植物组织中过氧化物酶活性的测定
植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
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辣根过氧化酶的表达和酶活性测定
辣根过氧化酶的表达和酶活性测定辣根(Garden radish)是一种食用根菜，辣根中含有大量的过氧化酶(peroxidase)，这种酶可以催化物质的氧化还原反应，具有重要的生物学意义和应用价值。
本文将介绍辣根过氧化酶的表达和酶活性测定。
一、植物基因工程的原理和方法植物基因工程是将外源基因导入植物体内，使其表达所需的蛋白质，以达到改良植物性状和提高产量等目的。
主要方法包括以下几个步骤：1.选择载体：通常采用质粒作为载体，其优点是易于操作、成功率高、适用于多种植物等；缺点是获得的转基因植物往往存在多个拷贝数、位置不固定等问题。
2.克隆外源基因：从外源来源中克隆所需要的基因，通常采用PCR或酶切法进行操作。
3.构建基因转化载体：将外源基因与载体进行连接，构建基因转化载体。
4.基因转化：将构建好的基因转化载体通过农杆菌或基因枪等方法导入植物细胞，使其被转化。
经过选育和筛选后，可以选择对应的转化植株进行表达和性状分析。
二、辣根过氧化酶的表达过氧化酶是一种重要的生物催化剂，广泛存在于植物、动物和微生物等生物体内。
辣根中的过氧化酶具有比较高的催化活性，因此对于其表达成为了许多研究的重要方向。
下面就介绍几种常用的表达方法。
1. 转基因植物表达法通过外源基因的转入，使植物细胞内部合成所需的蛋白质。
相比细胞培养和分离提取等方式，这种方法更具有稳定性和可控性。
2. 细胞培养和分离提取法采用感光荧光素光反应，测定培养细胞或组织提取物中的过氧化物酶活性，以此测定过氧化酶的表达。
3. 重组工程菌表达法将辣根过氧化酶基因克隆到大肠杆菌等可表达目的蛋白质的菌株中，使其高效表达，从而为进行治疗和检测等方面提供重要基础。
三、辣根过氧化酶的酶活性测定方法1. 常规方法-光度法光度法是一种基于酶催化产物的吸光度变化的测定方法。
常用的基质是苯酚，产生硫酸化产物。
方法简单，测量结果准确，但是缺点是需要消耗大量的试剂和设备。
此外，在测定过程中也可能出现误差。
第5组短命植物对盐胁迫的生理响应
三、材料、仪器及试剂
1.实验材料： 小麦幼苗：对照；100mM、200mM NaCl处理48h；5%、15% PEG-6000处 理48h 2.仪器： 天平，烧杯 ，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶 头滴管，水浴锅 3.主要试剂： 3%磺基水杨酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿弃入下水道，请回收）、 2.5% 酸性茚三酮溶液（60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至 100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、 脯氨酸标准母液：精确称取 25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸 馏水溶解，然后倒入500 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准 液中脯氨酸浓度50 μg /ml。
五、结果计算
酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示：
酶活（酶分解的H2O2 mg/g鲜重）
式中： Ａ-----对照用KMnO4 ml数 Ｂ-----酶反 应后KMnO4滴定ml数 Ｖt---- 酶液总量 ml Ｖ 1---- 反应 所用酶液量ml Ｗ-----样品鲜重(g) 1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4 相当于 1.7mg H2O2 [ 注意 ] ．所用KMnO4 溶液及 H2O2 溶液使用前要经过 标定，0.1mol/l H2O2要新配制。
四、实验步骤
1. 酶液提取： 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少 量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，将研钵冲洗干净， 冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容， 4000rpm 离 心。 （上清液即为过氧化氢酶粗提液） 2. 取50ml三角瓶4个 （两个测定两个对照） ， 测定加入 酶液2.5ml， 对照为煮死酶液2.5ml； 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2 ，同时计时间，于 30 ℃恒温水浴中保温 10分 钟，立即加入10％H2SO4 2.5ml。 3. 用0.1mol/l KMnO4 标准溶液滴定 H2O2，至出现粉红色 （在30分钟内不消失）为终点。
研究生植物生理学实验教案
研究生植物生理学实验教案教师：***农学院生物技术系实验一 植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD ）、过氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD ）等。
它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。
所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（•2O ）的酶，它催化下列反应：2反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生•2O ，•2O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。
后者在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除•2O 从而抑制了甲的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活性单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx ）；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】1．50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称取1.939 9g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml 。
4．750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液：称取61.33mg NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，现配先用，避光保存。
植物组织SOD活性测定
植物组织SOD 活性测定一、实验目的1、了解还原法测定抗氧化酶活性的原理与方法。
2、熟悉植物叶片ROS 清除机制。
二、实验原理植物在受到光、温度、干旱、盐、碱等胁迫时会产生活性氧和自由基，而活性氧和自由基会抑制植物生长、损伤细胞结构和功能、使膜脂过氧化、破坏生物大分子的结构功能等。
植物本身也会抵抗这种逆境，其自身的酶系统和非酶系统会产生相应的物质以清除活性氧和自由基，酶系统：超氧化物歧化酶（SOD ），超氧化物酶（POD ），过氧化氢酶（CAT ），抗坏血酸过氧化物酶（APX ）；非酶系统：维生素系列（Vce ），谷胱甘肽（GSH ）。
核黄素在照光条件下会将氧气还原为超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT 作用会产生蓝色的甲䐶，而SOD 会抑制超氧阴离子自由基与NBT 的反应。
三、材料未处理的小麦叶片；0℃处理小麦叶片3-5min 。
四、试验步骤1、酶液提取：称量小麦叶片（ck 、0℃）各0.5g ，预冷研钵，加2ml 预冷提取介质（磷酸缓冲液），冰态研匀浆，介质冲洗研钵2-3次，定容10ml 。
取5ml ，两管平衡（0.01g ），对角线放置，4℃离心10min ，取上清液（粗酶液）。
2、显色反应取4支专用试管，按下表加入试剂 1（As1） 2（As2） 3（照光） 4（不照光，调零）buffer1.51.51.51.5OH O H O O H O H O H OH O H O O POD CAT SOD222222222222−−→←+−−→−→→→•−−−→−•-met 0.3 0.3 0.3 0.3 NBT 0.3 0.3 0.3 0.3 EDTA-Na 2 0.3 0.3 0.3 0.3 20uml 核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 ddH 2O0.50.50.60.6混匀后4号罩黑布，其它各管在4000lux 光下反应20min （25-30℃）根据酶活调整反应时间，反应结束后遮黑布终止反应，4号作空白调零，560nm 测吸光值。
(完整版)实验35过氧化氢酶的活性测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积.H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性.一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定.在一定范围内,其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系.【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30％分析纯H2O257μl,溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5％（W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水.【方法】1。
制作标准曲线：取10ml离心管7支,顺序编号，并按表40—1加入试剂.待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色.2.样品提取和测定：（1）称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35—1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
(3）向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算:植物组织中H2O2含量（μmol/g Fw）=式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）;V t—样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积（ml）；FW-植物组织鲜重(g）。
CAT酶活性测定
植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。
3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（）【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。
取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用。
活性测定（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后,逐管加入L的H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。
（需用石英比色杯）3.结果计算：以1min内A240降低（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中 ∆A 240 = A S0－—A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2,As 3—样品测定管吸光值； Vt —酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；—A 240每下降为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
过氧化氢酶活力的测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：实验35过氧化氢酶的活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积。
h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此，植物组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
一、过氧化氢含量的测定【原理】h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。
在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】100μmol/Lh2o2丙酮试剂：取30%分析纯h2o257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
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实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定
一、实验目的：
1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验原理：
过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。
在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。
三、实验仪器及材料：
1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表
2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4
四、实验步骤：
1、POD的提取
分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。
2、POD活性的测定
取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。
取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。
五、实验结果：
1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。
2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：
苹果酶液OD值与时间的关系曲线图
以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：
苹果POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D
=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D
（此值忽略稀释倍数）
其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数
绿豆幼苗酶液OD值与时间的关系曲线图
绿豆幼苗POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D
=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D
（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）
由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D
六、结果分析：
1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。
2、由于仪器较少，等待测OD值的时间较长，且没有放在低温下保持，导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。
3、通过计算可知，经过逆境处理的绿豆幼苗POD值远远大于苹果的POD值，说明绿豆幼苗的过氧化氢酶活性比苹果的要大，原因是逆境处理的绿豆幼苗含较多H2O2，生成较多过氧化氢酶以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。
4、理论上OD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系，可能原因有：①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到30s读取OD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。
②绿豆幼苗酶液浓度值偏高。
③离心出来的酶液在室温下放置时间过长。
七、结果分析实验思考题：
1、计算各植物材料的POD酶活性的大小。
苹果POD活性为0.52D ，绿豆幼苗的POD活性为12.67D
2、测定本酶活力需要控制哪些条件？
（1）保持待测材料的酶活，如放在低温下保存；
（2）测定时注意控制反应时间，酶液与3ml反应混合液混合后，尽量快速开始测定OD值，以及控制读数的时间间隔；
（3）使酶处于最适Ph下。