高脂日粮对小鼠不同部位脂肪沉积及血液生化指标的影响

高脂日粮对小鼠不同部位脂肪沉积及血液生化指标的影响郭媛;葛静;楚心怡;孙静宇;钱泓润;王世康;史新娥【摘要】为了研究高脂日粮对小鼠脂肪沉积及血液生化指标的影响,选取3周龄C57BL/6J小鼠12只,随机分为高脂日粮组和低脂日粮组(对照组),每组6只.饲喂11w后,测体重、采食量并采集血样和不同部位脂肪组织及肝脏.采用冰冻切片HE 染色方法检测脂肪细胞的充脂情况.结果显示,高脂日粮组与对照组相比,体重极显著增加(P＜0.01),腹股沟脂肪和附睾脂肪重量显著增加(P＜0.05),脂肪细胞明显增大,脂解基因和产热基因表达显著降低(P＜0.05),血液中T-chol和HDL-c含量显著升高(P＜0.05),ALT与AST水平显著降低(P＜0.05),但AST/ALT比值偏高.以上结果表明,高脂日粮引起的肥胖是由于脂肪细胞肥大、产热基因和脂解基因表达降低以及不同部位脂肪沉积增多造成的,并且易引起肝脏炎症.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】6页(P57-62)【关键词】高脂日粮;脂肪沉积;基因表达;生化指标;小鼠【作者】郭媛;葛静;楚心怡;孙静宇;钱泓润;王世康;史新娥【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S811.5随着人们营养结构和生活方式的改变，肥胖及其相关疾病的发病率逐年提高，严重威胁着人类的健康[1-2]，而能量过度摄入是肥胖产生的主要原因之一[3]。

20世纪50年代，Samuels等[4-5]用含70%能量的日粮饲喂大鼠，可诱导大鼠产生肥胖并且血糖值升高。

Buettner等[6]饲喂含有超过40%脂肪含量的动物脂肪或含ω-6 /ω-9脂肪酸的植物油的高脂日粮饮食(High-fat diet, HFD)半纯化日粮即可导致小鼠发生肥胖和胰岛素抵抗。

另有研究发现，长期喂食富含脂肪的饮食，能诱导易感大鼠的体重增加10%～20%，并且当饮食从青年时开始并持续数周时，肥胖诱导最有效[7]。

脂肪细胞是维持机体全身能量和葡萄糖代谢平衡的重要调节者。

HFD时，脂肪细胞数量和大小增加[8-9]，肾上腺素刺激的脂肪分解减少[10]，棕色脂肪组织和白色脂肪组织中的解偶联蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)和脂质合成基因的表达水平降低[11-12]。

但是，HFD诱导的脂肪沉积是脂肪细胞数量增加还是体积增大、不同部位的差异、血液生化指标的变化等问题还不清楚。

本试验采用高脂日粮饲喂C57BL/6J小鼠11 w，以期探明HFD对小鼠不同部位脂肪沉积以及不同部位脂肪组织中脂肪合成基因、棕色脂肪标志基因、脂肪水解标志基因表达和血液生化指标的影响，为研究HFD诱导肥胖的作用机理提供理论基础。

1 材料与方法1.1 试验动物3周龄C57BL/6J公鼠12只，购自辽宁某生物公司。

高脂日粮(high-fat diet，HFD)(TP23300，脂肪含量60%)与低脂日粮(low-fat diet，LFD)(TP23302，脂肪含量10%，对照)购自南通某公司。

试验分2组，每组6只，分别饲喂HFD和LFD，自由采食和饮水，并记录每周采食量与体重变化。

1.2 血清生化指标含量测定小鼠禁食过夜，眼球采血处死，血液采集入1.5 mL离心管，室温自然凝固30 min，4 ℃ 2 000 r/min离心20 min，吸取上清，送至杨凌示范区医院检测胆固醇(T-chol)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)含量。

1.3 Real-time qPCR小鼠处死后采集腹股沟白色脂肪组织(iWAT)、附睾白色脂肪组织(eWAT)、棕色脂肪组织(BAT)和肝脏(Liver)，置于-80 ℃冰箱待用。

用时取出约0.5 g放入2 mL 离心管内，加入2颗磁珠和1 mL Trizol(Takara)，放入组织研磨仪中45 Hz研磨1 min后取出，室温放置10 min使其充分乳化，然后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min去除组织碎片，取上清于1.5 mL离心管，Trizol法提取组织RNA。

用Primescript○R RT Reagent Kit(Takara)将RNA反转为cDNA。

按SYBR○R Premix ExTaq Ⅱ(Takara)说明书定量检测成脂分化标志基因(PPARγ、ap2)、棕脂标志基因(UCP1、PRDM16、PGC1α、Cidea)以及脂肪水解标志基因(ATGL、HSL)的表达，Real-time qPCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列见表1。

表1 Real-time qPCR的引物序列Table 1 The primer sequences used for Real-time qPCR基因Gene上游引物Forward下游引物ReversePPARγ5′-AGGGCGATCTTGACAGGAAAGACA-3′5′-AAATTCGGATGGCCACCTCTTTGC-3′ap25′-ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG-3′5′-CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA-3′UCP15′-AGCCACCACAGAAAGCTTGTCAAC-3′5′-ACAGCTTGGTACGCTTGGATACTG-3′PGC1α5′-GTCAACAGCAAAAGCCACAA-3′5′-TCTGGGGTCAGAGGAAGAGA-3′PRDM165′-TCATATGCGAGGTCTGCCACAAGT-35′-TAGTGCTGAACATCTGCCCACAGT-3′Cidea5′-TGCTCTTCTGTATCGCCCAGT-3′5′-GCCGTGTTAAGGAATCTGCTG-3′ATGL5′-TTCGCAATCTCTACCGCCTC-3′5′-AAAGGGTTGGGTTGGTTCAG-3′HSL5′-GCTGGGCTGTCAAGCACTGT-3′5′-GTAACTGGGTAGGCTGCCAT-3′β-tubulin5′-GGGAGGTGATAAGCGATGAA-3′5′-CCCAGGTTCTAGATCCACCA-3′1.4 切片与HE染色新鲜的小鼠组织放入4%多聚甲醛的5 mL离心管中固定12 h，然后放入30%蔗糖溶液中浸泡24 h使其充分脱水，使用德国徕卡冰冻切片机(CM950)对组织进行切片。

HE染色：将切片置于60 ℃的苏木精中30～60 s，流水冲洗5～10 s；置于1%盐酸酒精分化液中1～3 s，流水冲洗1～3 s；将切片置于促蓝液中返蓝5～10 s，流水冲洗15～30 s；将切片置于0.5%伊红溶液中染色30～60 s，蒸馏水冲洗1～2 s；将冰冻切片分别置于80%乙醇1～2 s，95%乙醇1～2 s，无水乙醇1～2 s，无水乙醇-二甲苯混合液(1:1)2～3 s，二甲苯1～2 s，中性树胶封固。

1.5 数据处理试验结果表示为“”，利用SPSS 19.0统计软件中的单因素方差分析，进行显著性检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析2.1 高脂日粮对小鼠采食量及体重的影响高脂饲喂3周龄小鼠11 w，统计其体重与采食量。

结果显示，HFD组小鼠体重在第1～5 w显著高于LFD组(P<0.05)，在6～11 w极显著高于LFD组(P<0.01)(图1A)；HFD组与LFD组小鼠采食量均随日龄增加逐渐上升，且LFD组稍高于HFD组，但差异不显著(P>0.05)(图1B)。

以上结果表明高脂日粮可以诱导小鼠肥胖。

2.2 高脂日粮对小鼠组织重量的影响为了探明导致高脂饲喂小鼠体重升高的原因，对小鼠进行解剖发现，HFD组小鼠的iWAT、eWAT与BAT明显增大，但Liver无差别(图2A)。

HFD组小鼠体重极显著高于LFD组(P<0.01)(图2B)，Liver重量差异不显著(P>0.05)(图2C)。

HFD组小鼠iWAT、eWAT与BAT的重量显著高于LFD组(P<0.05)(图2D)，对小鼠进行脂肪重/体重的检测发现，HFD组iWAT与eWAT占体重比值均显著高于LFD组(P<0.05)(图2E)。

由此可见，高脂日粮可使小鼠不同部位脂肪组织重量均增加。

图1 高脂日粮对小鼠体重和采食量的影响Fig.1 Effects of high-fat diet on body weight and food intake in mice图2 高脂日粮对小鼠组织重量的影响Fig.2 Effect of high-fat diets on tissue weight in mice2.3 高脂日粮对小鼠不同组织细胞形态的影响为进一步探明高脂日粮使脂肪组织重量增加的原因，本研究制作了iWAT、eWAT、BAT和Liver组织的冰冻切片，并对其进行HE染色。

结果显示，与LFD组相比，HFD组iWAT、eWAT、BAT脂滴明显变大(图3A)，且HFD组iWAT、eWAT、BAT与Liver的细胞面积极显著高于LFD组(P<0.01)(图3B)。

2.4 高脂日粮对小鼠不同组织成脂、棕脂及脂解标志基因的影响为深入研究高脂日粮诱导肥胖的分子基础，检测了小鼠iWAT、eWAT、BAT和Liver中的成脂分化标志基因(PPARγ、ap2)、脂解标志基因(ATGL、HSL)和棕脂标志基因(UCP1、PRDM16、PGC1α、Cidea)的表达情况。

结果显示，HFD组eWAT中成脂分化标志基因PPARγ和ap2的表达显著降低(P<0.05)；BAT中，PPARγ的表达显著降低(P<0.05)，而ap2显著升高(P<0.05)(图4A)。

HFD组中eWAT中HSL表达显著下调(P<0.05)(图4B)。

HFD组，iWAT中，UCP1、Cidea表达显著降低(P<0.05)；eWAT中，UCP1、PGC1α、Cidea表达显著降低(P<0.05)；而BAT中，PGC1α表达显著升高(P<0.05)；但是在Liver中，UCP1、PGC1α、Cidea表达显著升高(P<0.05)(图4C)。