细胞色素C氧化酶亚基Cox4的克隆及高效表达
DNA条形码技术在生物分类学鉴定中的应用
四、DNA条形码的操作及分析方法
DNA条形码的操作过程与分子生物学实验类似包括采集材料并提取DNA、利用通用引物PCR扩增目的片段、纯化PCR产物、序序列测定与分析以及提交结果到相关数据库 条形码的应用目标是所有物种并且每个物种需要多份材料采集材料时应以传统的形态分类学知识为依据尽可能地涵盖传统分类学中的变异式样 通常认为每个物种至少需要10份材料并最好包括5个不同居群
2004年由Alfred Sloan 基金会赞助在美国华盛顿特区举办了一个关于DNA 条形码的大型研讨会此次会议创立了生命条形码联盟CBOLthe Consortium for the Barcode of Life 生命条形码联盟阐述了DNA条形码的优点： 1以DNA序列为检测对象生物的DNA是由遗传信息决定的因此同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的即使经过加工形态发生变化DNA序列信息不会改变较之传统的方法扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果 2可进行非专家物种鉴定只要设计一套简单的实验方案经过简单培训的技术员即可操作
序列分析 生物条形码工程的首要目标是建立可用来作为鉴定标本工具的基因序列数据库目前只建立了动物条形码数据库植物条形码尚处于评估阶段只有该技术在植物中进一步完善后才有可能建立相应的数据库 序列数据分析是DNA条形码探索的最重要环节由于植物的种间杂交现象比较普遍因此植物条形码的分析方法也处于不断的摸索中
2003年加拿大圭尔夫大学University of GuelphPaul Hebert教授提出了DNA条形码概念将条形码技术引入生物界其思想产生于现代商品零售业的条形编码系统将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入利用A、T、C和G 4个碱基在基因中的排列顺序识别物种他们把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码DNA barcodes并提出为全球生物编码的计划 Paul Hebert教授率先于2003年选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基Icytochrome c oxidase subunit 1c01作为动物中通用的物种鉴定标记并提出DNA条形码的定义：通过使用短的标准DNA片段对物种进行快速、准确的识别和鉴定 Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1Cytochrome coxdase ICO I基因序列比较分析发现98%的物种遗传距离差异在种内为0%-2%种间平均可达到11.3%据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种 目前DNA条形码技术在很多动物分类群中得到了成功应用
植物细胞核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA的比较
植物细胞核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA的比较近年来，随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，叶绿体DNA和线粒体DNA 的研究有了长足的进步。
植物一般都有三套遗传信息指导它的整个生命活动，即核染色体DNA(nDNA)、叶绿体DNA(cpDNA)和线粒体DNA(mtDNA)，它们在组织结构、遗传方式、表达调控等方面互有差别，又协同作用共同控制着植物的生长和发育。
1 组织结构植物细胞的大部分DNA是在核内，并与组蛋白稳定结合组成染色体，控制着大部分性状，起着主导作用。
高等植物nDNA含量大约在0.5～200pg之间，不同植物相差很大。
植物nDNA中很大比例的胞嘧啶由5-甲基胞嘧啶取代，有40%～90%是由重复的DNA组成。
植物的大多数nDNA的浮力密度在1.69～1.71g/cm3范围内，G+C的含量为30%～51%左右。
在高等植物中，cpDNA一般以共价、闭合、环形双链(cccDNA)的形式存在，是多拷贝的。
cpDNA比nDNA和mtDNA有较强的保守性，其大小在各种植物中相近，一般在120～190kb之间。
它与nDNA不同，分子较小，不含有5-甲基胞嘧啶，而且不与组蛋白结合成复合体，是裸露的，容易复性，存在为数极少的重复顺序，与原核生物的DNA类似。
cpDNA的浮力密度约为1.697g/cm3，G+C的含量为36%～40%。
cpDNA在结构上最突出的特点是有一对22kb的反向重复顺序(inverted repeat sequence)，将环形的cpDNA分割成大单拷贝区和小单拷贝区。
植物mtDNA较大，大小范围为200～2500kb，其复杂性远大于其它生物，在同一科植物中(如葫芦科)基因组大小差异可达7～8倍。
植物mtDNA通常呈环状，是双链的。
植物mtDNA的浮力密度约1.706g/cm3，这相当于大约47%的G+C。
大多数植物mtDNA具有多基因组结构，由一个主基因组和通过重组由它衍生的一系列大小不同的分子组成。
细胞色素氧化酶亚基 1基因
细胞色素氧化酶亚基 1基因英文回答：Cytochrome c oxidase subunit 1 is a protein that in humans is encoded by the COX1 gene. It is a subunit of cytochrome c oxidase, a multi-subunit enzyme complex that catalyzes the reduction of oxygen to water in the final step of the respiratory chain. COX1 is a nuclear-encoded protein that is synthesized in the cytoplasm and then imported into the mitochondrion, where it is assembled into the cytochrome c oxidase complex. Mutations in the COX1 gene can lead to a variety of mitochondrial disorders, including cytochrome c oxidase deficiency and Leigh syndrome.中文回答：细胞色素氧化酶亚基 1基因是人类 COX1 基因编码的一种蛋白质。
它是细胞色素氧化酶的一个亚基，细胞色素氧化酶是一种多亚基酶复合物，在呼吸链的最后一步催化氧还原为水。
COX1 是一种核编码蛋白，在细胞质中合成，然后导入线粒体，在那里组装成细胞色素氧化酶复合物。
COX1 基因的突变会导致多种线粒体疾病，包括细胞色素氧化酶缺陷和 Leigh 综合征。
以下是该蛋白质的一些其他详细信息：名称，细胞色素氧化酶亚基 1。
基因，COX1。
染色体位置，11p15.5。
阿尔兹海默症发病相关蛋白互作网络构建 与通路分析
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2018, 8(2), 16-26Published Online April 2018 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2018.82003Protein-Protein-Interaction Networkand Pathway Analysis Relatedto Alzheimer’s DiseaseYuchen Xu1, Lin Wei2, Honglei Li31Department of Neurology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha Hunan2Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha Hunan3Department of Otorhinolaryngology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha HunanReceived: Mar. 21st, 2018; accepted: Apr. 2nd, 2018; published: Apr. 9th, 2018AbstractAlzheimer’s disease (AD) is one of the most common neurodegenerative disease, and its pathoge-nesis is not fully understood. This article derives transcriptome data of patients with AD from the Gene Expression database GEO (Gene Expression Omnibus), through which we obtain the AD-related risk gene set. Based on AD risk gene set, we construct a protein-protein-interaction network of AD. At the same time we used functional enrichment analysis and path analysis to ex-plore the biological processes and signal pathway involved in AD. Our work helps to elucidate the pathogenic mechanism of AD and provide guidance to the future prevention and treatment of AD.KeywordsAlzheimer’s Disease, Protein-Protein-Interaction Network, Functional Enrichment Analysis阿尔兹海默症发病相关蛋白互作网络构建与通路分析徐煜宸1，魏琳2，李泓磊31中南大学湘雅医院神经内科，湖南长沙2中南大学湘雅医学院，湖南长沙3中南大学湘雅三医院耳鼻喉科，湖南长沙收稿日期：2018年3月21日；录用日期：2018年4月2日；发布日期：2018年4月9日徐煜宸 等摘要阿兹海默症(Alzheimer’s diseas, AD)是最常见的神经退行性疾病，其发病机制尚未完全明确。
遗传学归纳2
医学遗传学归纳2医学遗传学归纳2 (1)第七章线粒体疾病的遗传 (1)第八章人类染色体 (3)第九章染色体畸变 (5)第十章单基因遗传病 (6)第十二章线粒体疾病 (10)第十三章染色体病 (11)第十四章免疫缺陷 (14)第十五章出生缺陷 (15)第十七章遗传病的诊断 (16)第十九章遗传咨询 (17)第七章线粒体疾病的遗传1、线粒体基因组：线粒体内含有DNA分子，被称为人类第25号染色体，是细胞核以外含有遗传信息和表达系统的细胞器，其遗传特点表现为非孟德尔遗传方式，又称核外遗传。
2、线粒体基因组结构特点①全长16569bp；②不与组蛋白结合的裸露闭环双链状，内重链外轻链；③重链（H链）富含鸟嘌呤，轻链（L链）富含胞嘧啶。
3、线粒体DNA组成（一）mtDNA分为编码区与非编码区；（二）编码区排列极为紧凑，部分区域重叠，无启动子和内含子，缺少终止密码子，仅以U或UA结尾；（三）非编码区（D 环）包含H链复制起始点、H链和L链的启动子，以及四个保守序列；（四）mtDNA有37个基因，其中13个编码线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）酶复合体的亚基，即与线粒体的氧化磷酸化功能有关。
①3个编码细胞色素c氧化酶复合体催化活性中心的亚单位（COXⅠ、COX Ⅱ和COXⅢ）；②2个编码ATP合酶复合体2个亚基（A6和A8）；③7个编码NADH-CoQ还原酶复合体的亚基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6）；④1个编码细胞色素b的亚基4、线粒体是一种半自主细胞器，受线粒体基因组和核基因组两套遗传系统共同控制。
5、线粒体基因组复制（一）特点：①半保留复制；②H链复制的起始点（O H）与L链复制起始点（O L）相隔2/3个mtDNA；③复制起始于L链的转录启动子；（二）复制方式包括D环复制、θ复制、滚环复制（三）D环复制：首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。
膜蛋白FKBP38病理生理功能研究进展
膜蛋白FKBP38病理生理功能研究进展Research Progress of Pathophysiological Functions of Membrane Protein FKBP38尚画雨1，夏志2*SHANG Huayu 1，XIA Zhi 2*摘要：FKBP38亦称FKBP8，在诸多方面均体现其为FK506结合蛋白家族的一个特殊成员，仅FKBP38具有对钙调蛋白的调节活性。
FKBP38活化还可通过抑制抗凋亡Bcl-2参与凋亡信号传导。
研究表明，除在程序性细胞死亡中的作用外，FKBP38还发挥对诸多差异显著的细胞过程的调控作用，而这些过程不完全依赖其FKBP 结构域。
FKBP38的生物学功能包括调节蛋白激酶mTOR 、介导线粒体自噬、调节细胞缺氧反应以及丙型肝炎病毒复制等。
因此，FKBP38的药理学靶向作用研究极可能是一种有效干预对FKBP38不同依赖性过程（如癌症或神经退行性疾病的程序性细胞死亡）的策略。
关键词：FK506结合蛋白38；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；细胞凋亡；线粒体自噬；病毒复制Abstract:FKBP38,also known as FKBP8,which is a special member of the FK506binding protein family in many aspects.Only FKBP38has calmodulin-regulated activity in this protein family.The activation of FKBP38also participates in apoptotic signal transduction by inhibiting the anti-apoptotic Bcl-2.It has been shown that besides the above-mentioned programmed cell death,FKBP38also plays a regulatory role in many distinct cell processes,which do not depend entirely on the FKBP domain.The biological functions of FKBP38include regulation of the ki ‐nase mTOR,regulation of mitophagy,regulation of cellular hypoxia response and hepatitis C vi ‐rus replication.Therefore,the pharmacological targeting effect of FKBP38may be an effective strategy to intervene in different dependent processes of FKBP38,such as programmed cell death in cancer or neurodegenerative diseases.Keywords:FKBP38;mTOR;apoptosis;mitophagy;viral replication中图分类号中图分类号：G804.7文献标识码文献标识码：AFKBP38属于FK506结合蛋白（FKBPs ）家族，该蛋白家族成员作为肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIase ），可通过不同的生物活性而调节底物蛋白，故被视为蛋白质折叠/转换的重要限速环节（Edlich et al.，2006a ）。
【人卫版医学遗传学】线粒体遗传（可编辑）
第七章线粒体疾病的遗传几乎每个人体细胞中都含有数以百计的线粒体，每个线粒体内膜上富含5种具有传递电子功能的酶复合体，组成呼吸链-氧化磷酸化系统，将代谢过程中产生的电子通过连锁反应逐步传递给氧并将质子从线粒体基质转移到膜间腔，形成跨内膜的质子梯度，复合物Ⅴ（ATP合酶）利用质子顺浓度回流到基质中所产生的势能，使ADP磷酸化生成ATP，为细胞提供进行各种生命活动所需要的能量。
线粒体内还含有DNA 分子，被称为人类第25号染色体，是细胞核以外含有遗传信息和表达系统的细胞器，其遗传特点表现为非孟德尔遗传方式，又称核外遗传。
1981年Anderson 等人完成了人类线粒体基因组的全部核苷酸序列的测定，1988年，Wallace等发现Leber视神经病的发生与线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变有关。
近年来，人们发现线粒体不仅在细胞的生长代谢中起重要作用，而且mtDNA突变是许多人类疾病的重要病因。
第一节人类线粒体基因组 mtDNA编码线粒体中部分蛋白质和全部的tRNA、rRNA，能够独立进行复制、转录和翻译，但所含信息量小，呼吸链-氧化磷酸化系统的80多种蛋白质亚基中，mtDNA仅编码13种，绝大部分蛋白质亚基和其他维持线粒体结构和功能的蛋白质都依赖于核DNA （nuclear DNA，nDNA）编码，在细胞质中合成后，经特定转运方式进入线粒体。
此外，mtDNA基因的表达受nDNA的制约，线粒体氧化磷酸酶化系统的组装和维护需要nDNA和mtDNA的协调，二者共同作用参与机体代谢调节，因此线粒体是一种半自主细胞器，受线粒体基因组和核基因组两套遗传系统共同控制（图7-1），nDNA与mtDNA基因突变均可导致线粒体中蛋白质合成受阻，细胞能量代谢缺陷。
图7-1 mtDNA与nDNA的协同作用一、线粒体基因组线粒体基因组是人类基因组的重要组成部分，全长16569bp，不与组蛋白结合，呈裸露闭环双链状，根据其转录产物在CsCl中密度的不同分为重链和轻链，重链（H链）富含鸟嘌呤，轻链（L链）富含胞嘧啶。
细胞的能量代谢
电子传递链
• 氢原子以质子的形式脱下，其电子沿一系列按一 定顺序排列的电子传递体转移，最后转移给分子 氧，后者再与质子生成水，这个电子传递体系称 为电子传递呼吸链（electron transport respiratory chain一系列的氢传递体和电子传递体 组成。包括：
线粒体与细胞的 能量转换
Mitochondrion &
Energy Conversion
线粒体蛋白质的转运
• 线粒体的蛋白合成能力有限，大量线粒体 蛋白在细胞质中合成，在分子伴侣帮助下 定向转运到线粒体。
线粒体定位
基质
内膜 膜间腔 外膜
部分核编码的线粒体蛋白
蛋白质
乙醇脱氢酶（酵母） 氨甲酰磷酸合酶（哺乳动物） 柠檬酸合酶（citrate synthase）与其他柠檬酸酶 DNA聚合酶 F1ATP酶亚单位α（除植物外）β、γ、δ（某些真菌） Mn2+超氧物岐化酶 鸟氨酸转氨酶（哺乳动物） 鸟氨酸转氨甲酰酶（哺乳动物） 核糖体蛋白质 RNA聚合酶
• 线粒体内的分子伴侣协助穿膜完成。
•若蛋白定位于基质以外
•定位后恢复天然构象
的区域，则除MTS外还 需要不同的定位信号。
定位于膜间隙
• 需要膜间隙导入序列 （intermembrane spacetargeting sequence, ISTS）
定位于外/内膜
• 进入外膜的蛋白 （孔蛋白）具有 不被切除的信号 序列，还有疏水 性序列作为停止 转运序列，然后 被定位到外膜上。
Pathway Glycolysis CoA
Substrate-Level Phosphorylati on
Oxidative
Total
Phosphorylation
线粒体标志分子COXIV和HSP60在肝癌的表达分析及功能研究.pdf
论文编号：硕士学位论文线粒体标志分子COX IV和HSP60在肝癌的表达分析及功能研究学号2192011203培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类) 临床医学二级学科(专业) 影像医学与核医学(介入)研究方向肝癌线粒体相关研究二O一四年五月目录缩略语表 (1)中文摘要 (2)英文摘要 (5)前言 (9)文献回顾 (10)第一部分COX IV在肝癌表达的研究及与预后的相关性分析 (18)1材料 (18)2方法 (20)3.结果 (24)4.讨论 (30)第二部分HSP60在肝癌中的表达分析及功能研究 (32)1材料 (32)2方法 (33)3结果 (47)4讨论 (55)小结 (57)参考文献 (58)缩略语表缩略词英文全称中文全称COX IV Cytochrome c oxidase subunit IV 细胞色素c氧化酶亚单位IV COX Cytochrome c oxidase 细胞色素c氧化酶HSP HSP60 Heat Shock ProteinHeat Shock Protein 60热休克蛋白热休克蛋白60ATP adenosine triphosphate 三磷酸腺苷PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应siRNA Small interfering RNA 小干扰RNA HSTF Heat transcription factor 热休克转录因子AFP α-fetal protein 甲胎蛋白HSE heat shock element 热休克元素IHC Immunohistochemistry免疫组织化学技术EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸HCC Hepatocellular carcinoma 肝细胞癌线粒体标志分子COX IV和HSP60在肝癌的表达分析及功能研究中文摘要关键词：COX IV，HSP60，肝癌，表达，预后，功能肝癌是居全球第三位、居我国第二位的癌症死因，已成为我国公共卫生难题，严重危害我国国民身体健康。
洋葱AcSCL4的克隆及其功能分析
第52卷 第2期2024年2月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .2F e b .2024网络出版时间:2023-08-22 09:39 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.02.014网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.s .20230821.1047.001洋葱A c S C L 4的克隆及其功能分析[收稿日期] 2022-11-04[基金项目] 黑龙江省重点研发计划项目(G A 21B 012);黑龙江省自然科学基金联合引导项目(L H 2020C 012) [作者简介] 张 旭(1998-),女,黑龙江七台河人,在读硕士,主要从事洋葱分子育种研究㊂E -m a i l :z h a n g x v 1031@163.c o m [通信作者] 秦 蕾(1986-),女,山东莱芜人,讲师,博士,主要从事洋葱发育分子调控研究㊂E -m a i l :q i n l e i @n e a u .e d u .c n王 勇(1971-),女,黑龙江甘南人,教授,博士,硕士生导师,主要从事蔬菜分子育种及生物技术研究㊂E -m a i l :y o n g w a n g@n e a u .e d u .c n 张 旭a ,b ,吴小旭a ,b ,张智慧a ,b ,胡云捷a ,b,秦 蕾a ,b ,王 勇a ,b (东北农业大学a 农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,b 园艺园林学院,黑龙江哈尔滨150030)[摘 要] ʌ目的ɔ初步探讨A c S C L 4在洋葱成花中的功能,为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础㊂ʌ方法ɔ以长日生态型洋葱品系S B 2为试验材料,根据已有的洋葱转录组数据,通过q R T -P C R 筛选目的基因A c S C L 4后进行基因克隆,并对其进行生物信息学分析;构建A c S C L 4基因的过表达载体p B 221-3300-A c S C L 4并转化农杆菌,采用花序浸染法浸染拟南芥,并对T 3代纯系转基因植株进行表型分析和开花相关基因表达量分析㊂ʌ结果ɔ洋葱A c S C L 4基因C D S 长1515b p,编码504个氨基酸;A c S C L 4蛋白N 端高度变异,C 端有G R A S 结构域㊂聚类分析发现,A c S C L 4与石刁柏和棉花的S C L 4蛋白亲缘关系较近㊂与野生型拟南芥相比,A c S C L 4过表达植株表现晚花表型㊂荧光定量P C R 结果表明,与野生型拟南芥相比,A c S C L 4过表达植株开花调控基因C O 和F T 的表达量极显著下降㊂ʌ结论ɔA c S C L 4通过调控C O 及F T 基因表达来抑制洋葱开花㊂[关键词] 洋葱;A c S C L 4;基因克隆;开花调控[中图分类号] S 633.203.3[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)02-0127-08C l o n i n g a n d f u n c t i o n a n a l ys i s o f A c S C L 4i n o n i o n Z H A N G X u a ,b,WU X i a o x u a ,b ,Z H A N G Z h i h u i a ,b,HU Y u n j i e a ,b ,Q I N L e i a ,b ,WA N G Y o n ga ,b(a K e y L a b o r a t o r y o f B i o l o g y a n d G e n e t i c I m p r o v e m e n t o f H o r t i c u l t u r a l C r o p s (N o r t h e a s t R e gi o n ),M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s ,b C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e a n d L a n d s c a pe A r c h i t e c t u r e ,N o r t h e a s t A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,H a r b i n ,H e i l o n g j i a n g 150030,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e f u n c t i o n o f A c S C L 4i n f l o w e r i n g w a s p r e l i m i n a r i l y st u d i e d t o p r o v i d e b a s i s f o r u n d e r s t a n d i n g m o l e c u l a r r e g u l a t i o n m e c h a n i s m o f o n i o n f l o w e r i n g r e gu l a t i o n .ʌM e t h o d ɔA c S C L 4w a s i d e n t i f i e d b y q R T -P C R a n d b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s b a s e d o n t h e t r a n s c r i p t o m e d a t a o f a l o n g -d a y on i o n i n -b r e d l i n e S B 2.T h e A c S C L 4o v e r e x pr e s s i o n v e c t o r p B 221-3300-A c S C L 4w a s c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f o r m e d t o A r a b i d o p s i s b y A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s .H o m o z y g o u s A r a b i d o p s i s t r a n s g e n i c l i n e s (T 3)w e r e u s e d f o r f u r t h e r p h e n o t y p i c c h a r a c t e r i z a t i o n a n d g e n e s e x pr e s s i o n i d e n t i f i c a t i o n .ʌR e s u l t ɔT h e c D N A o f A c S C L 4g e n e w a s 1515b p an d e n c o d e d 504a m i n o a c i d s .A c S C L 4h a d c o n s e r v e d G R A S d o m a i n a t t h e C t e r m i n u s a n d w a s h i g h l y v a r i a b l e a t t h e N t e r m i n u s .A c S C L 4w a s p h y l o g e n e t i c a l l y c l o s e r t o t h e S C L 4o f A s p a r a gu s o f f i c i n a l i s a n d G o s s y pi u m h i r s u t u m .O v e r e x p r e s s i o n o f A c S C L 4d e l a y e d t h e f l o w e r i n g t i m e o f w i l d -t y p eA r a b i d o p s i s.T h e e x p r e s s i o n s o f C O a n d F T w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n A c S C L4o v e r e x p r e s s i o n t r a n s-g e n i c l i n e s.ʌC o n c l u s i o nɔA c S C L4s u p p r e s s e d f l o w e r i n g b y r e g u l a t i n g C O a n d F T e x p r e s s i o n s.K e y w o r d s:o n i o n;A c S C L4;g e n e c l o n i n g;f l o w e r i n g r e g u l a t i o n开花是植物由营养生长向生殖生长转变的标志,对植物的生殖繁衍和器官形成具有重要意义㊂对拟南芥等模式植物的研究表明,植物开花由多条信号途径调控,包括光周期途径㊁春化途径㊁自主开花途径和赤霉素途径[1]㊂这些途径既独立又相互联系,共同构成了植物开花的调控网络,并通过激活下游开花调控子F L OW E R I N G L O C U S T(F T)㊁S U P P R E S S O R O F O V E R E X P R E S S S I O N O F C O N S T A N S1(S O C1)和L E A F Y(L F Y)的表达,促进植物开花[2-4]㊂植物各开花调控途径中核心调控途径是赤霉素途径㊂赤霉素(G A)是重要的植物激素,在促进种子萌发和茎伸长㊁延缓植物衰老及在植物成花中发挥关键作用㊂赤霉素途径是指植物仅仅通过G A诱导开花,而不需要春化途径和光周期途径的调控[5]㊂G A 可以促进拟南芥[6]㊁水稻[7]和白菜[8]等植物开花,也可以抑制玫瑰[9]等植物开花㊂赤霉素信号的起源与D E L L A中N端结构域G I B B E R E L L I N I N S E N S I-T I V E DWA R F1(G I D1)是G A受体蛋白有关[10]㊂在D E L L A蛋白(D E L L A s)中,G A I和R G A是营养生长和花诱导过程中主要的赤霉素抑制因子[11]㊂G R A S家族是植物体中一类重要的转录因子,广泛参与植物的生长发育㊂拟南芥G R A S家族被分为8个分支,分别为H AM㊁S C R㊁S H R㊁S C L3㊁S C L4/7㊁P A T1㊁D E L L A和S C L9[12]㊂在G R A S家族中, D E L L A和S C L3亚家族均与G A信号转导相关[12-13],其中D E L L A蛋白抑制赤霉素信号的传导[14],而S C L3是赤霉素信号的正调控因子[15]㊂S C L是以S C R为原型新发现的基因家族[16]㊂研究发现,S C L蛋白在C端较为保守,而在N端高度变异,导致其功能存在多样性[17]㊂因此,S C L蛋白对植物的生长发育以及外界信号的响应具有调节作用[18]㊂洋葱属于百合科葱属,是典型的二年生植物,适宜的开花时间不仅能避免先期抽薹,还可以缩短育种年限㊂因此,人为调控开花对于指导农业生产具有重要意义㊂为了进一步探究洋葱G R A S家族成员S C L的功能,本研究筛选出在洋葱抽薹前后表达差异最为显著的S C L4基因,经N C B I比对,发现S C L4蛋白与石刁柏㊁铁皮石斛等5个物种的S C L4蛋白同源程度最高,故将其命名为A c S C L4;然后克隆其C D S全长,构建植物过表达载体并转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行表型分析,并结合转基因幼苗中开花相关基因C O㊁F T表达量的变化,探讨A c S C L4基因对开花的影响以及作用途径,初步明确G R A S家族在洋葱成花中的作用,为进一步了解洋葱成花调控的分子机制奠定基础㊂1材料与方法1.1试验材料供试材料为长日生态型洋葱品系S B2,由东北农业大学葱蒜课题组提供,种植于东北农业大学园艺站温室㊂野生型拟南芥为哥伦比亚生态型(C o l-0),由东北农业大学葱蒜课题组保存㊂利用质量分数10%的次氯酸钠溶液对拟南芥种子进行消毒,无菌水清洗后,将种子播种于固体M S培养基上,在4ħ冰箱避光放置2~3d后,放置于植物恒温培养箱中至长出2片真叶,移栽至营养土中㊂培养条件为8h黑暗(黑暗温度22ħ)㊁16h 光照(光照温度25ħ),相对湿度60%~65%㊂过表达载体p B221-3300㊁大肠杆菌D H5α和农杆菌G V3101,均由东北农业大学葱蒜课题组保存㊂1.2洋葱S C L s候选基因的确定及克隆基于东北农业大学葱蒜课题组前期发表的洋葱转录组数据[19],通过G e n e O n t o l o g y(G O)与K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s(K E G G)富集性分析进行基因功能分类注释,筛选出5个与开花调控相关的S C L s基因,并设计q R T-P C R特异引物(表1)㊂取洋葱抽薹前2d和抽薹后1d的幼嫩叶片,提取R N A,反转录为c D N A,利用q R T-P C R筛选参与开花调控的基因㊂反转录按照T O Y O B O的R e v e r T r a A c e q P C R R T M a s t e r M i x w i t h g D N A R e m o v e r说明书操作㊂q R T-P C R按照T O Y O B O 的T HU N D E R B I R D S Y B R q P C R M i x说明书操作,并采用2-ΔΔC t法计算各基因的相对表达量㊂根据荧光定量结果,选择抽薹前后表达差异最大的基因A c S C L4作为目的基因,设计基因克隆引物(A c S C L4-S/X),以抽薹前洋葱叶片c D N A为模版,通过P C R扩增获得目的片段,将成功回收的片段连接到p E A S Y-T3载体,并送上海桑尼公司进行821西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷测序,获得A c S C L 4基因序列㊂试验所涉及到的引物序列见表1㊂表1 本研究所用引物信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o n o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e (5'ң3')作用F u n c t i o nA c A c t i n -FA C A C G G C C T G G A T A G C A A C A T洋葱内参O n i o n i n t e r n a l r e f e r e n c eA c A c t i n -RA G A G C A G T A T T C C C A A G C A T T β-t u b l u l i n -F G A T T T C A A A G A T T A G G G A A G A G T A 拟南芥内参A r a b i d o ps i s i n t e r n a l r e f e r e n c e β-t u b l u l i n -R G T T C T G A A G C A A A T G T C A T A G A G S C L 4-F T G G A A G A T G A T G A T G A A A G G G T Gq R T -P C R 筛选差异基因S c r e e n i n g d i f f e r e n t i a l g e n e s b y qR T -P C R S C L 4-R G T C A A C G C C A C G A G G A A A C T G S C L 6-FC G A G C T C T A A C T C C A C C C T G T C q R T -P C R 筛选差异基因S c r e e n i n g d i f f e r e n t i a l g e n e s b y qR T -P C R S C L 6-R G A T G G A A G G G A A A G T A G C A G G T T G S C L 9-F T G G C A G T A G C A G C A G T A T C G q R T -P C R 筛选差异基因S c r e e n i n g d i f f e r e n t i a l g e n e s b y qR T -P C R S C L 9-R C C A A G C A G G C A T A T T T T G G S C L 21-F C C A A C T A G C C A A A G T C C C G q R T -P C R 筛选差异基因S c r e e n i n g d i f f e r e n t i a l g e n e s b y qR T -P C R S C L 21-R G T T C A G C A C C G A A T A C C A C A S C L 32-F C C C A C C A T T A C T T A C T G T A C C C A T q R T -P C R 筛选差异基因S c r e e n i n g d i f f e r e n t i a l g e n e s b y qR T -P C R S C L 32-R A A C C A A C T C T G G C A G T T C A C G A c S C L 4-S G C T C T A G A A T G G C A T A C A T G T G C G C G A c S C L 4基因克隆G e n e c l o n i n g of A c S C L 4A c S C L 4-XC G A G C T C T C A A C G C C A C G A G G A A A C T G 1.3 A c S C L 4的生物信息学分析运用D N AMA N 进行同源序列比对㊂通过M E G A 5.2.2软件进行进化树分析㊂1.4 A c S C L 4过表达载体的构建及遗传转化利用双酶切法构建A c S C L 4的过表达载体㊂利用X b a I 和S a c I 分别对A c S C L 4和过表达载体pB 221-3300进行双酶切,回收酶切产物,用T 4连接酶连接,构建A c SC L 4基因的过表达载体p B 221-3300-A c S C L 4㊂将p B 221-3300-A c S C L 4重组质粒转化农杆菌G V 3101感受态细胞㊂使用转化成功的含过表达重组质粒的农杆菌甘油菌液在含抗生素(卡那霉素50μg /m L ㊁利福平50μg /m L )的Y E B 液体中活化(28ħ㊁200r /m i n 20h ),取活化后的菌液5m L 依次加入50m L 蒸馏水㊁1g 蔗糖㊁0.13g 1/2M S 和15μLS i l w e t L -77配成侵染液,采用花序浸染法[20]转化拟南芥植株,获转基因T 0代种子㊂将T 0代种子用含8.0m g/L 草铵膦(P P T )培养基筛选,获得转基因拟南芥植株(A c S C L 4-O E )㊂将蘸花后收获的种子进行K a n 抗性筛选,C T A B 法提取抗性植株D N A ,结合基因组P C R 验证获得T 1代转基因植株㊂收获T 1代转基因植株的种子,用相同的方法筛选获得3个T 3代纯系转基因拟南芥植株A c S C L 4-O E -1㊁A c S C L 4-O E -2和A c S C L 4-O E -3用于后续试验㊂1.5 转基因拟南芥的表型分析将T 3代纯系转基因拟南芥A c S C L 4-O E -1㊁A c S C L 4-O E -2㊁A c S C L 4-O E -3和野生型拟南芥同时播种,调查其抽薹时间㊁莲座叶数目等性状㊂每个株系10株,设置3次重复试验㊂1.6 转基因拟南芥开花相关基因的表达分析以T 3代纯系Ac S C L 4-O E 转基因拟南芥植株A c S C L 4-O E -1,A c S C L 4-O E -2,A c S C L 4-O E -3为材料,野生型(WT )作为对照,分别在8片真叶(抽薹开花前)时提取R N A ,q R T -P C R 检测转基因植株和对照的开花相关基因C O ㊁F T 的表达水平㊂每个株系5株,3次重复,混合取样,采用2-ΔΔC t 法计算基因的相对表达量㊂1.7 数据统计与分析应用S P S S 软件进行试验数据统计与分析,采用单因素方差分析进行差异显著性检验㊂采用G r a ph P a d P r i s m 9制作图表㊂2结果与分析2.1 洋葱S C L s 候选基因的确定基于东北农业大学葱蒜课题组前期发表的洋葱转录组数据[19],通过G R A S 结构域及基因功能分类注释,筛选出5个与开花调控相关的基因,分别为921第2期张 旭,等:洋葱A c S C L 4的克隆及其功能分析C L 831.C o n t i g 1㊁C L 10945.C o n t i g 1㊁C L 14122.C o n -t i g 1㊁U n i g e n e 26503和U n i g e n e 7592,为确定这些基因属于G R A S 家族的哪一个亚族,将其全长氨基酸序列与拟南芥G R A S 构建系统进化树㊂洋葱S C L s 的系统发育分析结果(图1)表明,C L 831.C o n t i g 1㊁U n i g e n e 26503㊁C L 10945.C o n t i g1㊁C L 14122.C o n t i g 1和U n i g e n e 7592分别与S C L s 各个亚族中的S C L 4㊁S C L 5㊁S C L 6㊁S C L 9和S C L 32亲缘关系较近,故将其依次命名为S C L 4㊁S C L 5㊁S C L 6㊁S C L 9和S C L 32㊂图1 洋葱S C L s 的系统发育分析F i g .1 P h y l o g e n e t i c a n a l ys i s o f S C L s i n o n i o n 5个S C L s 候选基因在洋葱抽薹前后的相对表达量如图2所示㊂由图2可知,S C L 4㊁S C L 9和S C L 32在洋葱抽薹前叶片中的表达量极显著或显著高于抽薹后叶片,差异倍数分别约为40,10和2倍;S C L 5在洋葱抽薹后叶片中的表达量极显著高于抽薹前,差异倍数约为5倍;S C L 6在洋葱抽薹前㊁后叶片中的表达量无显著差异㊂由图2还可知,S C L 4在洋葱抽薹前㊁后叶片中的表达量差异最为显著,且表达模式与开花抑制途径中的D E L L A 蛋白相似,故进一步研究其功能㊂31西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷*和**分别表示同一基因的表达量在抽薹前后差异显著(P <0.05)或差异极显著(P <0.01)*a n d **I n d i c a t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05)a n d e x t r e m e l y s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01)i n e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e s a m e g e n e b e f o r e a n d a f t e r b o l t i n g图2 洋葱S C L s 候选基因的相对表达量F i g .2 R e l a t i v e e x pr e s s i o n l e v e l s o f c a n d i d a t e g e n e s f o r S C L s i n o n i o n2.2 A c S C L 4的克隆及生物信息学分析根据q R T -P C R 结果,以A c S C L 4-S /X 为引物,洋葱抽薹前2d 叶片的c D N A 为模板,克隆获得A c S C L 4基因序列,其C D S 长1515b p,编码504个氨基酸㊂为明确A c S C L 4与其他物种S C L 4的蛋白结构域,通过B L A S T 比对分别获得5个不同作物的S C L 4氨基酸序列,采用D N AMA N 进行序列比对,发现其与石刁柏(A s p a r a g u s o f fi c i n a l i s ,A o -S C L 4,X P _020258852.1)㊁铁皮石斛(D e n d r o b i u mc a t e n a t u m ,D c S C L 4,X P _020701603.1)㊁棉花(G o s -s y pi u m h i r s u t u m ,G h S C L 4,X P _040936811.1)㊁油棕(E l a e i s g u i n e e n s i s ,E g S C L 4,X P _010936276.1)㊁生姜(Z i n g i b e r o f f i c i n a l e ,Z o S C L 4,X P _042444370.1)的S C L 4氨基酸序列同源性分别为74%,62%,77%,69%,48%㊂其中洋葱A c S C L 4与石刁柏和棉花的S C L 4氨基酸同源性较高㊂S C L 4蛋白在N 端只有部分序列保守,其他序列高度变异,C 端有G R A S 结构域(图3)㊂A c .洋葱;A o .石刁柏;D c .铁皮石斛;G h .棉花;E g.油棕;Z o .生姜㊂红色虚线标注G R A S 结构域A c .A l l i u m c e p a L .;A o .A s p a r a g u s o f f i c i n a l i s ;D c .D e n d r o b i u m c a t e n a t u m ;G h .G o s s y pi u m h i r s u t u m ;E g .E l a e i s g u i n e e n s i s ;Z o .Z i n g i b e r o f fi c i n a l e .R e d d o t t e d l i n e m a r k s G R A S s t r u c t u r e d o m a i n 图3 洋葱与其他植物的S C L 4氨基酸序列比对F i g .3 M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t o f S C L 4a m i n o a c i d s e qu e n c e o f o n i o n w i t h o t h e r p l a n t s 2.3 转基因(A c S C L 4-O E )拟南芥的表型分析将A c S C L 4在拟南芥中进行异源过表达,获得T 3代纯合转基因拟南芥株系Ac S C L 4-O E -1㊁A c -S C L 4-O E -2和A c S C L 4-O E -3,观察其表型(图4和图5)后发现,野生型拟南芥大约14片叶时抽薹开花(播种后28d 左右),而A c S C L 4-O E 抽薹开花时131第2期张 旭,等:洋葱A c S C L 4的克隆及其功能分析间较野生型晚7d左右,且莲座叶数较野生型极显著增加㊂说明A c S C L4抑制植物开花,使植株出现晚花表型㊂为了进一步探究A c S C L4的开花调控机理,以野生型拟南芥为对照,采用q R T-P C R法对转基因拟南芥A c S C L4-O E株系中的C O㊁F T表达量进行检测㊂结果(图6)发现,与野生型相比,在A c S C L4的过表达株系A c S C L4-O E中,C O㊁F T的表达量均极显著下调,说明A c S C L4可能通过抑制C O和F T的表达来抑制开花㊂图4 WT与A c S C L4-O E拟南芥植株状态F i g.4 P h e n o t y p e o f WT a n d A c S C L4-O E A r a b i d o p s i s t h a l i a n a**表示A c S C L4-O E与野生型差异极显著(P<0.01)㊂下图同**I n d i c a t e s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n A c S C L4-O E a n d w i l d t y p e(P<0.01).T h e s a m e b e l o w图5 WT与A c S C L4-O E拟南芥抽薹开花时间和莲座叶数表型比较F i g.5 F l o w e r i n g t i m e a n d r o s e t t e l e a v e s n u m b e r o f WT a n d A c S C L4-O E p l a n t s o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a图6 WT和A c S C L4-O E拟南芥中C O和F T基因的相对表达量F i g.6 R e l a t i v e e x p r e s s i o n s o f C O a n d F T i n WT a n d A c S C L4-O E p l a n t s o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a231西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷3讨论开花是植物由营养生长向生殖生长过渡的关键时期,对于植物的生殖繁衍和器官形成都非常重要㊂植物开花由多条信号途径调控,其中赤霉素途径在植物成花中发挥关键作用㊂赤霉素可以调控植物生长和发育的各个方面,包括种子萌发[21]㊁细胞扩张[22]㊁开花[23]等㊂G R A S是植物中特有的蛋白,广泛存在于植物体中,对植物的生长发育有重要的调节作用,包括信号转导㊁胁迫应答㊁分生组织形成等[24-25]㊂G R A S家族蛋白被认为是调控G A信号的主要角色[26-27],尤其是一些具有D E L L A结构域的蛋白可以调节G A信号反应[15,28]㊂G R A S家族中的D E L L A和S C L3蛋白均与G A信号转导过程相关㊂迄今为止,G R A S家族成员主要是通过拟南芥和水稻来表明转录调控因子参与植物发育的各个方面,而对于本研究的A c S C L4所属的S C L4/7亚家族,只有少数植物的功能被探究㊂在胡杨中过表达P e S C L7增强了拟南芥的耐旱以及耐盐能力, P e S C L7蛋白定位于植物细胞的细胞核[29]㊂核定位与大量证据表明,G R A S家族成员在转录调控中发挥重要作用[12,30]㊂因此依据转录组数据推测,同属于S C L4/7亚族的成员A c S C L4具备调控开花的功能,设计试验并进行功能验证㊂本研究以洋葱转录组数据库为依据,通过q R T-P C R筛选开花调控基因,并进一步阐释和丰富了G R A S亚家族S C L4/7的功能㊂通过对洋葱A c-S C L4的转基因拟南芥表型试验发现,A c S C L4对开花有抑制作用,A c S C L4基因过表达株系均表现出明显的晚花表型㊂在分析其开花机理时发现,与野生型拟南芥相比,A c S C L4过表达后C O㊁F T的表达量极显著下降,说明A c S C L4抑制开花可能是通过抑制C O㊁F T的表达来实现的㊂这一发现填补了S C L4在开花调控研究方面的空白㊂本研究初步探讨了A c S C L4在洋葱成花中的功能,为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础㊂[参考文献][1]朱芹芹,李忠爱,何艳霞,等.表观遗传与花期调控研究进展[J].园艺学报,2013,40(9):1787-1794.Z h u Q Q,L i Z A,H e Y X,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s s o n e p i g e n e-t i c a n d f l o w e r i n g-t i m e r e g u l a t i o n[J].A c t a H o r t i c u l t u r a l S i n i-c a,2013,40(9):1787-1794.[2]周琴,张思思,包满珠,等.高等植物成花诱导的分子机理研究进展[J].分子植物育种,2018,16(11):3681-3692.Z h o u Q,Z h a n g S S,B a o M Z,e t a l.A d v a n c e s o n m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f f l o r a l i n i t i a t i o n i n h i g h e r p l a n t s[J].M o l e c u l a r P l a n t B r e e d i n g,2018,16(11):3681-3692.[3] V a l v e r d e F,M o u r a d o v A,S o p p e W,e t a l.P h o t o r e c e p t o r r e g u l a-t i o n o f C O N S T A N S p r o t e i n i n p h o t o p e r i o d i c f l o w e r i n g[J].S c i e n c e,2004,303(5660):1003-1006.[4]曲雪亭,刘龙飚,张旸,等.花期调控中S O C1基因探究进展[J].分子植物育种,2022,20(5):1537-1547.Q u X T,L i u L B,Z h a n g Y,e t a l.E x p l o r a t i o n p r o c e s s o f S O C1g e n e i n f l o w e r i n g r e g u l a t i o n[J].M o l e c u l a r P l a n t B r e e d i n g,2022,20(5):1537-1547.[5]阎晋东.拟南芥F-b o x蛋白F K F1通过调控赤霉素信号控制开花的分子遗传学与生化分析[D].长沙:湖南大学,2020.Y a n J D.T h e m e c h a n i s m a n d b i o c h e m i c a l i n v e s t i g a t i o n o fc r o s s t a l k o f F-b o x p r o t e i n F K F1a nd G A p a t h w a y d u r i n g f l o r a li n i t i a t i o n i n A r a b i d o p s i s[D].C h a n g s h a:H u n a n U n i v e r s i t y,2020.[6] W i l s o n R N,H e c k m a n J W,S o m e r v i l l e C R.G i b b e r e l l i n i s r e-q u i r e d f o r f l o w e r i n g i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a u n d e r s h o r t d a y s [J].P l a n t P h y s i o l o g y,1992,100(1):403-408.[7] U e g u c h i-T a n a k a M,A s h i k a r i M,N a k a j i m a M,e t a l.G I B B E R-E L L I N I N S E N S I T I V E DWA R F1e n c o d e s a s o l u b l e r e c e p t o rf o rg i b b e r e l l i n[J].N a t u r e,2005,437(7059):693-698.[8]胡存彪,陈云飞,刘圣会,等.多效唑和赤霉素对结球白菜抽薹开花的调控[J].山地农业生物学报,2016,35(2):73-75.H u C B,C h e n Y F,L i u S H,e t a l.R e g u l a t i o n o f f l o w e r i n g t i m eo f C h i n e s e c a b b a g e b y p a c l o b u t r a z o l a n d g i b b e r e l l i n[J].J o u r-n a l o f M o u n t a i n A g r i c u l t u r e a n d B i o l o g y,2016,35(2):73-75.[9] E s h e d Y,L i p p m a n Z B.R e v o l u t i o n s i n a g r i c u l t u r e c h a r t a c o u r s ef o r t a rg e t e d b r e e d i n g o f o l d a n d n e w c r o p s[J].S c i e n c e,2019,366(6466):e a a x0025.[10] Z h o u B,L i n J Z,P e n g W S,e t a l.D w a r f i s m i n B r a s s i c a n a p u sL.i n d u c e d b y t h e o v e r-e x p r e s s i o n o f a g i b b e r e l l i n2-o x i d a s eg e n e f r o m A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J].M o l e c u l a r B r e e d i n g,2012,29(1):115-127.[11] M u t a s a-Göt t g e n s E,H e d d e n P.G i b b e r e l l i n a s a f a c t o r i n f l o r a lr e g u l a t o r y n e t w o r k s[J].J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l B o t a n y, 2009,60(7):1979-1989.[12] B o l l e C.T h e r o l e o f G R A S p r o t e i n s i n p l a n t s i g n a l t r a n s d u-c t i o n a nd de v e l o p m e n t[J].P l a n t a,2004,218(5):683-692.[13] W a n g H P,P a n J J,L i Y,e t a l.T h e D E L L A-C O N S T A N S t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r c a s c a d e i n t e g r a t e s g i b b e r e l l i c a c i d a n d p h o t o-p e r i o d s i g n a l i n g t o r e g u l a t e f l o w e r i n g[J].P l a n t P h y s i o l o g y, 2016,172(1):479-488.[14] W e n C K,C h a n g C R.A r a b i d o p s i s R G L1e n c o d e s a n e g a t i v er e g u l a t o r o f g i b b e r e l l i n r e s p o n s e s[J].T h e P l a n t C e l l,2002, 14(1):87-100.[15] Z h a n g Z L,O g a w a M,F l e e t C M,e t a l.S c a r e c r o w-l i k e3p r o-m o t e s g i b b e r e l l i n s i g n a l i n g b y a n t a g o n i z i n g m a s t e r g r o w t h r e-p r e s s o r D E L L A i n A r a b i d o p s i s[J].P r o c e e d i n g s o f t h e N a-t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f A m e r i c a,331第2期张旭,等:洋葱A c S C L4的克隆及其功能分析2011,108(5):2160-2165.[16] P y s h L D,W y s o c k a-D i l l e r J W,C a m i l l e r i C,e t a l.T h e G R A Sg e n e f a m i l y i n A r a b i d o p s i s:s e q u e n c e c h a r a c t e r i z a t i o n a n db a s ic e x p r e s s i o n a n a l y s i s o f t h e S C A R E C R OW-L I K E g e n e s[J].T h e P l a n t J o u r n a l,1999,18(1):111-119. [17]S h a n Z Y,L u o X L,W u M Y,e t a l.G e n o m e-w i d e i d e n t i f i c a-t i o n a n d e x p r e s s i o n o f G R A S g e n e f a m i l y m e m b e r s i n c a s s a v a[J].B M C P l a n t B i o l o g y,2020,20(1):46.[18]樊铸硼,罗兴录,单忠英,等.木薯S C A R E C R O W-L I K E(S C L)基因克隆㊁生物信息学及非生物胁迫下表达分析[J].南方农业学报,2020,51(8):1888-1895.F a n Z P,L u o X L,S h a n Z Y,e t a l.C l o n i n g,b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s a n d e x p r e s s i o n u n d e r ab i o t ic s t r e s s o f S C A R E-C R OW-L I K E(S C L)g e n e i n c a s s a v a[J].J o u r n a l o f S o u t h e r nA g r i c u l t u r e,2020,51(8):1888-1895.[19] Y u a n Q L,S o n g C,G a o L Y,e t a l.T r a n s c r i p t o m e d e n o v o a s-s e m b l y a n d a n a l y s i s o f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s r e l a t e dt o c y t o p l a s m i c m a l e s t e r i l i t y i n o n i o n[J].P l a n t P h y s i o l o g ya n d B i o c h e m i s t r y,2018,125:35-44.[20] C l o u g h S J,B e n t A F.F l o r a l d i p:a s i m p l i f i e d m e t h o d f o r A g r o-b ac t e r i u m-m ed i a te d t r a n sf o r m a t i o n o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J].T h e P l a n t J o u r n a l,1998,16(6):735-743. [21] L i m S,P a r k J,L e e N,e t a l.A B A-I N S E N S I T I V E3,A B A-I N-S E N S I T I V E5a n d D E L L A s i n t e r a c t t o a c t i v a t e t h e e x p r e s s i o no f S O MN U S a n d o t h e r h i g h-t e m p e r a t u r e-i n d u c i b l e g e n e s i ni m b i b e d s e e d s i n A r a b i d o p s i s[J].T h e P l a n t C e l l,2014,25(12):4863-4878.[22] B a i M Y,S h a n g J X,O h E,e t a l.B r a s s i n o s t e r o i d,g i b b e r e l l i na n d p h y t o c h r o m e i m p i n g e o n a c o mm o n t r a n s c r i p t i o n m o d u l ei n A r a b i d o p s i s[J].N a t u r e C e l l B i o l o g y,2012,14(8):810-817.[23] Y u S,G a l vão V C,Z h a n g Y C,e t a l.G i b b e r e l l i n r e g u l a t e s t h eA r a b i d o p s i s f l o r a l t r a n s i t i o n t h r o u g h m i R156-t a r g e t e dS Q U AMO S A p r o m o t e r b i n d i n g-l i k e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s[J].T h e P l a n t C e l l,2012,24(8):3320-3332.[24] B e n f e y P N,L i n s t e a d P J,R o b e r t s K,e t a l.R o o t d e v e l o p m e n ti n A r a b i d o p s i s:f o u r m u t a n t s w i t h d r a m a t i c a l l y a l t e r e d r o o tm o r p h o g e n e s i s[J].D e v e l o p m e n t,1993,119(1):57-70.[25] G a l l a g h e r K L,B e n f e y P N.B o t h t h e c o n s e r v e d G R A S d o m a i na n d n u c l e a r l o c a l i z a t i o n a r e r e q u i r e d f o r S H O R T-R O O Tm o v e m e n t[J].T h e P l a n t J o u r n a l,2009,57(5):785-797.[26] H i r s c h S,O l d r o y d G E D.G R A S-d o m a i n t r a n s c r i p t i o n f a c t o r st h a t r e g u l a t e p l a n t d e v e l o p m e n t[J].P l a n t S i g n a l i n g&B e-h a v i o r,2009,4(8):698-700.[27] R a m o s M L,A l t i e r i E,B u l o s M,e t a l.P h e n o t y p i c c h a r a c t e r-i z a t i o n,g e n e t i c m a p p i n g a n d c a n d i d a t e g e n e a n a l y s i s o f as o u r c e c o n f e r r i n g r e d u c e d p l a n t h e i g h t i n s u n f l o w e r[J].T h e-o r e t i c a l a n d A p p l i e d G e n e t i c s,2013,126(1):251-263. [28] W e s t o n D E,E l l i o t t R C,L e s t e r D R,e t a l.T h e P e a D E L L Ap r o t e i n s L A a n d C R Y a r e i m p o r t a n t r e g u l a t o r s o f g i b b e r e l l i ns y n t h e s i s a n d r o o t g r o w t h[J].P l a n t P h y s i o l o g y,2008,147(1):199-205.[29] M a H S,L i a n g D,S h u a i P,e t a l.T h e s a l t-a n d d r o u g h t-i n d u c-i b l e p o p l a r G R A S p r o t e i n S C L7c o n f e r s s a l t a n d d r o u g h t t o-l e r a n c e i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a[J].J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a lB o t a n y,2010,61(14):4011-4019.[30] L i W X,O o n o Y,Z h u J H,e t a l.T h e A r a b i d o p s i s N F Y A5t r a n s c r i p t i o n f a c t o r i s r e g u l a t e d t r a n s c r i p t i o n a l l y a n d p o s t-t r a n s c r i p t i o n a l l y t o p r o m o t e d r o u g h t r e s i s t a n c e[J].T h e P l a n tC e l l,2008,20(8):2238-2251.431西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷。
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苏明慧，汪一荣，杨艳梅，等．细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｃｏｘ４的克隆及高效表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１５）：３１－３４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１５．００８
细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｃｏｘ４的克隆及高效表达
苏明慧，汪一荣，杨艳梅，商巾杰（南京师范大学生命科学学院，江苏南京２１００４６）
摘要：Ｃｏｘ４是电子传递链上复合体Ⅳ的１个关键亚基，实现Ｃｏｘ４的高效表达以及制备其抗体，对于线粒体功能研究至关重要。根据裂殖酵母序列信息数据库（Ｓ．ｐｏｍｂｅ＿ＧｅｎｅＤＢ）中ｃｏｘ４的基因序列（登录号：ＳＰＡＣ１２９６．０２）设计引物，以粟酒裂殖酵母的ｃＤＮＡ序列为模板，通过ＰＣＲ扩增技术得到目标蛋白的基因，然后通过克隆构建到含有Ｔ７强启动子的表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）上，并将其转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１）中实现重组工程菌株的构建。结果表明，通过一系列条件优化实现了对重组工程菌株中Ｃｏｘ４的高效表达，并纯化得到大量相应蛋白，最后以纯化的蛋白为抗原成功制备了Ｃｏｘ４抗体。Ｃｏｘ４抗体的成功制备为粟酒裂殖酵母中线粒体功能研究奠定了基础。 关键词：线粒体；粟酒裂殖酵母；细胞色素Ｃ氧化酶；Ｃｏｘ４ 中图分类号：Ｑ７８５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１５－００３１－０３
收稿日期：２０１７－０３－１５基金项目：国家自然科学基金（编号：３１４０００３２）；江苏省高校自然科学研究项目（编号：１３ＫＪＢ１８００１０）。作者简介：苏明慧（１９９１—），女，河南周口人，硕士研究生，从事粟酒裂殖酵母线粒体蛋白结构与功能研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１５７９２５７４８４＠ｑｑ．ｃｏｍ。通信作者：商巾杰，博士，副教授，从事裂殖酵母中与人类疾病相关基因的结构和功能研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈａｎｇｊｉｎｊｉｅｙ＠１６３．ｃｏｍ。
线粒体有自己的基因组，是一种半自主性的细胞器［１－２］，几乎存在于所有真核生物中。线粒体能够进行氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）的合成，是有氧呼吸的主要场所［３－４］，可为细胞的生命活动提供能量，被称为细胞内的发动机［５］。同时，线粒体还参与调控细胞的信息传递、细胞的凋亡和细胞的分化等一系列生理过程，并且还对细胞生长和细胞周期进行调控［６］，因此，线粒体对细胞的生长至关重要［５］。氧化磷酸化是一个电子传递过程，依赖于线粒体的电子传递链。线粒体的电子传递链对于线粒体功能的正常发挥十分重要［７］，一旦电子传递链受损会引起很多疾病的发生［８－９］。在粟酒裂殖酵母中，电子传递链由４种复合体组成，而组成这些复合体的蛋白是由核基因组和线粒体基因组共同编码的。细胞色素Ｃ氧化酶（复合物Ⅳ）是线粒体中电子传递链的末端酶，催化电子从细胞色素Ｃ转移到氧［１０］，核编码的细胞色素Ｃ氧化酶亚基４（Ｃｏｘ４）是其中１个关键亚基。由此可见，在对线粒体功能进行研究时，不可避免地需要对线粒体中构成这些复合体的蛋白水平进行检测，因此制备这些蛋白的相应抗体就显得尤为重要。本研究主要是将粟酒裂殖酵母中构成复合体Ⅳ的细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｃｏｘ４在大肠杆菌中进行高效表达，并制备相应的抗体。１ 材料与方法１．１ 试验材料１．１．１ 菌株与质粒 粟酒裂殖酵母单倍体菌株ｙＨＬ６３８１［ｈ＋，组氨酸生物合成缺陷型（ｈｉｓ３－Ｄ１），亮氨酸生物合成缺陷型（ｌｅｕ１－３２），尿嘧啶生物合成缺陷型（ｕｒａ４－Ｄ１８），腺嘌呤生物合成缺陷型（ａｄｅ６－Ｍ２１０）］，由南京师范大学微生物所实验室保存。质粒ｐＥＴ－２８ａ（＋）为笔者所在实验室保存。１．１．２ 试剂 ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶、ＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ
（货号为６０２２）、蛋白ｍａｒｋｅｒ，购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡｍａｒｋｅｒ，购自北京全式金生物技术有限公司；ＤＮＡ割胶回收试剂盒、ＰＣＲ过柱纯化试剂盒，购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，简称ＳＤＳ）、琼脂粉、４－羟乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）、山梨醇（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、３－（Ｎ－吗啉基）丙磺酸（ＭＯＰＳ）、３０％丙烯酰胺和乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），购自索莱宝公司；酵母粉，购自ＯＸＯＩＤ公司；腺嘌呤、尿嘧啶、精氨酸、组氨酸、卡那霉素（Ｋａｎ），购自Ｓｉｇｍａ公司；ＲＮＡ提取试剂盒，ＯＭＥＧＡ（货号为Ｒ６８７０－００），购自南京贝纳生物技术有限公司；ｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成试剂盒（货号为１７０８８９０），购自南京润亚生物科技发展有限公司；ＰＣＲ引物，由南京思普金生物工程技术服务有限公司合成；常用试剂为分析纯级，购自国药集团化学试剂有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司。１．１．３ 培养基 （１）ＬＢ培养基配方（１００ｍＬ）：１ｇ胰蛋白胨，０．５ｇ酵母粉，１ｇ氯化钠，在固体培养基中添加２ｇ琼脂粉。（２）ＬＢ＋Ｋａｎ培养基：在ＬＢ培养基中添加卡那霉素至终浓度为５０ｍｇ／Ｌ。（３）ＹＥＳ培养基配方（１００ｍＬ）：３．０ｇ葡萄糖，０．５ｇ酵母粉，２２．５０ｍｇ腺嘌呤，２２．５０ｍｇ尿嘧啶，２２．５０ｍｇ亮氨酸，２２．５０ｍｇ组氨酸。１．２ 试验方法１．２．１ 引物的设计 根据裂殖酵母序列信息数据库（Ｓ．ｐｏｍｂｅ＿ＧｅｎｅＤＢ）中登录号为ＳＰＡＣ１２９６．０２的基因序列，通过ｈｔｔｐｓ：／／ｉｈｇ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｉｈｇ／ｍｉｔｏｐｒｏｔ．ｈｔｍｌ预测线粒体定位序列，将线粒体定位序列去掉后，设计上下游特异性引物，在正向引物的５′端加入ＮｄｅⅠ酶切位点，在互补链引物的５′端加入ＸｈｏⅠ酶切位点（下划线分别表示ＮｄｅⅠ、ＸｈｏⅠ酶切位点）：正向引物：５′－ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＣＣ－
—１３—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１５期３′；反向引物：５′－ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧ－３′。１．２．２ ＰＣＲ片段扩增 取用ＹＥＳ培养过夜的粟酒裂殖酵母１．５ｍＬ，离心收集菌体。按照ＯＭＥＧＡ的说明书提取总ＲＮＡ，然后加入反转录酶，以随机六聚体为引物合成ｃＤＮＡ，然后以此ｃＤＮＡ为模板，用ＳＰＡＣ１２９６．０２的特异性引物进行扩增，扩增条件如下：９５℃２ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３２个循环；７２℃１０ｍｉｎ，４℃保存。扩增产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测。将ＰＣＲ片段用ＰＣＲ过柱纯化试剂盒进行纯化。１．２．３ 原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）／ｃｏｘ４ｐ的构建 把纯化后的ＰＣＲ片段与ｐＥＴ－２８ａ（＋）载体进行ＮｄｅⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切，回收纯化双酶切后的产物，将两者按合适配比加入到酶连反应体系内，１６℃连接过夜；将酶连产物转到大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞中，涂布到含有Ｋａｎ抗性的ＬＢ固体培养基上，３７℃培养过夜，挑取菌落ＰＣＲ呈阳性的转化子于ＬＢ＋Ｋａｎ的液体培养基中，３７℃振荡培养１０ｈ，通过碱裂解法提取重组质粒，经ＮｄｅⅠ、ＸｈｏⅠ双酶切初步鉴定后，由南京思普金生物技术有限公司完成测序。将测序正确的重组质粒转入到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１感受态细胞中，得到重组表达菌株。１．２．４ 目的蛋白的表达 将重组表达菌接种到５ｍＬ含有５０ｍｇ／ＬＫａｎ的ＬＢ液体培养基中，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜，将重组表达菌分别转接到２管１５ｍＬ含有５０ｍｇ／ＬＫａｎ的ＬＢ液体培养基中，使其Ｄ６００ｎｍ≈０．２，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ继续振荡培养至Ｄ６００ｎｍ≈０．６，此时向其中１管菌液中加入１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，简称ＩＰＴＧ），于３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜。次日，于４℃、８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，收集菌体，之后用１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液（ｐＨ值为７．０）将菌体重悬，重复洗涤３次后，加入适量缓冲液［含０．１ｍｍｏｌ／Ｌ苯甲基磺酰氟（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ，简称ＰＭＳＦ）和１４．３ｍｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇］，将其置于冰浴中进行超声波破碎，破碎１０ｓ，冷却１０ｓ，待菌体完全破碎后，于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集细胞上清，取适量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，简称ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），以分析目标产物的表达情况。１．２．５ 目的蛋白的纯化 重组表达菌破碎完全后，于１６０００ｇ、４℃离心３０ｍｉｎ，将上清转移至新的１．５ｍＬ离心管中。向上清中加入组氨酸标签蛋白纯化试剂盒（Ｎｉ－ＮＴＡ柱），根据Ｎｉ－ＮＴＡ柱的吸附度来决定上清蛋白样品中需要加入的Ｎｉ－ＮＴＡ体积。在４℃低温冰箱中，用垂直混匀器匀速转动离心管２～４ｈ，确保目的蛋白与Ｎｉ－ＮＴＡ柱充分接触并结合，２～４ｈ后，１０００ｇ、４℃离心２ｍｉｎ，小心地将上清转移到另１支新的１．５ｍＬ离心管中（该上清中含有未与Ｎｉ－ＮＴＡ柱结合的蛋白），用ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗涤２～５次离心下来的Ｎｉ－ＮＴＡ柱，保留洗液，该步的目的是去除没有与Ｎｉ－ＮＴＡ柱结合或者与Ｎｉ－ＮＴＡ柱结合不牢固的蛋白。再用ＥｌｕｔｅＢｕｆｆｅｒ对Ｎｉ－ＮＴＡ柱进行洗脱，可将与Ｎｉ－ＮＴＡ柱结合的目的蛋白洗脱下来。洗脱液的体积按照加入的Ｎｉ－ＮＴＡ柱的体积换算，洗涤３次，洗涤得到的溶液主要含有所纯化的目的蛋白。将目标蛋白洗脱液置于截留量为３５００ｕ的透析袋中对蛋白进行透析，透析液为１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液（ｐＨ值为６．８），经过３次换液后，将得到的蛋白液吸出并加入１．５ｍＬ离心管中，这些蛋白样品可进行对照试验。取适量透析后的蛋白样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，以检测目的蛋白的纯化程度。１．２．６ 抗体的制备与检测 将纯化得到的蛋白作为抗原送巴傲得生物科技有限公司制备相应的抗体，然后提取粟酒裂殖酵母的线粒体［１１－１２］，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ方法检测抗体质量。将线粒体提取液上样于１２％聚丙酰胺凝胶中，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，湿转（硝酸纤维素膜，简称ＮＣ膜），条件为３００ｍＡ、１００ｍｉｎ。用封闭液（０．１３７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．０２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，５％脱脂奶粉，质量浓度）封闭硝酸纤维素膜２ｈ。用ＴＢＳＴ缓冲液（含０．０２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，０．１３７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，调节ｐＨ值至７．４）洗膜３次，按比例加入一抗，室温孵育４ｈ，用ＴＢＳＴ缓冲液洗膜３次，再按比例加入二抗，室温避光孵育１ｈ，用ＯＤＹＳＳＥＹ激光扫描显示结果。