核酸的提取经验及原理总结
核酸提取技术CDC培训
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
q 原理
质粒DNA－碱裂解法
在pH 12.0～12.6环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并在高盐浓度的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在 去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、 RNA与蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
• 阴离子交
换树脂
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷 高效。
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用 于纯度要求高的实验。
基因组DNA－其它方法 ➢ 浓盐法：
➢ 有机溶剂抽提法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 密度梯度离心法：
影响RNA提取的因素
标 本、 细菌培养物
基因组DNA－SDS法 裂解抽提
上层溶液
离心洗涤 干燥溶解
酒精沉淀 DNA溶液
基因组DNA－其它方法 q 根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法 q 根据核酸分离纯化方式的不同有：
材料准备 基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
Ø 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不 要反复冻融
Ø 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞 （白细胞）
Ø 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成 DNA降解
新冠核酸检测原理和方法
新冠核酸检测原理和方法新冠病毒核酸检测是目前诊断新冠肺炎的主要方法之一，也是疫情防控中的重要手段。
核酸检测的原理和方法对于准确诊断和及时治疗新冠肺炎具有重要意义。
本文将详细介绍新冠核酸检测的原理和方法，希望能够为大家提供一定的参考和帮助。
一、核酸检测原理。
核酸检测是通过提取病毒RNA并进行扩增检测，来确认病毒是否存在的一种方法。
具体来说，就是通过提取样本中的病毒RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化为DNA，再利用聚合酶链式反应（PCR）技术进行DNA的扩增，最终通过检测扩增产物来确认病毒的存在与否。
二、核酸检测方法。
1. 样本采集。
核酸检测的样本通常采集自呼吸道分泌物，包括鼻咽拭子、咽拭子、深部呼吸道分泌物等。
采集样本的过程需要严格遵守无菌操作规范，以免污染样本。
2. 样本处理。
采集到样本后，需要进行样本的处理，包括病毒RNA的提取和纯化等步骤。
这一步骤的关键是确保提取到足够的RNA，并且避免污染。
3. 逆转录。
提取到的RNA需要通过逆转录酶进行逆转录反应，将RNA转化为DNA。
这一步骤是为了方便后续的PCR扩增。
4. PCR扩增。
逆转录后的DNA需要进行PCR扩增，通过PCR技术可以将少量的DNA扩增成大量，从而方便后续的检测。
5. 结果分析。
最后，通过检测PCR扩增产物，可以确认样本中是否存在新冠病毒。
三、核酸检测的注意事项。
1. 样本采集需要由专业人员进行，避免操作不当导致样本污染或者无法正确采集。
2. 样本处理和实验操作需要在严格的实验室条件下进行，避免污染。
3. 核酸检测结果需要由专业人员进行解读，避免误判。
4. 核酸检测结果可能会受到多种因素的影响，包括样本质量、实验操作等，因此需要谨慎对待。
总结。
新冠核酸检测是一种准确诊断新冠肺炎的重要方法，其原理和方法在疫情防控中发挥着重要作用。
通过本文的介绍，相信大家对核酸检测有了更清晰的认识，希望大家在疫情期间能够加强防护意识，做好个人防护，共同抗击疫情。
核酸抽提原理
================================================1：核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。
裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
经典的裂解液几乎都含有去污剂(如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐(如 Tris、EDTA、NaCl 等)。
盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境(如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA)、维持核酸结构的稳定(如 NaCl) 等。
去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。
第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。
第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。
高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。
当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。
其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。
2：了解你的实验样品如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。
第三章 核酸的提取
• 核酸制备的关键: • 1．保持低温（0º ～4℃），缩短提取过程 • 2．防止化学（过酸、过碱），避免机械 （剧烈搅拌）降解。 • 3．防止核酸酶的作用。
4.核酸酶的抑制和抑制剂 • 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于 对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制 剂更有利，当然，几个条件并用更好。 • 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但 防止机械张力拉断则更重要。 • 对于RNA，因分子较小，不易被机械张 力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取 中设法抑制RNase更重要。
• 根据细胞裂解方式的不同有： • 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、 冻融法。 • 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法。 • 生物方式：酶法。
根据核酸分离纯化方式的不同有：
• 吸附材料结合法： • 硅质材料 高盐低PH值结合膜，低盐高PH 值洗脱。快速高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高PH值结合核酸，高 盐低PH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。 • 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的 目的物，从而达到分离目的。
5.核酸提取的一般过程
I.材料准备 破碎细胞 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
1）材料的选择 • 动物DNA的来源（核DNA、线粒体DNA、 质粒DNA） • 动植物中，小牛胸腺۰动物肝脏۰鱼类精子， 植物种子的胚中都含有丰富的DNA • RNA来源：新鲜组织或细胞
CTAB提取缓冲液的经典配方
（2）试剂的作用 Tris-Hcl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破 坏； Nacl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液 相中 -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免 褐变，使酚容易去除。 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离
核酸提取方法的技术要点和注意事项
核酸提取方法的技术要点和注意事项一、核酸的基本概念核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。
根据五碳糖的不同可以将核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。
核酸都是极性化合物，都溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂。
在酸性溶液中易水解，在中性及弱碱性溶液中稳定性稍高。
二、核酸提取前样本采集、预处理和保存全血：抗凝剂EDTA或枸橼酸钠，不宜使用肝素（抑制Taq活性）；血清和血浆：主要用于检测病毒、细菌和肿瘤细胞等释放入血的游离核酸；分泌物：痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免混入大量口腔脱落的上皮细胞和唾液影响检测结果。
三、核酸提取的基本步骤及使用试剂1.核酸的释放；2.核酸的分离与纯化；3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤。
核酸提取的常用组分成分名称原理及作用酚蛋白质的变性剂，可抑制DNase的降解作用SDS（十二烷基磺亲水基表面活性剂，可破坏细胞膜、核膜、并使组织蛋白酸钠）与DNA分离溶解脂类蛋白TritonX-100 非离子表面活性剂，有助于蛋白质与DNA分离异硫氰酸胍变性裂解细胞，强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 一种重要的氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH异丙醇DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分氯化钠氯化钠溶液中DNA的溶解度最低，而蛋白质高，可以去除蛋白；抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，维持核酸的稳定等矿物油去除非核酸有机杂质磁珠吸附核酸四、实验室常用核酸提取技术1.酚/氯仿抽提法/醇沉淀法；2.层析柱法；3.煮沸裂解法；4.一步法；5.纳米磁珠法。
1.酚/氯仿抽提法/醇沉淀法：酚是蛋白质的变性剂，同时抑制了DNase的降解作用，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质，核蛋白变性降解，使核酸释放。
常用核酸提取技术介绍
常用核酸提取技术介绍核酸提取是从细胞或组织中分离纯化核酸的过程。
核酸提取技术广泛应用于生命科学研究中，例如基因测序、PCR扩增、基因克隆、基因组学研究等。
下面将介绍几种常用的核酸提取技术。
1.酚-氯仿法酚-氯仿法是一种经典的核酸提取方法。
该方法主要包括细胞破碎、蛋白质消化和核酸沉淀三个步骤。
首先，细胞经过机械强化破碎，释放出核酸。
接着，通过酚的提取使蛋白质溶解，然后利用氯仿分离出水相中的核酸沉淀。
最后，通过酒精沉淀获得纯化的核酸。
优点是操作简单，适用于各种样品类型。
缺点是提取的核酸可能含有蛋白质、多糖等杂质，纯度较低。
2.磁珠法磁珠法是一种高效的核酸提取方法。
该方法利用特定的磁性珠子将核酸选择性地吸附，然后通过磁力将珠子与非目标杂质分离。
该方法相对于传统的酚-氯仿法具有许多优点，包括提取纯度高、自动化程度高、适用于大规模样品处理等。
磁珠法特别适用于高通量的核酸提取和高通量测序等需求。
3.硅胶柱法硅胶柱法是一种常用的核酸提取方法。
该方法利用硅胶膜的亲和性，将核酸吸附到硅胶膜上，然后通过洗涤和洗脱步骤来纯化核酸。
硅胶柱法适用于从小规模样品中提取纯度较高的核酸，例如从血液、组织和细菌培养物中提取DNA。
硅胶柱法提取的核酸能够进行各种分子生物学和分子诊断应用。
4.针对特定样品的提取方法不同类型的样品可能具有不同的特性和组分，因此需要针对特定样品开发相应的核酸提取方法。
例如，提取环境样品中的核酸可能需要经过过滤、浓缩、去除抑制物等步骤。
提取血液样品中的核酸可能需要应用抗凝剂来避免核酸降解。
提取植物样品中的核酸可能需要使用纤维素酶来消化细胞壁。
因此，在选择和设计核酸提取方法时，应该考虑到样品的特点和需求。
总之，核酸提取是生命科学中基础而重要的步骤，良好的核酸提取方法可以确保提取纯度高、完整的核酸样品，为后续的基因分析提供可靠的基础。
不同的核酸提取方法各有优缺点，根据实验需求和样品特点选择合适的方法是至关重要的。
几种核酸提取方法概述
几种核酸提取方法概述第一篇：几种核酸提取方法概述几种核酸提取方法概述(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95％乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。
此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态. 第二篇：核酸的提取核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。
核酸的提取
有机沉淀剂
乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。 异丙醇 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗。 聚乙二醇（PEG） 优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量 的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。 精胺 不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩 而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
裂解液的用量原则 确保彻底裂解样品 使裂解体系中核酸浓度适中 以样品中蛋白质的含量为基准
细胞裂解
基因组DNA的提取
材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 螯合剂
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
盐离子的去除：
70％的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解优点： 改变核酸的溶解缓冲液；
重新调整核酸的浓度；
CTAB法 SDS法
其它
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核酸的提取经验及原理总结
一、常用的核酸提取方法
目前常用的核酸提取方法主要包括酚/氯仿法、柱式法、磁珠法和自
动提取仪法等，下面对这几种方法进行一一介绍。
1.酚/氯仿法
酚/氯仿法是最早用于核酸提取的方法之一、它的基本原理是利用酚
的亲脂性和氯仿的亲水性来分离DNA和RNA。
这种方法适用于大规模批量
提取核酸的情况。
2.柱式法
柱式法是近年来广泛应用于核酸提取的一种方法。
它以硅胶柱或玻璃
纤维柱为基质，通过离心等方法将核酸吸附到柱子上，然后通过洗脱步骤
将核酸从柱子上洗脱下来。
这种方法操作简便，提取纯度高，适用于少量
样品的提取。
3.磁珠法
磁珠法是一种基于磁性珠子的核酸提取方法。
磁性珠子上包裹有石墨
烯或其他亲核酸物质，可以通过磁场将其中的核酸吸附到珠子表面，然后
洗脱并收集核酸。
这种方法操作简便，提取效果好，适用于不同规模的样品。
4.自动提取仪法
自动提取仪是一种基于电力或机械力的核酸提取设备。
它具有自动化、高通量、操作简单等优点。
通常采用矽基杂化技术或磁珠法来提取核酸。
这种方法适用于大量样品的高通量提取。
二、核酸提取的基本步骤
不管采用哪种提取方法，核酸提取的基本步骤大致相同，包括样品处理、细胞破碎、核酸与蛋白质分离、纯化和沉淀等环节。
1.样品处理：将样品收集并进行初步处理，包括洗涤、离心、冻存等。
根据样品的不同，处理方法也会有所差异。
2.细胞破碎：将细胞或组织中的细胞膜破碎，释放核酸。
常用的破碎
方法有冻融、酶解、研磨等。
3.核酸与蛋白质分离：利用酚类或其他化学物质使蛋白质发生沉淀，
将净化后的上清液中的核酸收集起来。
这个步骤是核酸提取中最关键的步
骤之一
4.核酸纯化：通过离心、柱子或其他方法去除杂质，纯化核酸。
5.核酸沉淀：将纯化后的核酸沉淀出来，去除纯化液。
三、核酸提取中的注意事项
在进行核酸提取时，有几个方面需要特别注意。
1.质量控制：核酸提取的质量会直接影响到后续实验的结果。
因此，
在进行提取之前要确保提取试剂的质量、样品的保存条件等达到要求。
2.操作规范：核酸提取需要严格按照实验操作规范进行，包括佩戴手套、使用洗手液、提取器具的消毒等，以防止污染。
3.样品保存：样品在采集后要及时冻存，避免核酸降解。
如果不能及
时处理，可以使用RNA保护剂将样品保存起来。
4.避免污染：实验室中常见的DNA或RNA污染源包括实验台、手套、管道等。
在提取过程中要注意避免这些污染源的接触，以免影响核酸提取的纯度。
总结：
核酸提取是一项非常重要的实验操作，对于后续的分子生物学实验有关键作用。
选择适当的提取方法、严格操作规范、注意样品保存和避免污染等，都是保证提取结果准确和重复性的关键。
在具体操作中，根据不同的样品和实验要求，选择合适的提取方法是至关重要的。