一种发酵乳中乳酸菌总数快速检测技术的研究

１４２　２０１５年２月　第３６卷第４期　

食品研究与ｊｃＦ发　

Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　检测分析　

ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１５．０４．０３６　

一种发酵乳中乳酸菌总数快速检测技术的研究　

富鑫，华家才，储小军　（贝因美婴童食品股份有限公司，配方奶粉研发中心，浙江杭州３１００００）　

摘要：以还原法为理论基础，开发并建立一种应用于发酵乳饮料成品乳酸菌数指标的快速检测方法。本方法应用　仪器记录了样品加入反应试剂后的颜色变化（ＲＧＢ），通过数理统计分析，采用斜率法，以Ｒ值斜率表示样品颜色的变　化速度。本研究对发酵乳样品进行了预处理，以符合刃天青还原法的反应条件。以ＧＢ４７８９．３５《食品安全国家标准食　品微生物学检验乳酸茵检验》为标准，建立了Ｒ值斜率与乳酸菌菌落总数之间的标准方程，经验证本方法检测结果　与ＧＢ４７８９．３５《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》检测结果无显著差异。与现有标准方法相比，在时　效性、运营成本等方面具有较大优势。　关键词：还原法；发酵乳；乳酸茵总数；快速检测　

Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ａ　Ｒａｐｉｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　Ｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　Ｍｉｌｋ　ＦＵ　Ｘｉｎ，ＨＵＡ　Ｊｉａ－ｃａｉ，ＣＨＵ　Ｘｉａｏ－ｊｕｎ　（ＢｅｉｎｇｍａｔｅＢａｂｙ＆Ｃｈｉｌｄ　Ｆｏｏｄ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｆｏｒｍｕｌａ　Ｒ＆Ｄ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ＲＥＤＯＸ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎｄ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ａ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｗｈｉｃｈ　ａｐｐｌｉｅｓ　ｔｏ　ｒａｐｉｄ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｍｉｌｋ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ（ＲＧＢ）ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｉｌｋ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ａｄｄｅｄ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｂｙ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒ　ｃｈａｎｇｅ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｓ　Ｒ　ｓｌｏｐｅ　ｂｙ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｆｉｔ　ｆｏｒ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　Ａｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｔｈｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄ（ＧＢ　４７８９．３５Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｆｏｏｄ　ｓａｆｅｔｙ　ｓｔａｎｄａｒｄＦｏｏｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ），ａ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｏ　ｓｈｏｗ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｒ　ｓｌｏｐｅ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｐｌａｔｅ　ｃｏｕｎｔ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｍｅａｓｕｒｅ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄ（ＧＢ　４７８９．３５Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｆｏｏｄ　ｓａｆｅｔｙ　ｓｔａｎｄａｒｄＦｏｏｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ）．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｔｈｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｓ　ｓｏｍｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｉｎ　ａｓｐｅｃｔ　ｏｆ　ｌｏｗｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｃｏｓｔ　ａｎｄ　ｔｉｍｅｌｉｎｅｓｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ；ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｍｉｌｋ；ｔｏｔａｌ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　

发酵乳在ＧＢ　１９３０２—２０１０中的定义为以生牛　（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的ｐＨ降低　的产品，涵盖了发酵乳、酸乳、风味发酵乳、风味酸乳等　产品。由于食用时发酵乳及发酵乳饮料中的活菌数需　达到一定数量才能起到保健作用ｎ］，因此ＧＢ　１９３０２—　２０１０（食品安全国家标准发酵乳》中明确规定了发酵乳　产品的乳酸菌限量：乳酸菌数≥１￣１０　ｃｆｕ／ｇ（ｍＬ）回。由　于发酵乳为全冷链运输和销售，ＧＢ　４７８９．３５—２０１０《食　品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》方法　不但需要专业人员操作，运行成本较高，而且４８　ｈ的　检验周期，严重缩短了发酵乳产品原本就很短的货架　作者简介：富鑫（１９８４一），男（汉），中级工程师，硕士研究生，研究方　向：乳制品快速检测技术。　期。因此一种快速有效的发酵乳中乳酸菌数的检测方　法，对缩短出厂检测时间，延长产品保质期内的货架　摆放时间，进而提高企业利润和产品质量有着重要的　意义。　本研究以染料还原法为理论基础。染料还原法是　指通过向乳中加入某些氧化还原型染料，根据染料颜　色变化速度来判定乳中细菌总数的多少，检测染料褪　色时间的方法［３１。原理是氧化还原酶是微生物细胞内　在代谢过程中由于生理需要产生主要酶类，在细胞内　催化氧化还原反应嗍，能将微生物新陈代谢过程中从　能量物质上脱下的氢传递给染料，使其还原并发生颜　色变化。本研究选用刃天青为反应试剂，氧化还原酶　与刃天青反应使刃天青由蓝色变为紫色、粉色直至无　检测分析　富鑫，等：一种发酵乳中乳酸茵总数快速检测技术的研究　色。由于氧化还原酶数量与乳中存在的细菌数量存　在一定的线性关系，因此可根据生乳的颜色变化可　以对细菌总数进行判定与ＳＰＣ法有很好的相关性　（ｒ：一０．７９）ｔ￣。　本研究采用自主研制的颜色信息采集仪器进行　实验，试图建立一种快速、准确的新的检测发酵乳饮　料成品乳酸菌数方法。如图１所示。　底部　圈１买验仪器构造　Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　仪器主要由ＬＥＤ发射器、感应器、微处理器等构　成，采用ＲＧＢ颜色体系采集信息，记录检测样品颜色　变化。东北农业大学的相关研究中，对刃天青染料还　原法的颜色变化对仪器的ＲＧＢ颜色体系进行Ｅｘｒａｃ—　ｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ：ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ（主成分分　析），确定以Ｒ值斜率为变量，记录刃天青颜色变化［６１。　乳酸菌并不是微生物学的分类，是一类能使可发　酵性碳水化合物转化成乳酸的细菌的总称　。发酵乳　由灭菌后的牛乳接种发酵剂经发酵制得圈，因此发酵　乳中的细菌总数即为乳酸菌数。而采用刃天青还原法　测定发酵乳中乳酸菌数还需要对样品进行一些处理。　这是由于发酵乳饮料的ｐＨ过低，不符合刃天青染料　还原法的反应条件。ｐＨ对刃天青还原法的影响主要有　两个方面：首先，ｐＨ是影响细菌生命代谢活动的主要　因素，直接影响微生物代谢中的酶反应，动物酶的适　宜反应ｐＨ在６．５～８．０之间［９１。另一方面，刃天青为氧化　还原染料，本身可作为ｐＨ指示剂，酸性条件下呈红　色，碱性条件下呈蓝色。当氢离子浓度高时，粉色的试　卤灵浓度增加，溶液颜色将出现明显变化。当氢离子　浓度很低，甚至是在碱性条件时，蓝色的刃天青难以　得到氢离子生成试卤灵，从而变色反应收到明显的限　制。东北农业大学的相关研究结果证明，应用刃天青　染料还原法检测细菌总数，经多重比较大致在ｐＨ　６．５　７．０范围内检测结果无显著差异【ｌ切。目前市售的合格发　酵乳ｐＨ在４．０～４．５范围内，因此需要将发酵乳样品经　处理后使其ｐＨ在６．５～７．０范围内，才能应用刃天青染　料还原法对其乳酸菌总数进行快速检测。　以ＵＨＴ乳对样品进行稀释的方法对发酵乳进行　预处理，使其ｐＨ符合刃天青染料还原法的反应条件。　以仪器记录结果及ＧＢ　４７８９．３５检测结果建立标准曲　线，并根据标准曲线计算发酵乳中乳酸菌数。　

１材料与方法　１．１材料与仪器　生乳：黑龙江贝因美乳业有限公司提供；发酵乳：　市售；ＵＨＴ乳：市售；刃天青：Ｓｉｇｍａ公司；ＭＲＳ（Ｍａｎ　Ｒｏｇｏｓａ　Ｓｈａｒｐｅ）培养基：北京奥博星生物技术有限公　司；梅特勒一托利多ｄｅｈａ３２０　ｐＨ计：瑞士梅特勒一托利　多有限公司；颜色信息采集仪器（自制）：可内置２０个　比色皿，测量温度３７℃，ＣＣＤ传感器采集样品颜色信　息，每１　ｍｉｎ采集一次，连续１０　ｍｉｎ，传输到计算机，检　测结果以样品的三原色值（ＲＧＢ值）显示，以Ｅｘｃｅｌ表　格形式存储于计算机中。　１．２实验方法　１．２．１样品的预处理方法　随机抽取市售发酵乳样品ｌ０个，与ＵＨＴ乳１：９　混合，ｐＨ计室温（１５　ｏＣ～２０℃条件下）检测发酵乳样品　ｐＨ和稀释后混合液ｐＨ。　１．２．２标准曲线的建立与验证　本研究随机抽取市售样品１７个，按照１．２．２方法　对其进行预处理。将预处理后样品１　８００　ｔｘＬ，加入　０．００５％（ｗ／ｖ）刃天青溶液２００　Ｌ于比色杯中混匀；将　比色杯放入自制颜色信息采集仪器中进行检测，连续　１０　ｍｉｎ采集样品ＲＧＢ颜色信息，以Ｒ值斜率表示样　品颜色的变化速度。以乳酸菌数为纵坐标，自制颜色　信息采集仪器检测结果（Ｒ值斜率）为横坐标，绘制Ｒ　值斜率与乳酸菌数之间的关系曲线，乳酸菌数为采用　ＧＢ　４７８９．３５对未经预处理的样品中的乳酸菌数的检测　结果。应用Ｅｘｃｅｌ数据分析工具进行回归分析，得到回　归方程、相关系数，分析其相关性，绘制标准曲线。另　随机抽取１２个市售发酵乳饮料样品进行标准曲线的　验证，每组做３个平行。以Ｘ￣ｘ形式记录数据，进行相　关性分析与ｔ检验（双尾）。　

２结果与分析　２．１样品预处理方法结果　样品预处理方法结果见表１。　

表１样品预处理后的ｐＨ　Ｔａｂｌｅ　１　ｐＨ　ａｆｔｅｒ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ