第二章荧光和化学发光分析法
原子发射光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱是分析化学中常见的光谱技术，它们在原子结构分析和元素检测等方面具有重要的应用价值。
然而，这三种光谱具有不同的原理和特点。
下面将分别介绍原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱的区别。
一、原子发射光谱1. 原理：原子发射光谱是利用原子在能级跃迁时所发射的特征光谱线进行分析的一种技术。
当原子受到激发能量后，原子的电子会跃迁至较高的能级，而后再跃迁至较低的能级时会发射出特征波长的光谱线。
通过测量这些特征光谱线的强度和波长，可以确定样品中各种元素的含量和种类。
2. 应用：原子发射光谱广泛应用于金属材料分析、环境污染物检测、地质勘探等领域，尤其在工业生产中具有重要的应用价值。
3. 优势：原子发射光谱的灵敏度高、测定范围广，能够同时检测多种元素，具有较高的分析精度和准确度。
二、荧光光谱1. 原理：荧光光谱是利用物质在受到紫外光激发后，发射出荧光光谱进行分析的一种技术。
当样品受到紫外光激发后，部分分子会吸收能量并跃迁至激发态，随后分子会再跃迁至基态并发射出荧光光谱，通过测量荧光光谱的强度和波长，可以得到样品的成分和结构信息。
2. 应用：荧光光谱在生物医学、材料科学、环境监测等领域具有广泛的应用，尤其在生物分析和药物检测中得到广泛应用。
3. 优势：荧光光谱对于生物分子具有较高的灵敏度和选择性，能够实现实时、非破坏性的分析。
三、化学发光光谱1. 原理：化学发光光谱是利用化学反应产生的发光进行分析的一种技术。
当两种或多种试剂混合后，在化学反应的作用下产生的化学发光可以被测定，通过测量化学发光的强度和时间，可以获得样品的化学成分和反应动力学信息。
2. 应用：化学发光光谱广泛应用于医学诊断、食品安全检测、环境监测等领域，尤其在微量分析和实时检测方面具有重要意义。
3. 优势：化学发光光谱对于微量物质具有较高的检测灵敏度和快速响应性，适用于多种复杂样品的分析。
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱分别具有不同的原理和应用特点，它们在元素分析和化学反应动力学研究中发挥着重要的作用。
经典：荧光和磷光
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性：
（1）Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光 度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。
一、基本原理
2.2 荧光或磷光光谱曲线
如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同波长 时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激
辐射跃迁方式
无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（三）荧光和分子结构的关系
分子产生荧光必须具备两个条件：
① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才 能吸收激发光；
② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有 一定的荧光量子产率。
一、基本原理
化学发光与荧光免疫技术及仪器与分析
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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3．过碘酸盐氧化法
直接偶联
标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪 伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不 适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫 学活性的蛋白质。
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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4．戊二醛法
间接偶联
氨基 芳香伯胺基
2．眯唑类化合物 较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱 (lophine)。
3．吖啶酯类 典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精 (1ucigenin)。
4．苯酚类化合物 其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。 5．芳香草酸酯类 主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和 双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。 6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物
熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物， 时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯 合物。
了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点， 化学发光免疫分析的临床应用
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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第一节 化学发光免疫分析技术
基本原理 反应的底物 标记方法 反应类型 相关仪器
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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三、标记方法
按照标记物的应用:
化学标记 生物标记
化学标记: 用于化学发光(酶)免疫测定
➢直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原
➢以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、 NAD等)标记抗体或抗原
反应速度
原子光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子光谱、荧光光谱和化学发光谱是三种不同的光谱分析方法，它们之间存在显著的区别。
1. 原子光谱：原子光谱是由原子中的电子在能量变化时所发射或吸收的一系列波长的光所组成的光谱。
原子吸收光源中部分波长的光形成吸收光谱，为暗淡条纹；发射光子时则形成发射光谱，为明亮彩色条纹。
每一种原子的光谱都不同，遂称为特征光谱。
原子光谱中各条谱线的强度互不相同，它与相应的两能级间的跃迁几率有关。
原子光谱是一些线状光谱，发射谱是一些明亮的细线，吸收谱是一些暗线。
原子的发射谱线与吸收谱线位置精确重合。
2. 荧光光谱：荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。
当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。
荧光光谱是物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。
3. 化学发光谱：化学发光法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。
综上所述，这三种光谱分析方法在原理和应用上存在显著的区别。
原子光谱主要关注原子的能级跃迁和光的发射与吸收；荧光光谱则关注物质吸收电磁辐射后的激发和再发射过程；而化学发光谱则是利用化学反应过程中产生的光强来进行定量分析的方法。
化学发光
三、常见的化学发光剂
鲁米诺 过氧化草酸酯 四价铈 吖啶酯化合物
鲁米诺早在1853年就被合成出来了。1928年，化
学家首次发现这种化合物有一个奇妙的特性，它被 氧化时能发出蓝光。 刑侦学应用 在检验血痕时，鲁米诺与血红素（hemoglobin，血 红蛋白中负责运输氧的一种蛋白质）发生反应，显 出蓝绿色的荧光。这种检测方法极为灵敏，能检测 只有百万分之一含量的血。
化学发光分析法的应用
无机物的分析检测 有机物的分析检测 农药残留检测 药物分析检测
化学发光与新技术、新方法的联用
化学发光与毛细管电泳技术的联用
化学发光与分子印迹技术的联用 化学发光与成像技术的联用 化学发光与高效液相色谱技术的联用 化学发光与免疫技术的联用
化学发光免疫分析法：是以标记发光剂为示踪
发光强度
化学发光反应的发光强度Icl是以 单位时间内发射的光子数表示，它 与化学发光反应的速率有关。
时刻t 的化学发光强度(单位时间 发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与 该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析 物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内 的发光总强度来进行定量分析。 t t dc A I cl t dt cl dt cl c 0 0 dt
发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：
静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光强度；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器， 定时通过测量室，连续发光，测定最大光强度；试样量大；
化学发光
化学发光(ChemiLuminescence ，简称为CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。
化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光( 光辐射) 所吸收的能量来源不同。
体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。
化学发光体系用化学式表示为：依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为：1 ）普通化学发光分析法( 供能反应为一般化学反应) ；2 ）生物化学发光分析法( 供能反应为生物化学反应；简称BCL) ； 3 ）电致化学发光分析法( 供能反应为电化学反应，简称ECL) 等。
根据测定方法该法又可分为： 1 ）直接测定CL 分析法；2 ）偶合反应CL 分析法(通过反应的偶合，测定体系中某一组份；3) 时间分辨CL 分析法( 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定) ；4 ）固相、气相、掖相CL 。
分析法；5 ）酵联免疫CL 分析法等。
化学发光的系统一般可以表示为：在整个的检测系统中其关键的部分为PMT ，其直接影响到仪器的检测性能，其最高检测极限为10 －22 mol/L 。
不同型号的仪器其检测技术不一样，但基本原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系，而化学发光强度随体系反应进行的速度增强或衰弱。
记录仪记录峰形，以峰高定量，也可以峰面积定量。
因化学发光多为闪烁式发光(1—2s 左右) ，故进样与记录时差短，分析速度快。
第二部分、化学发光常用的化学试剂及其原理化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。
任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。
因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（170 ～300 KJ ／mol ），第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。
化学发光法的原理技术要点及评价应用
化学发光法的原理技术要点及评价应用化学发光法是一种利用化学反应产生的发光现象进行分析的方法。
其原理是通过物质的发光反应，在外界刺激下，物质发生激发态到基态的电子跃迁，从而释放光子并产生发光现象。
化学发光法技术要点包括反应物的选择、光学系统的设计和检测等方面。
下面将详细介绍化学发光法的原理、技术要点以及评价应用。
1.原理：化学发光法的原理基于化学反应产生的发光现象。
一般来说，化学发光反应包括激发和发光两个过程。
首先，通过适当的刺激，使得反应物处于高能级的激发态；然后，在能级自发降低的过程中，放出能量差，产生光子并产生发光现象。
这种发光现象被称为化学发光。
2.技术要点：（1）选择合适的反应物：反应物的选择对化学发光法具有至关重要的影响。
通常要求反应物在发光过程中能产生稳定可靠的发光，且反应物之间的反应控制要良好。
同时，还要考虑反应物的选择范围、溶解性、灵敏度等因素。
（2）光学系统的设计：光学系统是用于收集、传输、分离和检测发光信号的组件。
设计良好的光学系统可以提高灵敏度和准确度。
光学系统的设计要考虑光源的选择、光路的布局、光学元件的选用等方面。
（3）检测：检测是化学发光法中的关键步骤。
可以使用不同的光学仪器进行检测，如光电倍增管、光电二极管和光电子多功能测量系统等。
检测的关键是要选择合适的波长和敏感性以获得准确的发光信号。
3.评价应用：（1）分析化学：化学发光法在分析化学领域被广泛应用于无机、有机和生物分析中。
在无机分析中，可以用于测定微量的金属离子、无机盐和荧光物质。
在有机分析中，可以应用于测定有机物的含量和浓度。
在生物分析中，化学发光法可以用于检测细胞组织中的酶活性、激素浓度、蛋白质浓度等。
（2）生命科学研究：化学发光法在生命科学研究中有着广泛的应用。
例如，可以用于药物筛选、生物传感器的构建、分子诊断等。
化学发光法在生命科学研究中具有灵敏性高、检测速度快的特点。
（3）环境监测：化学发光法可以用于环境监测领域，例如检测水中的重金属、有机物和污染物。
单线态和三线态讲解学习-2022年学习资料
3刚性平面结构-实验发现，多数具有刚性平面结构的-有机分子具有强烈的荧光。-因为这种结构可以减少分子的振动 -使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用-减少，也就减少了碰撞去活的可能性。-荧光素-酚酞
4取代基效应-给电子基团，荧光增强-OH、OR、CN、NH-产生了p-π 共轭作用，增强了π 电子共轭程度，使 低-激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。-芳环上-吸电子基团-减弱甚至会猝灭荧光-如-C00H、-NO、=0、卤素-卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低-在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发-生自 轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速-20
原子吸收-原子光谱-原子发射-原子荧光-光谱分析-紫外-可见光谱-分子吸收-分子光谱-红外光谱-分子发光-
第二章-分子发光分析-分子一吸收能量-一激发为激发态一释放出能量一基态-辐射跃迁-非辐射跃迁-电能化学能能-光的形式释放-以热的形式释放-称为“发光”-光致发光-荧光-磷光-化学发光-2
分子荧光分析法-一、基本原理-一荧光和磷光的产生-从分子结构理论来讨论-振动能级-电子所处的能级-分子中电 -转动能级-的能量状态-S=0,J=1单重态S表示-所有电子都是自旋配对的-电子的多重态-大多数基态分子都 于单重态-J=2S+1-S=1,J=3三重态T表示-S:为各电子自旋量子-电子在跃迁过程中伴随着-数的代数 -自旋方向的变化（自旋平行）
在荧光的产生过程中，由于存在各种形-式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的-最大发射波长都向长波方向移动，以 光-波长的移动最多，而且它的强度也相对较-弱。-13
A-F-200-300-400-500-A/nm-奈的数发光谐、荧光和麟光光谐-14
激发光谱与发射光谱的关系-a.Stokes位移-激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比-激发光 的长，振动弛豫消耗了能量。-b.发射光谱的形状与激发波长无关-电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 如能级-图入2，入，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的-最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧 -c.镜像规则-通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一-样成镜像对称关系。-15
化学发光法
应用
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无机化合物化学发光分析 化学发光法在无机化合物化学发光分析中的应用如下表所示 ： 有机化合物的化学发光分析 化学发光法在有机化合物化学发光分析中的应用如下表所示： 化学发光在生物领域的应用
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发光法分类
依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为： 1）普通化学发光分析法（供能反应为一般化学反应）； 2）生物化学发光分析法（供能反应为生物化学反应；简称BCL）； 3）电致化学发光分析法（供能反应为电化学反应，简称ECL）等。 根据测定方法该法又可分为： 1）直接测定CL分析法； 2）偶合反应CL分析法（通过反应的偶合，测定体系中某一组份）； 3）时间分辨CL分析法（即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定）； 4）固相、气相、液相CL分析法； 5）酵联免疫CL分析法等 。
化学发光反应的发光效率是指发光剂在反应中的发光分于数与参加反应的分子数之比。对于一般化学发光反 应，值约为10-6，较典型的发光剂，如鲁米诺，发光效率可达 0.01，发光效率大于 0.01的发光反应极少见。现 将几种发光效率较高的常用的发光剂及其发光机理归纳如下。
鲁米诺及其衍生物
鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、4—氨基已基—N —乙基异鲁诺及 AHEI和 ABEI等。鲁米诺在碱性条件下 可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。
荧光 检测方法
荧光检测的方法如下：
1. 荧光光谱分析法：通过测量荧光物质在不同波长激发光照射下所发出的荧光光谱，可以了解荧光物质的荧光特性。
2. 原子荧光法：通过测量原子在特定波长激发光照射下所发出的荧光光谱，可以测定元素含量。
3. 化学发光分析法：通过测量化学反应中产生的特定波长的光来定量测定化学物质的方法。
4. 时间分辨荧光分析法：通过测量不同时间点的荧光信号，可以消除背景荧光的干扰，进一步提高荧光分析的灵敏度和准确性。
5. 荧光偏振分析法：通过测量荧光分子的偏振方向和强度，可以了解荧光分子的分子结构和运动状态。
除了以上常见的荧光检测方法，还有共聚焦激光扫描显微镜、多光谱成像、多光子显微镜等多种基于荧光的成像技术，可以用于观察和分析生物样品中的荧光标记物。