发展迅速，PCR扩增技术在临床上已应用于各
种病原的检测，该技术灵敏度高，特异性好，具有良好的临床应用前景，
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尤其在曲霉早期感染的诊断方面具有优势。
在曲霉检测方面，2016年美国感染病学会《曲霉菌病诊治指南》推荐有条件的实验室开展分子生物学检测用于曲霉病诊断，但由于该方法尚缺乏结论性验证证据，因此应结合其他诊断结果和临床表现进行综合性判断。
三、已批准曲霉检测试剂概况
我国境内已批准曲霉检测试剂主要为过敏原特异性IgE抗体检测试剂和曲霉抗原/抗体检测试剂，前者管理类别为II类，后者管理类别为三类，均使用血清样本进行检测。
已批准曲霉检测试剂以酶联免疫法居多，其具有敏感性高、特异性强，操作简便，肉眼可观察，既可以检测抗体、又可以检测抗原，易于自动化，便于大规模检测等优点。
但酶联免疫法受其技术原理的影响，干扰因素较多，容易出现假阳性或假阴性。
目前，已有基于荧光PCR法的国产曲霉核酸检测试剂获批上市，该方法使用痰液样本，具有灵敏度高和特异性高的特点，在曲霉感染早期临床检测方面具有优势。
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四、总结
曲霉在免疫缺陷患者中往往引起较为严重的感染，其预后较差，死亡
率较高，因此对曲霉的检测，尤其是感染早期的检测，在治疗曲霉感染方面具有重要意义。
随着分子诊断技术的发展以及PCR实验室的建立，曲霉
核酸检测在临床应用方面的优势得以凸显。
但是目前曲霉核酸检测类产品
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普遍存在以下问题：曲霉核酸检测的诊断标准尚不明确，注册申请人对产品性能验证的方法、内容多种多样，有的存在方法不合理，验证内容不全面等问题，对交叉反应和包容性的验证需要进一步规范，各个注册申请人对阳性判断值的建立方法理解差异较大，对于临床判断曲霉病的金标准认识不统一，对于最低检出能力的评价也存在不同的认识，不同注册申请人的企业参考品设置也是千差万别，为了进一步规范此类产品的申报材料，统一注册申请人的认识，为审评人员提供依据，接下来需制定相关原则对曲霉核酸检测试剂开发进行指导。
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