洋葱伯克霍尔德菌群3种鉴定方法的比较

1前言
伯克霍尔德菌,原称为洋葱假单胞菌,由美国植物病理学家Burkholder于1949年首次发现。

它是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。

随着细菌分类技术的发展,伯克霍尔德菌属包括洋葱伯克霍尔德菌群(B.cepacia complex)、假鼻疽伯克霍尔德菌(B.pseudomallei)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.gladioli)、鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)、泰国伯克霍尔德菌(B.thailandensis)等60多个菌种,具有复杂多样性,既有人畜共患病原菌,也有植物病原菌及环境分离株,临床上以洋葱伯克霍尔德菌较为常见[1,2]。

洋葱伯克霍尔德菌群是基因型不同但表型相近的一组非发酵复杂菌群。

2001年, Coneyet等利用rRNA-DNA杂交全细胞电泳和细菌表型标志物等方法将洋葱伯克霍尔德菌群分为9种基因型[3,4]。

洋葱伯克霍尔德菌群广泛存在于自然界和医院环境中,是一种常见的条件致病菌,常引起囊性纤维化疾病和慢性肉芽肿。

在医学领域洋葱伯克霍尔德复合群感染已呈上升趋势,可引起多种部位的感染,可引起爆发流行,对多种抗生素具有耐药性,治疗难度大[5,6]。

洋葱伯克霍尔德菌群3种鉴定方法的比较
杨丹婷苏嘉妮李婉珊钟卫烨王曦韦云丁清龙周露*
(广东省食品检验所广东广州510435)
摘要为了比较VITKE2COMAPCT、VITEK MS质谱、16s rDNA基因测序3种方法鉴定洋葱伯克霍尔德菌群的异同,挑选15株从米面制品、淀粉及其制品中分离得到的洋葱伯克霍尔德菌群的菌,分别用VITEK2COMPACT、VITEK MS质谱和16s rDNA基因测序进行鉴定。

结果显示,VITEK2 COMPACT只能鉴定到群水平,可信度88%—99%;VITEK MS质谱可鉴定到种水平,鉴定置信度99%; 16s rDNA基因测序可鉴定到种水平,序列同源性能达到99%以上,但每株菌16s序列能匹配到2种以上洋葱伯克霍尔德菌群里的菌。

所以,3种鉴定方法中,VITEK MS质谱法可鉴定出洋葱伯克霍尔德菌群里的不同种,该方法结果准确,时效性高,操作步骤简单。

关键词洋葱伯克霍尔德菌群;VITEK2COMPACT;VITEK MS;16s rDNA基因测序
中图分类号R446.5
Comparison of Three Identification Methods of Burkholderia Cepacia Group
YANG Danting,SU Jiani,LI Wanshan,ZHONG Weiye,WANG Xi,WEI Yun,
DING Qinglong,ZHOU Lu*
(Guangdong Institute of Food Insepetion,Guangzhou,Guangdong,510435,China) Abstract:In order to compare the differences and similarities among VITKE2COMAPCT,VITEK MS and16s rDNA gene sequencing in the identification of Burkholderia cepacia,15strains of Burkholderia cepacia isolated from rice noodles,starches and their products are selected and identified by VITEK2 COMPACT,VITEK MS and16s rDNA gene sequencing,respectively.The results show that VITEK2 COMPACT can only identify the population level with88%—99%reliability;VITEK MS can identify species level with99%confidence;16s rDNA gene sequencing can identify species level with99% homology,but16s sequence of each strain can match more than two species of Burkholderia cepacia. So,among the three identification methods,VITEK MS can identify different species of Burkholderia cepacia group,and it has the advantages of accurate results,high timeliness and simple operation steps. Key Words:Burkholderia Cepacia Group;VITKE2COMPACT;VITEK MS;16s rDNA Gene Sequence
第一作者E-mail:451224676@;*通信作者E-mail:zhoulu1982@
项目基金:广东省食品药品监督管理局科技创新项目(2018ZDZ07、2018ZDZ06)
收稿日期:2019-04-05
菌株编号
菌株来源样品
样品抽检地区抽样环节1
面皮
广东江门
餐饮
在2018年度广东省食品检验所的专项抽检米面制品、淀粉及其制品专项中发现,广东省米面制品、淀粉及其制品中存在伯克霍尔德菌属污染的风险较高,特别是洋葱伯克霍尔德菌群。

目前,国内的检验标准中,只有进出口口腔清洁类产品和进出口化妆品中有洋葱伯克霍尔德菌的检验标准,且鉴
定的主要方法是生理生化实验[7,8]。

2014年,高业成等建立了可以有效排除杂菌干扰检测出食品样品中
的洋葱伯克霍尔德菌的方法[9]。

2016年,胡娟等用生化实验结合PCR 方法鉴定饮水中洋葱伯克霍尔德菌[10]。

在食品行业没有洋葱伯克霍尔德菌群鉴定的标准方法。

因此,探究准确高效的洋葱伯克霍尔德菌群鉴定方法,可为食品标准的建立提供参考依据,提高食品安全保障。

目前,传统生化方法和临床上应用的VITEK 2COMPACT 不能准确区分洋葱伯克霍尔德菌群基
因型[11]。

VITEK MS、分子生物学手段是近年发展起来并已广泛应用于细菌鉴定的方法。

本文对从广东省米面制品、淀粉及其制品中分离的洋葱伯克霍尔德菌群分别进行VITEK 2COMPACT、VITEK
MS 质谱鉴定和16s rDNA 基因测序,其中,VITEK 2COMPACT 只能鉴定是洋葱伯克霍尔德菌群,不能进一步细化;16s rDNA 虽然可以鉴定出具体菌种,但由于序列相似性太高,鉴定结果不够
准确;VITEK MS 质谱可直接鉴定到种水平,鉴定置信度99%,方便快捷。

2材料与方法2.1仪器与试剂
VITEK 2Compact 自动微生物快速检测分析系统(法国生物梅里埃股份有限公司);VITEK MS 质谱仪(法国生物梅里埃股份有限公司);Nano 核酸蛋白分析仪(日本岛津中国公司);Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国伯乐公司);T100PCR 仪(美国伯乐公司)。

脑心浸出液肉汤(BHI)(广东环凯微生物科技有限公司);VITEK 2COMPACT GN 鉴定卡(法国梅里埃公司);哥伦比亚血琼脂平板(北京陆桥技术股份有限公司);基质液CHCA(法国梅里埃公司);细菌基因组DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)。

实验菌株:均来源于2018年广东省米面制品、淀粉及其制品抽检样品。

具体见表1。

2.2
实验方法
用BHI 将实验需用菌株进行复苏。

2.2.1
VITEK MS 质谱仪鉴定
在48孔靶板质控孔涂校准菌(在哥伦比亚血琼
脂平板上培养24h 新鲜的单个大肠埃希氏菌ATCC-8739菌落),涂匀后加1μL 基质液CHCA,每16孔区域涂一个质控孔;在样品孔涂匀待测菌,每涂一个孔加一次1μL 基质液CHCA,待基质液干透后上机。

2.2.2
16s rDNA 基因测序
(1)DNA 提取。

DNA 提取方法参照细菌基因组DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)操作说明进行。

(2)DNA 浓度测定。

取3.5μL 提取的DNA 于核酸蛋白分析仪上,以无菌水清洗、DNA 提取试剂TE 作空白,测定DNA 浓度。

(3)PCR。

参照PCR 试剂盒说明书。

扩增体系:DNA 模板2μL,上游引物(27F)
2μL,下游引物(1492R)2μL,2×PCR DSmix 25μL,用超纯水补足至50μL。

扩增条件:94℃,3min;94℃,30s;60℃,
30s;72℃,2min,30个循环;72℃,10min。

(4)电泳。

取5μL PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,以2000bp Marker 作为参照。

电泳条件:
120V,40min。

电泳结束后,于凝胶成像装置成像。

(5)测序。

PCR 产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

3结果与分析3.1
VITEK 2COMPACT 生化鉴定结果与分析在VITEK 2COMPACT 生化鉴定实验中,15株
表1实验菌株信息
(续表1)
菌株编号
菌株来源样品样品抽检地区抽样环节23456789
101112131415河粉竹篙粉红薯粉螺蛳粉猪肠粉河粉桂林米粉米粉濑粉老鼠粉米粉肠粉河粉新楼山水河粉
广东清远广东佛山广东梅州广东清远广东佛山广东佛山广东东莞广东佛山广东东莞广东河源广东河源广东肇庆广东清远广东阳春
流通餐饮餐饮餐饮流通餐饮餐饮流通生产生产餐饮生产流通生产
表3VITKE2COMPACT生化结果
生化项目结果占比(%)生化项目结果占比(%)生化项目结果占比(%)
丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨
酸芳氨酶
-100.0L-吡咯我烷酮芳氨酶-100.0D-纤维二糖+100.0 H2S生成-100.0谷氨酰芳氨酶pNA-93.3γ-谷氨酰转移酶-86.7β-葡糖苷酶-100.0D-甘露醇+80.0β-木糖苷酶-100.0 L-脯氨酸芳氨酶-73.3古老糖-100.0尿素酶+53.3蔗糖+100.0D-海藻糖-100.0丙二酸盐+86.7 L-乳酸盐碱化+100.0琥珀酸盐碱化+100.0α-半乳糖苷酶-100.0甘氨酸芳氨酶-100.0赖氨酸脱羧酶-100.0香豆酸+100.0 O/129耐药+100.0L-苹果酸盐同化-86.7L-乳酸盐同化-98.9侧金盏花醇-100.0L-阿拉伯醇-100.0β-半乳糖苷酶-100.0β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-100.0D-葡萄糖+100.0发酵/葡萄糖-100.0 D-麦芽糖+100.0D-甘露糖+100.0β-丙氨酸芳氨酶PNA-86.7脂肪酶-100.0酪氨酸芳氨酶-100.0D-山梨醇+66.7 D-塔格糖-100.0柠檬酸盐(钠)+100.05-酮基-D-葡萄糖酸盐-100.0α-葡糖苷酶-100.0β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶-100.0磷酸酶-80.0鸟氨酸脱羧酶-100.0L-组氨酸同化-98.9β-葡萄糖醛酸酶-100.0
谷氨酸-苷氨酸-精氨酸芳氨酶-100.0ELLMAN-100.0
表215株实验菌VITEK2COMPACT结果及可信度
菌株编号可信限(%)VITEK结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1597
95
98
99
99
91
99
91
88
95
97
99
90
95
98
洋葱伯克霍尔德菌群
实验菌均鉴定为洋葱伯克霍尔德菌群,只能鉴定到菌群,不能鉴定到种,可信度范围为88%~99%,可信度越接近99%,说明鉴定结果越好,详见表
2。

15株实验菌在VITEK2COMPACT的47个生化反应中,有35个生化实验结果完全一致;12个生化反应结果有区别,包括:L-脯氨酸芳氨酶、谷氨酰芳氨酶PNA、D-甘露醇、L-苹果酸盐同化、L-组氨酸同化、γ-谷氨酰转移酶、尿素酶、丙二酸盐、L-乳酸盐同化、β-丙氨酸芳氨酶PNA、D-山梨醇、磷酸酶。

其中,菌株编号为4、5、7的3株菌报告的生化反应结果完全一致,具体生化反应详见表3。

其中,存在差异的生化结果见表4。

注:“+”表示结果呈阳性;“-”表示结果呈阴性。

表5
VITEK MS 鉴定结果
菌株编号
鉴定结果
可信限(%)123456789
101112131415洋葱伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌
99.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.9999.80
表4
15株实验菌存在差异的生化结果
注:“+”表示结果呈阳性;“-”表示结果呈阴性;“(-)”和“(+)”表示十分接近测试阈值的较弱反应。

菌株编号生化项目
L-脯氨酸芳氨酶谷氨酰芳
氨酶PNA
D-甘露醇
L-苹果酸盐同化L-组氨酸同化γ-谷氨酰转移酶尿素酶丙二酸盐L-乳酸盐同化β-丙氨酸芳氨酶PNA
D-山梨醇磷酸酶
123456789
101112131415-----+-+++-------------+------
-+++++++++-+++
(-)-+-------+------+--------------++------
(-)---+--+---+-+++-(+)++---+++++++++++++
-+-------------+-+------------
-+-+++++
(-)+-+++--(+)
---+-+
(-)------3.2
VITEK MS 质谱鉴定结果与分析
VITEK MS 质谱实验鉴定结果可以达到种的水平。

在15株实验菌中,有13株鉴定为越南伯克霍
尔德菌,2株鉴定为洋葱伯克霍尔德菌。

可信限为99.8%~99.99%,具体见表5。

以2号和3号实验菌为例,2种菌的峰值图分别如图1和图2所示。

3.3
16s rDNA 基因测序结果与分析
在16s rDNA 基因测序鉴定实验中,15株实验菌DNA 经PCR 扩增后,获得与预期大小基本一致的1500bp 左右的目标片段,详见图3。

将测序结果在NCBI 中经过BLAST 分析比对,每个样品鉴定结果均有2个以上,同源性均在99%以上,结果包括中心伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌等,详见表6。

3.43种鉴定方法比较分析3.
4.1鉴定结果比较
比较3种鉴定方法的结果,详见表7。

VITEK 2COMPACT 只能鉴定是洋葱伯克霍尔德菌群,不能进一步细化,可信度范围为88%~99%;16s rDNA 基因测序可以鉴定到种水平,序列同源性均在99%以上;VITEK MS 质谱可直接鉴定到种水平,可信限为99.8%~99.99%。

表616s rDNA 基因测序结果
菌株编号
鉴定结果
同源性(%)1
中心伯克霍尔德菌/伯克霍尔德菌
99.86/99.79
图1越南伯克霍尔德菌峰值图(2号)
图3
15株实验菌16s rDNA PCR
扩增结果150000140000130000120000110000100000900008000070000600005000040000300002000010000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000900010000
11000
12000
13000
14000
15000
峰值强度(AU)
图2洋葱伯克霍尔德菌峰值图(3号)
1150001100001050001000009500090000850008000075000700006500060000550005000045000400003500030000250002000015000100005000
200030004000500060007000
80009000100001100012000130001400015000160001700018000
峰值强度(AU)
菌株编号为1和3的VITEK MS 结果均为洋葱伯克霍尔德菌,而16s rDNA 基因测序结果均为中心伯克霍尔德菌或伯克霍尔德菌,其余13株菌用2种鉴定方法结果一致,VITEK MS 结果均鉴定为越南伯克霍尔德菌,16s rDNA 基因测序结果都有可能为越南伯克霍尔德菌,但不同样品用16s
rDNA 基因测序方法鉴定的结果不完全一致。

16s rDNA 基因测序结果不唯一的原因是,伯克霍尔德
菌在16s 序列比较保守,虽然可以鉴定出具体菌种,但由于序列相似性太高,鉴定结果不够准确。

2017年,黄庭轩等用RecA 序列分析得出伯克霍尔德菌属内各种鉴定有效且接近全基因组分析的结
果[12]。

因此,要运用分子生物学手段鉴定洋葱伯克霍尔德菌群,可先用16s rDNA 基因测序进行初筛,再进一步做RecA 基因或全基因组测序以确定具体的种类。

菌株标号
VITEK 2COMPACT VITEK MS 16s rDNA 基因测序
1洋葱伯克霍尔德菌群
洋葱伯克霍尔德菌中心伯克霍尔德菌/伯克霍尔德菌
2越南伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌/越南伯克霍尔德菌3洋葱伯克霍尔德菌中心伯克霍尔德菌/半纳伯克霍尔德菌/伯克霍尔德菌4越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌5越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/中心伯克霍尔德菌6越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌
7越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌8越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌9
越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌10越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌11越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌12越南伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌/越南伯克霍尔德菌13越南伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌/越南伯克霍尔德菌14越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德
15越南伯克霍尔德菌
越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德/洋葱伯克霍尔德
表7
3种鉴定方法的结果
菌株编号
鉴定结果
同源性(%)23456789
101112131415洋葱伯克霍尔德菌/越南伯克霍尔德菌
中心伯克霍尔德菌/半纳伯克霍尔德菌菌株/伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌
越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/中心伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌
越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌/越南伯克霍尔德菌洋葱伯克霍尔德菌/越南伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌
越南伯克霍尔德菌/乌氏伯克霍尔德菌/洋葱伯克霍尔德菌
99.86/99.7299.51/99.51/99.5199.79/99.7999.72/99.65/99.5899.86/99.86
99.72/99.65/99.6599.58/99.58/99.5899.31/99.31/99.24
99.86/99.79/99.8699.79/99.7999.93/99.7999.93/99.7299.72/99.6599.58/99.58/99.65(续表6)
3.4.2
鉴定时长比较
从鉴定时长比较3种鉴定方法:鉴定时长从备好上机用的增菌液或平板后开始计算,VITEK 2
COMPACT 鉴定时长相对较长,VITEK MS 最短,详见表8。

(下转第31页)
4结语
在3种鉴定方法中,VITEK 2COMPACT 鉴定结果只能到洋葱伯克霍尔德菌群,鉴定时长为7h 或以上;VITEK MS 质谱仪鉴定结果能到种的水平,鉴定时长只需要15min;16s rDNA 基因测序法鉴定能到种的水平,但由于伯克霍尔德菌在16s 序列比较保守,序列比对结果不唯一,不适合鉴定到种。

综上,用VITEK MS 方法鉴定洋葱伯克霍尔德菌群最佳,该方法结果准确,时效性高。

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鉴定方法鉴定时长VITEK 2COMPACT VITEK MS 16s rDNA 基因测序
7~9h
15min 5h 表83种方法的鉴定时长比较
(上接第18页)
况、病患观念,临床并没有有效地将之推广普及。

本次研究基于2018年1—8月常熟地区血培养数据,分析得出配合厌氧瓶使用的双侧双瓶不仅显著提高病原菌的检出率,而且就一套双侧双瓶培养出来的阳性菌而言,也能通过报阳瓶数以及是否为同一种菌株来作为临床判断是否为污染菌和致病菌的依据。

从表2中可以看到,在送检的单需氧瓶中,检出最多的是人葡萄球菌,属于凝固酶阴性葡萄球菌,它是一种条件致病菌,存在于自然界中,但是也能引起败血症、感染性心内膜炎等,但是仅从一瓶需氧血培养瓶中培养出凝固酶阴性的葡萄球菌,无法判断是污染菌还是致病菌,因此,对于这种阳性培养结果意义不大,完全没有达到做血培养的目的。

本文资料也提示大肠埃希菌的检出率最高,且加送厌氧瓶后阳性分离率高于单纯送检需氧瓶,说明在送检血培养时,为节省治疗成本,仅仅送检需氧瓶是不够的,应同时送检厌氧瓶,提高兼性厌氧菌中大肠埃希菌的检出[4]。

增加厌氧瓶的双侧双瓶抽血可明显缩短病原菌的报阳时间,随着厌氧瓶送检数量递增,检出细菌的株数和种数也相应增加,尤其对于一些少见菌和厌氧菌的检出起着无可替代的作用。

在本文中发现,临床医生的“经验性治疗”是最大的障碍。

在临床上,当病患出现发热等疑似是血流感染时,医生首先选择的是经验性用药,以期通过早期广谱抗生素的使用达到减缓病情的目的,只有当患者情况反复或者病情加重时,才选择送检血培养,但病患已经应用了大量广谱抗生素,感染初期存在于血液中的细菌可能已经变异,耐药性发生了改变,更或者生长受到抑制,存在于血液却难以培养得到。

综上所述,提倡临床开展配合厌氧瓶的双侧双瓶血培养的送检,不仅仅是节约经济、医疗资源,更能提高阳性率、缩短检出时间,为临床提供更真实可信的实验室数据。

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