碱性磷酸酶的分离纯化
2019年-碱性磷酸酶提取与纯化The Separation and Purification of AKP-PPT精选文档
Methods（操作） 一次过滤,五次离心:
(一)
取10ml肝匀浆于三角烧瓶内
加入2.5ml正丁醇，！ 充分搅拌3~5min
室温置10min，滤纸过滤
注意 滤纸不要用水打湿 ！！
滤液（约4ml）
加等体积冷丙酮，立即搅拌 混匀！3500rpm，5min
上清 沉淀 （弃去）
慢慢滴加，边加边搅 观察并记录现象
掌握用有机溶剂分离、纯化酶的原理和方法
Principle （原理）
有机溶剂（乙醇、丙酮、正丁醇等）通过 降低酶的S而使酶沉淀析出
降低介质的介电常数及对酶蛋白的脱 水作用
ice acetone 33% dissolve
（冷丙酮）
50% pellet
ice ethyl alcohol （冷乙醇）
30% dissolve 60% pellet
B液,记录V1
0.2ml B液
B1液
加1.8mlTris
V=0.45(V1-0.2)
记录V2 V=0.83V2
Methods （操作）
(三)
沉淀
加3ml 0.5M Mg(Ac)2溶液,搅拌, 记录体积V3, 加丙酮至33%,
3500rpm,5min
沉淀 （弃去）
上清(V4)
加丙酮至50%,立即搅拌混匀！
记录体积
AKP溶液 ml
有机溶剂 ml
V1 V2 V3 V4
VC
，
V1
，
V2
，
V3
，
V4
[问题与讨论]
有机溶剂提取与纯化酶的注意点及 操作中的注意事项和自己的心得体会。
3500rpm, 5min
上清 沉淀
（弃去）
碱性磷酸酶的提取
b）利用分光光度计测吸光度
c）设计标准曲线计算蛋白质含量
使用BCA法测定蛋白含量的原因
a) 对酶的比活力测定中蛋白定量发现BCA法在本样品体系中灵敏度 高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。
b）与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试 剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广. 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中.
提取操作流程 a）
取动物组织于 研钵中剪碎
加0.01M醋酸镁0.01M醋酸钠
滤液
(V)
弃渣
室温静置20分钟 用滤纸过滤
研磨2-3分钟
转移入刻度 离心管
于离心管中加 入正丁醇，用 玻棒充分搅拌
2分钟左右
提取操作流程 b）
滤液
(V)
加入等体积冷丙酮，立即 混匀后离心（200上清液
加入0.5M醋酸镁，用玻棒充分 搅拌,记录体积(V1)
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)，使乙醇终浓度达30%
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)使乙醇终浓度达30%
b) 原理：在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠， 苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生 成红色醌亚衍生物。测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大 小。
② AKP的蛋白含量测定—BCA法
原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合 一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质 将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色 复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
实验五碱磷酶的纯化和比活性的测定
管号
不同酶液
O -
S -
1(AE) 2(BE) 3(CE) 4(DE) 0.1 0.1 0.1 0.1
0.1mg/ml标准酚液
0.1 3
0.1
3
3
3
3
3
0.01mol/LpH8.8Tris
预温37℃复合基质液
考马斯亮蓝法测定蛋白含量
游离状态的考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中 呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，蛋白质 含量与颜色深浅成正比 595nm测定吸光度，做标准曲线，求出蛋白 质浓度
实验结果
分离阶段 蛋白质 (mg/ml) 酶活性 （U/ml） 比活性 (U/mg) 纯化倍数 得率
Summary of porcine platelet-derived growth factor purification protocol
Step Total protein (mg/ml) 39 800 237.32 45.83 6.25 4.35 0.17 Total activity (z/U) 1.8×106 9.2×105 6.1×105 8.4×104 6.9×104 5.8×104 Specific Fold activity Recovery purificat (%) ［(z/B)/U*mgion 1］ 45 3 876 13 310 13 440 15 862 341 176 1 86 296 299 352 7 582 100 51 34 5 4 3
取D液0.1mL置于编号为DE的试管中,供测酶活性 取D液0.1mL置于编号为Dp的试管中，供测蛋白 质含量
磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性
根据产物红色的深浅测定酚的含量
酶活性单位：37℃下15 min生成1mg酚为1个酶活性单位 每mL样品中 = 酶活性单位
碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定
2. 操作方法 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 每组称取25 g牡蛎（蒸水洗净），加入50 mL
预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织 捣碎机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h左右进行抽 提。
45
32
65
99
134 171 210 250 339 431
实验 碱性磷酸酶的分离提取
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术
1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。
上清液
（留3 mL上清液，待测酶的比活力。）
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h左右。 室温离心，4000 r/m 10 min，收集离心上清液，并量体积。 （留
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：
(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。
(2) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有 的酶活力单位数。唯有比活力提高较大，提纯步骤 才有效。
(动物来源)碱性磷酸酶的提取及性质研究
最适pH及酸碱稳定性实验
最适pH及酸碱稳定性实验
最适温度及热稳定性实验
最适温度及热稳定性实验
抑制剂类型鉴别
实验仪器
谢谢！
分离纯化试剂
（1）0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸 馏水中，定容至1000ml （2）0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠溶液:准确 吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶100ml0.14mol/L醋酸 钠溶液，混合后定容至1000ml （3）正丁醇、丙酮、乙醇 （4）Tris-HCl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲 烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为 0.1mol/LTris溶液.取100ml 10.1mol/LTris溶液， 加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液 100ml，混匀后用1%冰醋酸调ph为8.8，用蒸馏 水定容至1000ml；
Km值测定试剂
（1）0.04mol/L底物液（磷酸苯二钠）：称取10.16g磷酸苯 二钠（C6H5PO4Na2· 2H2O），用煮沸后冷却的蒸溜水 溶解，并稀释至1，000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶 内，置冰箱内保存，可用一周。 （2）0.1mol/l碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠 6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，并稀释至 1000ml； （3）0.5mol/LNaOH （4）0.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠 42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶中， 放冰箱内保存 （5）0.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于 800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml。置棕色 瓶中，放冰箱内保存；
（动物来源）碱性磷酸酶 的提取及性质研究
碱性磷酸酶的提取
碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP 具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。
由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。
3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。
唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。
二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
酶的纯化实验报告
实验名称：碱性磷酸酶的分离纯化实验实验日期：2023年11月15日实验地点：生化实验室实验目的：1. 掌握碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化技术。
2. 了解不同纯化方法对AKP纯度的影响。
3. 学习AKP的比活性测定与动力学分析。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种在碱性条件下能水解多种磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适范围为pH 9.5-10.5，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP的分离纯化方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 正丁醇3. 丙酮4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液6. 酶活性测定试剂盒7. 其他实验试剂及仪器实验步骤：1. 样品制备：将兔肝匀浆液用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度。
2. 有机溶剂沉淀：向稀释后的匀浆液中加入正丁醇，充分混匀，静置一段时间，过滤除去杂蛋白，收集滤液。
3. 丙酮沉淀：向滤液中加入丙酮，充分混匀，静置一段时间，过滤收集沉淀。
4. 复溶于磷酸盐缓冲液：将沉淀用磷酸盐缓冲液复溶于一定体积。
5. AKP活性测定：按酶活性测定试剂盒说明书进行AKP活性测定。
6. 比活性测定：计算AKP的比活性。
7. 动力学分析：进行AKP的动力学分析，确定米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。
实验结果：1. 有机溶剂沉淀法：通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取了AKP。
2. 比活性测定：AKP的比活性为0.6 U/mg。
3. 动力学分析：AKP的米氏常数为0.5 mM，最大反应速率为1.2 U/min。
讨论：本实验采用有机溶剂沉淀法成功从兔肝匀浆液中提取了AKP，并通过比活性测定和动力学分析，对AKP的纯度和特性进行了研究。
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碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定
与定力学分析
一、实验原理
(一)碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定
1.机械破碎法制备肝匀浆
低浓度乙酸钠：低渗破膜
低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP
2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP
加入不同有机溶剂重复离心
正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质
33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP
50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP
3.比活性的定义
＊单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
＊通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
＊用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价
指标之一。
4.测定样品的比活性必须测定：
＊每毫升样品中的酶活性单位数。
＊每毫升样品中的蛋白质毫克数。
5.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性测定
AKP 4-氨基安替比林
＊磷酸苯二钠→→酚→→→→醌衍生物（红色）
铁氰化钾↓
根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。
＊37℃保温15分钟产生1mg酚者为1个酶活性单位。
(二)底物浓度对AKP活性的影响
K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度
＊上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。
因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V= 1/2 V max, K m = [S] ＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km 值。
双倒数作图法
（三）PH对AKP活性的影响
酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。
不同酶的最适pH不同。
酶的最适
pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。
（四）温度对AKP活性的影响
酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。
另一方面酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。
因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。
反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。
高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。
二、实验材料
（一）样品：兔肝
（二）试剂：
1. 0.5mol/l乙酸镁溶液
2. 0.1mol/l乙酸钠溶液
3. 0.01mol/l乙酸镁-0.01mol mol/l乙酸钠溶液
4. 0.01mol/l Tris -0.01mol/l乙酸镁ph8.8缓冲液
5.丙酮（分析纯）
6. 95%乙醇（分析纯）
7. 正丁醇（分析纯）
8. 0.04mol/l 底物液
9.1mg/ml 酚标准液
10. 0.5mol/l NaOH
11. 0.3% 4-氨基安替比林
12. 0.5% 铁氰化钾
13. 0.1mg/ml 蛋白质标准液
14. 碱性铜试剂
15. 酚试剂
16. 0.1mol/l 碳酸盐缓冲液ph10(37℃ )
17. ph缓冲液
0.2mol/l甘氨酸溶液、0.2mol/l NaOH 溶液
试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 甘氨酸溶液10 10 10 10 10 10 10 10 10 NaOH溶液0.2 0.6 1.6 3.8 6.2 8.4 9.8 10.4 10.8 H2O 11.8 11.4 10.4 8.2 5.8 3.6 2.2 1.6 1.2 最终PH 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12
（三）仪器和器材
1.研钵
2.刻度离心管
3.刻度吸管
4.电动离心机
5.玻璃漏斗和玻棒
6.托盘天平
7.恒温水浴
8.可见光分光光度计
实验步骤
（一）AKP的提取
(二)AKP的比活性测定
1、AKP的比活性测定
2、蛋白质含量测定
实验二
实验步骤
1.底物浓度对酶促反应速度的影响
将新鲜兔肝用PH10 0.1mol /L 碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可
2.酚标准曲线的绘制
注意事项
1.血清取量要准确
2.标准曲线必须是经过原点的一条直线
实验三
实验步骤
一、 ph-酶活性曲线的制作
二、酸碱稳定范围的测定
实验四
实验步骤
一、温度-酶活性曲线的制作
二、热稳定性。