大肠杆菌转化实验(热击法)
大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...
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由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
质粒导入大肠杆菌的方法
质粒导入大肠杆菌的方法
质粒导入大肠杆菌是一种常见的基因转移方法，可用于表达外源蛋白、构建遗传工程菌株等。
以下是质粒导入大肠杆菌的方法：
1. 选择合适的质粒：选择适合自己实验需要的质粒，通常选择含有适当启动子、选择标记和插入位点的质粒。
2. 制备大肠杆菌：制备大肠杆菌并使其处于快速生长期。
建议使用能够耐受抗生素的大肠杆菌菌株，如DH5α。
3. 质粒导入：将质粒导入大肠杆菌中，常用的方法有热激法、电转法、微注射法等。
其中，热激法是最简单的方法，只需将质粒与大肠杆菌一起加热，使其发生热冲击，从而使质粒进入大肠杆菌细胞内。
4. 筛选转化菌株：将导入质粒的大肠杆菌菌液均匀涂布在含有适当抗生素的固体培养基上，培养过程中，只有带有质粒的菌株才能生长。
5. 鉴定转化质粒：将筛选出的转化菌株进行PCR检测、酶切鉴定等，以确认质粒已经成功导入并稳定保存在大肠杆菌中。
总之，质粒导入大肠杆菌是一种简单易行的基因转移方法，能够有效实现外源基因的表达和遗传工程菌株的构建。
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转化时热激的温度
转化时热激的温度是多少
转化时热激的温度是42°，这个42℃的数值是经过技术条件优化而来的。
热激可以使细胞上吸附的DNA进入细胞内，增加转化效率，然后就开始用不同的温度做实验，发现热激温度低了，转化效率太低，温度高了，细菌抵抗不住，最后发现42℃热激的转化效率最高，就以42℃为准。
大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
结题摘要
脱水耐性是种子抵御外界脱水胁迫的一种重要特性，对种子的贮藏和种质资源的保存具有重要意义，但目前对种子脱水耐性的机理研究尚不透彻。
大量研究表明，棉子糖系列寡糖对种子脱水耐性具有重要的生理意义，前期实验克隆得到了油菜肌醇半乳糖苷合成酶基因BnGolS1的启动子序列，并通过GUS组织化学染色实验证明了其启动子活性。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
(完整word版)质粒的转化(热激法)
实验四质粒的转化质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。
可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。
实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤：1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；2．取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3．每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；4．热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；6．复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；7．布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法实验原理利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。
试剂与器材1.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。
2.LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3.0.1mol/L CaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。
4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。
5.质粒6.大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌7.恒温水浴箱8.超净工作台9.高速冷冻离心机10.恒温摇床11.恒温箱12.消毒离心管13.消毒tips 14.玻璃培养皿直径90mm 15.玻璃涂布器16.95%乙醇17.标记笔实验方法与步骤1、制备含有Amp抗生素的LB平板，终浓度为50ug/ml2、取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入20ul 质粒T+G(提取的质粒DNA稀释500X)，用移液器轻柔混匀。
冰上静置20min。
3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。
整个过程不要振荡菌液。
4、加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5、取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。
6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。
7、计算转化率8、统计每一个培养皿中的菌落数。
9、转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：10、转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积;11、转化频率(转化子数/μg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(μg)2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH-5α：（实验流程如下所示）100ul感受态细胞DH-5α+重组质粒───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42 ℃,热激120S───→冰浴2min───→400ulLB培养基───→37℃, 50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h冻融法质粒DNA转化至大肠杆菌操作步骤1. 取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
课件：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验材料与耗材
➢ 实验材料：大肠杆菌菌株JM109细胞，待转化的重 组DNA分子（含有Ampr）。
➢ 耗材：培养皿，三角瓶，玻璃推子，移液器（规 格1000μl、100μl、10μl），1.5ml离心管。
➢ 试剂：CaCl2，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl， NaOH，氨苄青霉素
实验步骤
菌株活化 ➢ 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它 操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
实验步骤
转化率统计 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞的实验技术。 2、掌握热激转化实验技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指外 源DNA导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗 溶液中，菌体细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择 性培养基中保温复苏一段时间，促使在转化过程中获得的新 的表型（如Amp）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有 氨苄青霉素的选择性培养基上，进行转化结果的筛选。
预冷10min ➢ 4000rpm离心5 min,弃上清 ➢ 加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即
可使用。也可加入总体积15％的甘油70℃长期 保存
实验步骤
转化 ➢ 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放
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大肠杆菌转移真验（热打法）之阳早格格创做
大肠杆菌转移不妨：（1）将沉组DNA分子导进大肠杆菌受体细胞举止复造，删殖战表黑，以赢得脚段基果；（2）考证大肠杆菌体验态细胞效验；（3）用于分子死物教其余钻研.
1本理：
量粒DNA粘附正在细菌细胞表面，通过42°C短时间的热打处理，促进吸支DNA.而后正在非采用培植基中培植一代，待量粒上所戴的抗菌素基果表黑，便不妨正在含抗菌素的培植基中死少.
2器材：
旋涡混同器，微量移液与样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，单里微量离心管架，搞式恒温气浴（或者恒温火浴锅），造冰机，恒温摇床，培植皿（已铺佳固体LB-Amp），超洁处事台，酒粗灯，玻璃涂棒，恒温培植箱.
3资料战试剂：
量粒DNA，沉组DNA，培植基（没有加抗菌素），LB培植基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal.
4真验准备：
无菌ddH2O，1.5ml离心管拆进铝造饭盒（灭菌）、移液器吸头拆进相映的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal （M/V，用N,N-两甲基甲酰胺配）.
5支配步调：
（1）预先将恒温火浴的温度调到42℃.
（2）从-70℃超矮温冰柜中与出一管（100μl）体验态菌，坐时用脚指加温融化后拔出冰上，冰浴5~10min.
（3）加进10μl连交产品（普遍是局部连交产品）（DNA含量没有超出100ng），沉沉震荡后搁置冰上20min.
（4）沉沉摇匀后拔出42℃火浴中90秒举止热戚克，而后赶快搁回冰中，静置3~5min.
（5）正在超洁处事台中进与述各管中分别加进900μl LB培植基（没有含抗菌素）沉沉混匀，而后牢固到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min
（6）正在超洁处事台中与上述转移混同液100~300μl，分别滴到含符合抗菌素的固体LB仄板培植皿中，用酒粗灯烧过的玻璃涂布棒涂布匀称（注意：玻璃涂布棒上的酒粗燃烧后稍等片刻，待其热却后再涂）.
（7）如果载体战宿主菌符合蓝黑斑筛选的话，滴完菌液后再正在仄板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒粗灯烧过的玻璃涂布棒涂布匀称.
（8）正在涂佳的培植皿上搞上标记表记标帜，先搁置正在37℃恒温培植箱中30-60min曲到表面的液体皆渗透到培植基里后，再倒置过去搁进37℃恒温培植箱过夜.
（9）正在被细菌传染的桌里上喷洒70%乙醇，揩搞桌里，写真验报告.
（10）瞅察仄板上少出的菌降克隆，以菌降之间能互相分启为佳.注意红色菌斑.。