003 抗体的纯化与分离(ENG)潘明祥
分子生物学课程(现代生物学精要速览中文版)
《分子生物学课程》教案2007～2008学年第 1 学期授课专业：生物技术课程名称：分子生物学主讲教师：何宁佳查幸福赵爱春课程说明一、课程名称：分子生物学二、总课时数：45三、先修课程：基因工程原理四、使用教材：PC Turner, AG McLennan, AD Bates&MRH White, 《Instant notes in Molecular Biology》, 科学出版社，2004年1月第八次印刷五、教学参考书：1 PC特纳、AG麦克伦南、AD贝茨、MRH怀特，《分子生物学-现代生物学精要速览中文版》，科学出版社，2004年8月第七次印刷。
2 朱玉贤，李毅编著《现代分子生物学》，第二版，高等教育出版社，2004年1月第3次印刷。
六、考核方式：理论课采用闭卷考试的方法，总成绩，平时成绩30%，中期考试10%，期末考试60%七、教案编写说明：教案又称课时授课计划,是任课教师的教学实施方案。
任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标，以教学大纲为依据，在熟悉教材、了解学生的基础上，结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个章、节或主题的全部教学活动。
教案可以按每堂课（指同一主题连续1~2节课）设计编写。
教案编写说明如下：1、编号：按施教的顺序标明序号。
2、教学课型表示所授课程的类型，请在相应课型栏内选择打“√”。
3、题目：标明章、节或主题。
4、教学内容：是授课的核心。
将授课的内容按逻辑层次，有序设计编排，必要时标以“*”、“#”“？”符号分别表示重点、难点或疑点。
5、教学方式既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。
教学手段指教科书、板书、多媒体、模型、标本、挂图、音像等教学工具。
6、讨论、思考题和作业：提出若干问题以供讨论，或作为课后复习时思考，亦可要求学生作为作业来完成，以供考核之用。
7、参考书目：列出参考书籍、有关资料。
8、日期的填写系指本堂课授课的时间。
课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案课时教案。
211232365_AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.04.028·论著/免疫学技术与方法·AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备①张浩李舒月张雄洲谈恒星杨建林曹春雨吕亚丰（三峡大学医学院，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，宜昌 443000）中图分类号R392-33 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）04-0833-05［摘要］目的：表达腺相关病毒（AAV）9型衣壳蛋白VP，制备抗VP蛋白的多克隆抗体。
方法：使用PCR技术从AAV9病毒包装质粒中扩增AAV9衣壳蛋白VP，同源重组法构建衣壳蛋白表达质粒pET30a-AAV9-VP。
质粒转化表达菌E.coli BL21（DE3）后，IPTG诱导目的蛋白VP表达，亲和层析法纯化VP蛋白，将纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔，3次免疫后获得针对VP蛋白的兔多克隆抗体。
以Western blot和细胞免疫荧光法检测抗体的应用，ELISA检测所得抗体的效价。
结果：成功构建pET30a-AAV9-VP表达质粒，在大肠杆菌BL21中，IPTG可诱导VP蛋白表达。
亲和层析法纯化获得高纯度的VP蛋白。
该蛋白在日本大耳兔体内能够诱导产生多克隆抗体，ELISA检测抗血清效价达到1∶512 000。
结论：成功原核表达和纯化AAV9衣壳蛋白VP并制备了兔多克隆抗体。
制备的抗AAV9 VP抗体能够特异性识别和结合AAV衣壳蛋白，并可有效用于Western blot和细胞免疫荧光分析，为后续深入研究AAV9在基因治疗中的作用及AAV9载体开发提供了研究基础。
［关键词］原核蛋白纯化；腺相关病毒9；多克隆抗体Prokaryotic expression，purification and polyclonal antibody preparation of AAV9 capsid protein VPZHANG Hao， LI Shuyue， ZHANG Xiongzhou， TAN Hengxing， YANG Jianlin， CAO Chunyu， LYU Yafeng. Three Gorges University Medical College， Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy， Yichang 443000， China［Abstract］Objective：To express the recombinant proteins of adeno-associated virus （AAV）9 capsid VP and prepare the polyclonal antibodies against VP. Methods：AAV9 capsid protein VP coding sequence was amplified from AAV9 plasmid by PCR，and capsid protein expression plasmid pET30a-AAV9-VP was constructed by homologous recombination. After transforming it into E.coli BL21 （DE3）， IPTG was used to induce expression of VP， and the VP was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography，the purified protein was used as antigen to immunize Japanese white rabbits to prepare polyclonal antibodies. The rabbit polyclonal antibody against VP protein was obtained after three times of immunization. Specificity of anti-sera was detected by Western blot and cell immunofluorescence， ELISA was used to detect titer of anti-VP antibody. Results：The pET30a-AAV9-VP expression plasmid was successfully constructed. IPTG can induce the expression of VP in E.coli BL21 bacteria. Ni-NTA resin affinity chromatography can effectively purify VP protein， and the VP can induce polyclones effectively in Japanese white rabbits， the antibody titer detected by ELISA was reaches 1∶512 000. Conclusion：Successful expression and purification of AAV9 capsid protein VP and preparation of rabbit polyclonal antibodies. The AAV9 VP antibody can specifically recognize and bind to the AAV capsid protein and can be effec‐tively used for Western blot and immunofluorescence analysis. It provides a research foundation for development of AAV9 vector and the in-depth study of the role of AAV9 in gene therapy.［Key words］Prokaryotic expression；Adeno-associated virus 9；Polyclonal antibody①本文为国家自然科学基金项目（81772833）；肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室（三峡大学）基金项目（2021KZL01）。
微生物学实验复习提纲
微生物学实验复习提纲微生物学实验复习提纲1.研究微生物学的基本技术有哪些（显微镜技术、无菌技术、纯种分离技术和纯种培养技术）2.光学显微镜又称“复式显微镜”，由哪两部分组成？显微镜的什么最为关键？为什么？答：由机械装置和光学系统组成物镜的性能最为关键，因为它直接影响着显微镜的分辨率3.油镜的放大倍数为多少？与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头间滴加什么？其什么作用？答：10*100 需要滴加镜油增加照明亮度和增加显微镜的分辨率4.影响显微镜分辨率的因素有哪些？（光源的波长、物镜的镜口角和镜头间介质的折射率）5.油镜使用后应怎样处理？镜油擦拭的正确方法是怎样的？答：用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯6.制造接种环、接种针的金属常用铂或镍,原因是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却.7.培养皿的包装一般以多少套作一包比较合适？5~8套。
8.灭菌吸管的包装的注意事项：（1）吸管必须干燥;(2)在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm 长的棉花（不能用脱脂棉）。
作用是避免外界及口中杂菌吸入管内，并防止菌液等吸入口中。
9.空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌。
则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。
10.接种环在用前必须烧灼灭菌，用后也应立即烧灼。
11.简单染色的原理是什么？其主要操作步骤是什么？固定的作用是什么？染色过程中应注意哪些环节？答：原理及步骤健实验课本71页。
固定作用：使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上12. 革兰氏染的原理及步骤是什么？革兰氏染色后的正确结果是什么颜色？答：原理见实验课本82页步骤：初染、媒染、脱色、复染结果颜色：阳性：菌体保持原有的蓝紫色阴性：洗脱后菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色13.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？答：（1）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；（2）脱色，此环节最关键。
北京四正柏生物 Mouse Anti-Human cd3 纯化抗体 说明书
相关介绍： 4A T3识别20-26 kDa 的CD3分子，CD3抗原在所有的成熟T 淋巴细胞（大约占60-80%的正常人外周血淋巴细胞）、NK-T 细胞和一些胸腺细胞上表达。
CD3与T 细胞抗原受体a/b 或 g/d 二聚体结合后，在T 细胞的活化和抗原识别过程的信号转导中起重要作用。
用途：计数与监控外周血Ｔ淋巴细胞水平；体外激活Ｔ淋巴细胞；检测与监控某些自身免疫病与免疫缺陷病。
储存条件： 2-8℃避光保存,勿冰冻。
克隆名称： 4A T3抗体亚型: Mouse IgG2a缓 冲 液： 0.01M PBS+0.01%NaN3, pH 7.4实验方法（全血样本流式检测）1. 取100μl EDTA 抗凝的人外周血加入流式测定管底部;2. 加入适量纯化抗体与全血混匀，室温孵育30分钟;3. 加入2 ml 1×红细胞裂解液混匀后避光置10分钟,溶解红细胞(推荐:4A Biotech LysingSolution[10×],Cat. :FXP001);4. 将试管置离心机中以1000 rpm 离心5分钟后弃上清;5. 加入2 ml PBS 洗液(Cat.:FXP005)重悬细胞以1000 rpm 离心5分钟,弃上清;6. 加入适量荧光标记抗小鼠免疫球蛋白试剂，室温避光孵育20分钟;7. 加入2 ml PBS 洗液重悬细胞以1000 rpm 离心5分钟,弃上清;8. 加入0.5 ml PBS 洗液重悬细胞,待流式细胞仪检测(样品应在当天上机测定,也可加固定液4℃保存过夜测定).[PBS 洗液:PBS+1%FBS+0.1%NaN 3；Cat.:FXP005][细胞固定液:2%甲醛溶液]注意事项1. 加入外周血时勿将血液触及到流式管壁，否则请用棉棒擦干净;2. 红细胞裂解液使用前应平衡至室温后方可使用(见红细胞裂解液说明书);3. 若样品不能及时上机分析,请及时固定;4. 纯化抗体应做滴定,以确定最适使用量;5. 此产品仅供研究，不用于临床诊断。
重组诺如病毒P颗粒的表达纯化及免疫原性
重组诺如病毒P颗粒的表达纯化及免疫原性金浩;付璐;史晶莹;吴丛梅;吴慧;殷玉和【摘要】通过构建重组质粒并表达纯化目的蛋白,用SDS-PAGE、Western blot 和Native-PAGE检测蛋白,用SuperdexTM 200凝胶色谱层析分析目的蛋白的多聚体,用动态光散射以及透射电镜对目的蛋白颗粒进行分析,并通过小鼠免疫,用四免血清进行酶联免疫吸附实验检测蛋白的免疫反应.结果表明:成功构建了质粒pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123,并成功表达目的蛋白;目的蛋白存在3种寡聚体形式,分别为24聚体,12聚体和二聚体;蛋白颗粒约为20 nm,并对β淀粉样蛋白有免疫反应.%We constructed a recombinant plasmid and expressed the purified target protein,and used SDS-PAGE,Western blot and Native-PAGE to test protein.The multimers of the target protein were analyzed by SuperdexTM 200 gel chromatography,and the particle size of the target protein was analyzed by dynamic light scattering and transmission electron microscopy.The immune response of the protein was detected by enzyme-linked immunosorbent assay with four-immunized serum.The results show that plasmid pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123 was successfully constructed,and the target protein was successfully expressed.There are three oligomers in the target protein,which are 24-mer,12-mer and 2-mer,and the particle size of the protein is about 20 nm,and has an immune response to the β-amyloid protein.【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》【年(卷),期】2017(055)004【总页数】6页(P1025-1030)【关键词】诺如病毒重组P颗粒;可溶性表达;蛋白免疫原性;蛋白疫苗【作者】金浩;付璐;史晶莹;吴丛梅;吴慧;殷玉和【作者单位】长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;吉林大学生命科学学院,长春 130012;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012;吉林大学生命科学学院,长春 130012;长春工业大学化学与生命科学学院,长春130012【正文语种】中文【中图分类】Q819诺如病毒(Norovirus, NoV)是一种可引起流行性急性肠胃炎的重要病原体. 诺如病毒衣壳结构域(P)蛋白在体外可单独表达, P颗粒(P particle, PP)蛋白可形成二聚体和更大的寡聚体----12聚体和24聚体[1]. 这些寡聚结构蛋白与原始病毒自组装的颗粒蛋白具有相似特征, 并已在大肠杆菌、酵母和昆虫细胞中成功表达P颗粒蛋白[2]. 研究表明, P颗粒作为潜在的疫苗平台可以产生有效免疫反应的能力, 并可用于对NoVs疫苗与戊型肝炎病毒(HEV)的双候选疫苗. 同时P颗粒蛋白是制备抗轮状病毒、流感病毒及其他可能病原体的疫苗载体平台[3]. P颗粒易在大肠杆菌表达, 并具有高度稳定和高度免疫原性, 作为疫苗载体平台已应用于人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)疫苗的研发[4]中.阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人中最常见的、以进行性痴呆为特征的中枢神经系统变性疾病[5], 其特征性病理变化之一是患者脑内的神经炎性斑(老年斑), 主要成分为细胞外β淀粉样蛋白(amyloid protein β, Aβ)的沉积[6]. 因此, 消除脑内β淀粉样蛋白沉积是治疗阿尔茨海默病的有效方法. 本文选取Aβ42中的Aβ1-6多肽作为免疫原, 利用诺如病毒P颗粒作为疫苗载体. 先构建改重组P 颗粒蛋白质粒, 对其进行表达纯化, 研究重组P颗粒蛋白的存在形式及颗粒大小, 进而研究其免疫原性, 为进一步将P颗粒蛋白作为治疗阿尔茨海默病蛋白疫苗的应用奠定实验基础.1.1 主要材料感受态菌株：DH5α和BL21(DE3) pLysS, 购于北京全式金公司.实验动物： 8周龄的C57/BL6小鼠(雌鼠), 购于北京维通利华实验动物技术有限公司.1.2 主要试剂与仪器酵母提取物, 蛋白胨(湖北安琪酵母股份有限公司)；咪唑, KCl, NaCl等(北京化工厂)； TMB显色液(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺, 天根生化科技(北京)有限公司); Aβ42多肽(吉尔生化(上海)有限公司). 镍柱(HisTrap FF型, 5 mL, 上海基星生物科技有限公司); SuperdexTM 200凝胶层析柱(XK26/100型, 装柱体积为400 mL, 美国GE 公司)； NGC蛋白纯化系统(美国BIO-RAD公司), Zetasizer NanoZS纳米粒度/Zeta电位分析仪(英国Malvern公司)；透射电子显微镜(HT7700型, 日本日立高新技术公司).1.3 方法1.3.1 重组蛋白的可溶性表达和纯化将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中, 在LB培养基中培养至菌液的OD600=0.6～0.8时, 用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG, 终浓度0.33 mmol/L)对菌株进行低温(16 ℃)诱导14 h. 诱导完成后, 于4 000 r/min, 4 ℃离心30 min, 弃上清液. 将菌体按m(菌体)∶V(溶液)=1∶5的超声缓冲液[7](50 mmol/L Tris-HCl, 300 mmol/L KCl, pH=8.0)重悬, 并超声破碎30 min后, 于16 000 r/min, 4 ℃离心30 min, 取上清液, 过0.45 μm滤膜后得到重组蛋白粗提液. 利用镍柱纯化重组蛋白, 待目的蛋白挂柱后, 分别用50,100,300 mmol/L咪唑洗脱液(50 mmol/L Tris-HCl, 300 mmol/L KCl,pH=8.0)对蛋白进行梯度洗脱, 并收集每个梯度洗脱样品.1.3.2 SDS-PAGE,Native-PAGE和Western blot分析蛋白样品采用质量分数为13.5%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析. Native-PAGE为不添加SDS的质量分数为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 并且样品不进行加热变形处理. 用Quantity One软件对SDS-PAGE电泳图中蛋白进行纯度测定.Western blot分析：将样品与4×SDS样品缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl, pH=6.8, w(SDS)=8%, ρ(甘油)=40%, 0.4 mol/L二硫苏糖醇(DTT), w(溴酚蓝)=0.8%)等体积混合, 97 ℃处理样品10 min后, 用质量分数为13.5%的SDS-PAGE对蛋白进行分离. 蛋白质通过电转(15 V, 18 min)至硝酸纤维素膜上, 用含体积分数为3%脱脂牛奶的磷酸盐(PBS)缓冲液常温封闭30 min；用含体积分数为1%脱脂牛奶的PBS缓冲液(含有anti-His单克隆抗体(稀释3 000倍))常温一抗孵育2 h, 含有碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗鼠IgG抗体(稀释3 000倍)常温二抗孵育1 h；用含有w(氯化硝基四氮唑蓝(NBT))∶w(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP))=2的碱性磷酸缓冲液显色20 min.1.3.3 蛋白分子量分析利用BIO-RAD NGC蛋白纯化仪及SuperdexTM 200凝胶层析柱对表达纯化后的蛋白进行分子量分析. 以pH=8.0的20 mmol/L PBS缓冲液为流动相, 流速4.0 mL/min, 上样体积10 mL. 同时将已知蛋白440 000,158 000,75 000,43 000用相同条件处理, 作为蛋白Maker.1.3.4 动态光散射(DLS)及透射电子显微镜(TEM)分析动态光散射(DLS)粒径分析: 常温下, 用Zetasizer NanoZS仪器, 在固定散射角的90°处获得动态光散射, 从而得到蛋白的大小分布.透射电子显微镜(TEM)分析: 将样品置于处理过的铜网上, 先用磷钨酸负染色后, 再用HT7700型透射电子显微镜, 在80 kV、放大20 000倍/40 000倍条件下观察重组蛋白颗粒大小.1.3.5 小鼠免疫实验选择8周龄的C57/BL6雌性小鼠. 将24只小鼠分为4组, 每组6只, 其中2组用可溶性表达蛋白PP-3copy-Aβ1-6-loop123和PP-1copy-Aβ1-6-loop123进行免疫, 剂量为每次50 μg/只, 并用PBS和PP蛋白(每次50 μg/只)分别作为空白对照与阴性对照. 各组均选择皮下注射的免疫方式, 每14 d免疫1次, 共免疫4次, 并在每次免疫前一天通过割取尾部静脉对小鼠取血, 经离心(3 000 r/min, 4 ℃, 30 min)得到血清. 使用四免后的血清做酶联免疫吸附实验检测免疫原性.1.3.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) 蛋白的免疫效果通过酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定, 使用四免后的血清进行实验. 先用合成的Aβ42多肽, 在96孔板中进行抗原的包被, 包被抗原量为100 ng/孔, 4 ℃包被过夜；用含质量分数为3%牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液于37 ℃封闭1 h；用含质量分数为1% BSA的PBS缓冲液将血清在96孔板中进行4倍系列稀释至3 200～204 800倍, 于37 ℃孵育2 h；用含质量分数为1% BSA的PBS缓冲液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(稀释2 500倍), 于37 ℃孵育1 h；先用TMB显色液避光显色30 min 后，再用2 mol/L硫酸终止显色. 用酶标仪检测450 nm处的吸光度，每个血清样本做3个复孔, 计算每个稀释梯度下A450的平均值. 以稀释比例为横坐标,A450为纵坐标, 用GraphPad Prism 5软件绘制柱状图. 实验组的吸光度值是对照组的2倍以上视为阳性.2.1 pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123质粒的构建pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123质粒构建示意图如图1所示. 将目的基因PP-3copy-Aβ1-6-loop123(上海捷瑞生物工程有限公司合成)通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点插入pET26b载体质粒上构建pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123，其鉴定结果如图2所示. 由图2可见, 构建载体正确.2.2 pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123质粒表达将pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123转至BL21中, 在16 ℃诱导表达, 并通过SDS-PAGE和Western blot(His标签)对蛋白表达进行检测, 结果如图3(A)所示. 由图3(A)可见, 在可溶性上清液和包涵体中, 空载体、 PP与PP-3copy-Aβ1-6-loop123有蛋白表达, 大小为37 000～50 000. 用His一抗做Western blot分析结果如图3(B)所示. 由图3(B)可见, 在37 000～50 000内有明显带, 这与PP和PP-3copy-Aβ1-6-loop123蛋白大小一致, 即目的蛋白得到表达.2.3 PP-3copy-Aβ1-6-loop123可溶性上清液的纯化对重组P颗粒可溶性表达蛋白进行纯化, 利用镍柱亲和层析方法纯化可溶性表达蛋白, 超声缓冲液与洗脱缓冲液的pH=8.0[8], 纯化结果如图4所示. 由图4可见, 其各浓度梯度咪唑洗脱在280 nm下均有吸收值, 表明各梯度下均有蛋白洗脱. 图5为重组P颗粒蛋白纯化后SDS-PAGE与Western blot检测结果. 由图5(A)可见, 根据BSA定量, 蛋白质量浓度为0.9 mg/mL, 质量分数大于90%. 由图5(B)可见, 低浓度(50,100 mmol/L)咪唑洗脱液为杂蛋白, 300 mmol/L咪唑洗脱液为目的蛋白. 图6为P颗粒蛋白与重组P颗粒蛋白的Native-PAGE检测结果. 由图6可见, PP蛋白与目的蛋白为多种多聚体混合蛋白, 即重组P颗粒蛋白具有与P颗粒自组装[3]相似的特性.2.4 PP-3copy-Aβ1-6-loop123可溶性上清蛋白SuperdexTM 200凝胶色谱层析利用SuperdexTM 200凝胶色谱层析对重组P颗粒的多聚体形式进行分析, 结果如图7所示. 首先, 对已知分子量的蛋白质标准品进行分析. 4种标准品分子量分别为440 000,158 000,75 000,43 000, 对应的出峰体积为225,260,277,280 mL. 参照4种蛋白质标准品的出峰体积, 对重组P颗粒的各多聚体形式进行分析. P颗粒蛋白主要以二聚体、 12聚体和24聚体存在[1,9-10], 重组P颗粒单体分子量为45 000, 其二聚体、 12聚体和24聚体分子量分别为90 000,540 000,1 080 000. 由图7(B)可见, 可溶性表达中共有3个明显的峰, 其中: 峰1的出峰体积为140 mL, 约为柱体积的1/3, 其蛋白分子量大于600 000, 根据重组P颗粒多聚分子量大小, 该峰分子量为1 080 000, 为24聚体形式；峰2的出峰体积为200 mL, 该峰蛋白分子量为440 000～600 000, 该范围内P颗粒蛋白分子量为540 000, 为12聚体形式；峰3的出峰体积为272 mL, 该峰蛋白分子量为75 000～158 000, 该范围内P颗粒蛋白分子量为90 000, 为二聚体形式. 与Native-PAGE结果一致, 且峰1的峰值明显高于其他峰, 即重组P颗粒蛋白主要以24聚体形式存在.2.5 蛋白的DLS与TEM分析通过DLS和TEM检测, 分析蛋白的颗粒大小, 结果如图8所示. 由图8(A)可见, 可溶性表达的PP-3copy-Aβ-1-6-loop123蛋白粒径约为25.86 nm. 由图8(B)可见, 可溶性表达的蛋白颗粒在电镜下均为球形, 大小分布均匀, 蛋白粒径约为20 nm. 由于PP颗粒24聚体的粒径为20 nm, 12聚体的粒径为14 nm, 二聚体粒径为6 nm[11], 因此可溶性表达蛋白以24聚体为主要存在形式, 与SuperdexTM 200的结果一致.2.6 蛋白免疫原性的比较将小鼠随机分为3组进行皮下免疫, 对4次免疫后的血清进行不同梯度稀释, 用ELISA检测重组P颗粒蛋白的免疫原性, 结果如图9所示. 由图9(A)可见, 经过4次免疫后, 在不同稀释度条件下, PP-3copy-Aβ1-6-loop123组在450 nm处的吸光度值均明显高于PBS组和PP组(P<0.001), PBS组和PP组区别较小. 表明蛋白PP-3copy-Aβ1-6-loop123可以在小鼠体内引起免疫反应, 目的蛋白具有特异的免疫原性. 由图9(B)可见, PP-3copy-Aβ1-6-loop123免疫原性比PP-1copy-Aβ1-6-loop123强. 表明PP-3copy-Aβ1-6-loop123对Aβ42具有更高的特异性免疫原性.综上所述, 本文成功构建了重组P颗粒蛋白质粒pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123, 并对其进行了表达纯化, 得到了较高纯度的可溶性表达重组P颗粒蛋白PP-3copy-Aβ1-6-loop123；重组P颗粒蛋白具有多种聚体, 且对Aβ42多肽具有更强的免疫原性, 为重组P颗粒蛋白作为一种新型的治疗阿尔茨海默病的蛋白疫苗奠定了实验基础.【相关文献】[1] Bereszczak J Z, Barbu I M, TAN Ming, et al. Structure, Stability and Dynamics of Norovirus P Domain Derived Protein Complexes Studied by Native Mass Spectrometry [J]. J Struct Biol, 2012, 177(2): 273-282.[2] Tomé-Amat J, Fleischer L, Parker S A, et al. Secreted Production of Assembled Norovirus Virus-Like Particles from Pichia Pastoris [J]. Microb Cell Fact, 2014, 13: 134. [3] WANG Leyi, CAO Dianjun, WEI Chao, et al. A Dual Vaccine Candidate against Norovirus and Hepatitis E Virus [J]. Vaccine, 2014, 32(4): 445-452.[4] YU Yongjiao, FU Lu, SHI Yuhua, et al. Elicitation of HIV-Ⅰ Neutralizing Antibodies by Presentation of 4E10 and 10E8 Epitopes on Norovirus P Particles [J]. Immunol Lett, 2015, 168(2): 271-278.[5] 应侠, 吴振, 雷严, 等. 阿尔茨海默病的发病机制及治疗药物研究进展 [J]. 中国药房, 2014, 25(33): 3152-3155. (YING Xia, WU Zhen, LEI Yan, et al. Alzheimer Disease Pathogenesis and Treatment of Drug Research [J]. China Pharmacy, 2014, 25(33): 3152-3155.)[6] 高玲焕, 邹莉波, 迟天燕. β淀粉样蛋白在阿尔茨海默病病因学中作用研究进展 [J]. 沈阳药科大学学报, 2008, 25(增刊1): 41-45. (GAO Linghuan, ZOU Libo, CHI Tianyan. Amyloid Protein β in Etiology of Alzheimer’s Disease [J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2008, 25(Suppl 1): 41-45.)[7] 刘新涛, 吴丛梅, 臧阳, 等. HIV-GAG质粒DNA疫苗的纯化工艺 [J]. 吉林大学学报(理学版), 2013, 51(4): 720-723. (LIU Xintao, WU Congmei, ZANG Yang, et al. HIV-DNA P Vaccine Research of Purification Technology [J]. Journal of Jilin University (Science Edition), 2013, 51(4): 720-723.)[8] YAO Lin, LI Fengling, WANG Lianzhu, et al. Function of VP2 Protein in the Stability of the Secondary Structure of Virus-Like P Particles of Genogroup Inorovirus at Different pH Levels: Function of VP2 Protein in the Stability of NoV VLPs [J]. J Microbiol, 2014, 52(11): 970-975.[9] TAN Ming, HUANG Pengwei, XIA Ming, et al. Norovirus P Particle, a Novel Platform for Vaccine Development and Antibody Production [J]. J Virol, 2011, 85(2): 753-764.[10] FANG Hao, TAN Ming, XIA Ming, et al. Norovirus P Particle Efficiently Elicits Innate, Humoral and Cellular Immunity [J]. PLoS One, 2013, 8(4): e63269.[11] LI Yingnan, FU Lu, HU Yue, et al. Establishment of a Novel Method without Sequence Modification for Developing NoV P Particle-Based Chimeric Vaccines [J]. Protein Expr Purif, 2016, 121: 73-80.。
抗体公司
赛信通（上海）生物试剂有限公司
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Protein At Beads 4FF
Protein At Beads4FF目录1.产品介绍 (1)2.纯化流程 (3)3.残留配体的去除 (4)4.填料清洗 (4)5.问题及解决方案 (4)6.订购信息及相关产品 (5)1.产品介绍Protein At Beads4FF是用于分离和纯化单克隆抗体、多克隆抗体或Fc-融合蛋白的亲和层析介质，具体性能见表1。
Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。
Protein At Beads4FF的配体蛋白Protein At是在天然蛋白A的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkaline tolerate，故缩写为At)。
该产品以0.1M NaOH进行200次在位清洗，介质载量几乎不变，以0.5M NaOH进行100次在位清洗，载量仍可达到最初载量的80%，更加方便客户尤其是工业客户的清洗操作，具体性能见图1。
该产品采用较稳定的定向偶联，脱落量低（小于10ng/mg IgG,见图2）。
Protein At Beads4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化，其耐压性能见图3，因此Protein At Beads4FF适用于工业化抗体的大规模生产。
表1.Protein At Beads4FF产品性能项目性能介质高度交联的4%琼脂糖平均粒径～90μm配体耐碱性Protein A结合载量>40mg人lgG/ml介质化学稳定性可耐受抗体纯化过程中的所有试剂工作pH3-12在线清洗0.1-0.5M NaOH线性流速50-300cm/h保存含20%乙醇的1XPBS，2℃-8℃图1.Protein At Beads 4FF 的CIP 清洗图2.CIP 清洗后Protein At 脱落量图3.介质的压力/流速曲线（层析柱BPG300,柱高20cm）V e l o c i t y (c m /h )Pressure(MPa)2.纯化流程2.1缓冲液的准备所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
乳酸脱氢酶的分离纯化及其催化合成苯乳酸的研究进展
Recent advances in separation of lactate dehydrogenase and its applications in catalytic synthesis of phenyllactic acid
FU Minxia, ZHU Lingyu, YUN Junxian
收稿日期：2018-01-22；修改日期：2018-03-01。 基金项目：国家自然科学基金（21576240）及浙江省自然科学基金 （LZ14B060001）项目。
第一作者：富敏霞（1992—），女，硕士研究生，研究方向为传质与分离。 E-mail：fumx123@。通讯作者：祝铃钰，教授，博士生导师， 研究方向为分离工程及化工过程优化。E-mail：zhuly@。
1 乳酸脱氢酶的主要来源
乳酸脱氢酶广泛存在于微生物和动物各种组织 之中，不同来源的乳酸脱氢酶性质差异较大[27-30]。 按照催化生成苯乳酸构型不同，可将乳酸脱氢酶分 为 D- 乳 酸 脱 氢 酶 （ D-LDH ） 和 L- 乳 酸 脱 氢 酶 （L-LDH），分别催化苯丙酮酸生成有光学纯度的 D-苯乳酸和 L-苯乳酸。 1.1 微生物来源
2 乳酸脱氢酶的分离纯化方法
除了核酶以外，大多数酶本质上是蛋白质，其 分离纯化的重点不仅需要考虑目标蛋白质与其他杂 蛋白的分离，同时更加关注酶的稳定性。目前，从 微生物中分离纯化乳酸脱氢酶的步骤主要包括细胞
His蛋白大量纯化
1）构建克隆2）转化BL21 codon plus，先小摇50mlBD管子，双抗，0.3mM IPTG，25℃，5h（经验值），检测蛋白表达情况，3）挑单克隆于100ml培养基中（250ml瓶），至菌液浑浊4）大摇2.5L，分5瓶（2L），每瓶500ml（上限），每瓶加15ml 菌液，单抗，测其OD值，至OD600在0.6-1.0之间，取菌液1ml(每瓶200μl)，0.3mM IPTG，25℃，5h5）Lysis buffer配制：用50 mlBD管子，加5mM(1-5mM)咪唑（5M 储液，PH 8.0 4℃避光）除去非特异性，1mM cocktail，PMSF要多加（3-4倍），不可加DTT（对镍柱不利）、二价离子将菌体取出，融化，按1L菌液加30ml lysis buffer 的比例，将菌体充分悬浮（注意吹打时将吸管插入液面以下，减少气泡的大量产生），可分次加入，将菌体转移至BD管子中，转移干净菌体悬起后，加入1%Triton，1mg/ml的溶菌酶（1:100，可不加），转移至100ml小烧杯中，超声处理（一般200W，15+15 2000s）(注意墙头插入液面以下，避免大量气泡的产生)，此时菌液由粘稠变得一滴一滴6）将超声后的菌液转入50ml大抽离心管中，配平，18000rpm 30min或14000rpm 15min 2次7）Beads处理（可在超声过程中进行，Beads不能干）：2L菌体加4mlbeads，取8ml于15mlBD管子中，500g 3min（1000rpm 5min），用不含任何东西的lysis buffer重悬，Wash2-3次（10倍Beads体积），洗去乙醇，之后分成两份用lysis buffer浸没，置于4℃冰库或冰上8）将上清转入50ml管子中，将Beads也转入，留少许上清洗Beads，转移干净，4℃ 2h，孵育好后，将管子取出，静止一段时间，让Beads沉淀，缩短后面过柱子的时间9）先将上清转入柱子中，再将Beads也转入，4℃，让液体流出，回收存放10）先用10mM 咪唑的Lysis buffer 洗涤（总体积100ml，前50ml 加1mMPMSF）（洗涤期间可轻轻吹打Beads），再用20mM咪唑的lysis Buffer洗涤（总体积100ml，不加PMSF）（PMSF影响抗体制备），Wash总体积是Beads的50倍。
生物分离工程
绪论1、生物分离工程的定义：从发酵液或酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。
2、生物分离工程特点：1发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液；2培养液是多组分的混合物；3生化产品的稳定性差；4对最终产品的质量要求高。
3、生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？答：1、发酵液的预处理与固液分离，过滤(filtration) 、离心(centrifugation) 2、初步纯化，沉淀(precipitation) 、萃取(extraction) 、吸附(adsorption )、膜分离(membrane separation) 3、高度纯化，色谱(chromatography )、电泳(electrophoresis) 4、成品加工，结晶(crystallization) 、干燥(drying)。
4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？答：1、产品价值2、产品质量3、产物在生产过程中出现的位置4、杂质在生产过程中出现的位置。
5、产品和主要杂质独特的物化性质6、不同分离方法的技术经济比较。
5、阐述生物分离工程的发展动向。
答、1、基础理论研究2、提高分离过程的选择性3、开发分离介质4、提高分离纯化技术5、清洁生产6、规模化、工程化研究6、分离效率的评价：目标产物的浓缩程度、分离纯化程度、回收率第二章细胞分离与破碎Cell isolation and disruption1 如何预处理发酵液？答：1.高价无机离子的去除方法去除钙离子：通常使用草酸。
去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。
去除铁离子：加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
2、杂蛋白质的除去：沉淀、吸附法、变性法、凝聚Coagulation和絮凝flocculation 3.有色物质的去除及其他：使用吸附剂去除有色物质(离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等) 、用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性浑浊物、使用惰性助滤剂、加入反应剂2 凝聚和絮凝的区别答：凝聚：向胶体悬浮液中加入电解质，由于双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集(1mm左右)的现象。