(精编资料推荐)氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离鉴定 纸层析法实验报告
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
而氨基酸的分离鉴定则是研究蛋白质的前提和基础。
本次实验使用纸层析法对氨基酸进行了分离鉴定。
首先，我们需要了解一下纸层析法的原理。
纸层析法是一种基于分子大小和亲水性的分离技术，常用于生化分析中。
其原理是通过纸张上固定的固定相（通常是硅胶或纤维素）与待分离物质之间的相互作用来实现分离。
待分离物质在移动相（溶液）的推动下，根据其与固定相的亲水性和大小的差异，以不同的速度在纸上移动，从而实现分离。
在实验中，我们使用了两种氨基酸溶液进行分离鉴定。
首先，我们需要准备好实验所需的材料和试剂，包括纸层析纸、氨基酸溶液、显色剂等。
然后，将纸层析纸剪成适当大小的条状，用铅笔在纸上标记出起点线和终点线。
接下来，我们将纸层析纸的一端浸入移动相（溶液）中，使其吸满溶液后取出，待溶液在纸上上升到起点线时立即停止。
然后，将氨基酸溶液滴在起点线上，待其渗透进纸层析纸后将纸张平放在容器中，盖上盖子，保持相对湿润的环境。
随着时间的推移，溶液将在纸上上升，并逐渐分离成不同的组分。
不同的氨基酸在纸上的迁移速度受到其亲水性和分子大小的影响。
亲水性较强的氨基酸会更容易被纸上的固定相吸附，从而迁移速度较慢，而亲水性较弱的氨基酸则会迁移得更快。
当溶液上升到终点线时，我们将纸张取出，用显色剂处理。
显色剂可以与氨基酸发生反应，产生可见的色带。
通过比较色带的位置和颜色，我们可以确定不同氨基酸的迁移速度和存在量。
实验结果显示，我们成功地将两种氨基酸分离开来，并且确定了它们的相对迁移速度。
这为进一步的氨基酸分析和蛋白质研究提供了基础数据。
同时，我们还发现，在纸层析过程中，一些氨基酸可能会发生相互作用，导致它们的迁移速度发生变化。
这提示我们在进行氨基酸分析时需要考虑到可能的相互作用因素。
总结起来，纸层析法是一种简单、经济且有效的氨基酸分离鉴定方法。
通过该方法，我们可以快速地分离出不同的氨基酸，并确定它们的相对迁移速度。
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。
惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。
水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。
展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。
分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。
不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。
●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
●层析溶剂由有机溶剂和水组成●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、材料与方法（1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮（2）操作步骤1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。
2．准备滤纸：取层析滤纸一张。
在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。
3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。
干后再点一次。
4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。
氨基酸的分离与鉴定
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法目的要求（1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。
（2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。
原理滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。
滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。
流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示：溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。
此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。
无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。
氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。
本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。
然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。
试剂和器材一、试剂（1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。
（2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。
将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。
（3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。
5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。
（4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。
氨基酸鉴定实验报告
氨基酸鉴定（纸层析法）醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白一．实验目的1.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。
2.学习氨基酸纸层析法的基本原理3.掌握氨基酸纸层析的操作技术二．实验原理二．实验原理1）氨基酸的分离鉴定——纸层析法纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。
所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：在一定条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
2）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳.醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。
涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。
该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。
醋酸纤维素薄膜电泳有以下优点：微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象蛋白质是两性电解质。
在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。
血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。
一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。
其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。
二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。
（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。
（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。
2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。
（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。
（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。
（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。
（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。
3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。
然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。
三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。
2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。
3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定纸层析法——氨基酸的分离与鉴定⼀、实验⽬的1、了解纸层析法的使⽤原理。
2、掌握⽤纸层析法分离蛋⽩质的操作步骤。
⼆、实验原理1、纸层析法是以滤纸作为惰性⽀持物的分配层析⽅法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲⽔基团，滤纸吸附⽔作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。
当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲⽔、疏⽔能⼒不同，在两相之间不断分配，疏⽔能⼒强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲⽔能⼒强的移动距离则较近。
2、所有的氨基酸的α碳上均连接⼀个氢原⼦和两个亲⽔基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），唯⼀的不同则在于R基团。
因此R基团在氨基酸的亲⽔疏⽔能⼒对⽐中起到了决定性的作⽤。
本实验采⽤丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲⽔疏⽔能⼒迥异，能在滤纸上明显分开。
3、Rf值表⽰原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离与原点中⼼⾄流动相前沿的距离⽐。
在⼀定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本⾝的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。
在测量原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，⼀般取斑点的重⼼，测量出重⼼与起点的距离即可。
4、显⾊原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发⽣作⽤⽣成紫⾊物质。
三、试剂（⼀）提前配制试剂8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。
（将上述三种溶液装于⼩瓶中实验时，每两组共⽤⼀组试剂）正丁醇88%甲酸蒸馏⽔茚三酮晶体注：实验时，以上试剂均为每两组同学共⽤⼀组试剂。
氨基酸纸层析分离鉴定
1.本实验中滤纸的作用是什么？答：惰性支持物2.实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？答：吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。
3.R f值的含义、影响因素？答：R表示溶质在滤纸上的移动速度。
在一定的条件下某物质的Rf f值是常数，可作为定性分析的依据。
Rf 值大小与样品物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量及温度、样品溶液中的杂质等因素有关。
4.R f值为多少范围内可以确定为同一物质？答：样品与标样差值<0.05为同一物质。
5.层析滤纸和普通滤纸有什么区别？答：层析滤纸，组成该滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。
纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。
对于复杂的混合物，可做双向层析。
普通滤纸，由棉质纤维组成，按不同的用途而使用不同的方法制作。
由于其材质是纤维制成品，因此它的表面有无数小孔可供液体粒子通过，而体积较大的固体粒子则不能通过。
这种性质容许混合在一起的液态及固态物质分离。
6.为什么要平衡？平衡剂和扩展剂是同一物质吗？答：平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和, 是物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中7.用手直接接触滤纸会引起什么不良后果，为什么？答：人手上含有汗渍（内涵氨基酸和干扰物）会干扰试验。
8.缝制的纸筒如果两边缘相靠会造成什么后果？答：如果缝制的纸筒两边缘相靠的话会造成展开剂上升速度不均匀，影响氨基酸的分离，使得实验所得Rf值不准确。
9.为避免实验结果出现“拖尾”现象，实验操作中应注意哪些环节？答：①层析滤纸要质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开；②点样时尽量将它们点在同一个点上，等一个干了再点下一个；③要保证层析滤纸不被污染，特别是从点样线到溶剂前沿的部分；④各氨基酸样品点样时量要均匀，量要适中。
10.标记滤纸不能使用油性笔，为什么？答：油性笔的油墨属于有机物，也会发生层析反应，以至于影响氨基酸的层析效果。
试验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法
=
原点到层析点中心的距 离 原点到溶剂前沿的距离
Kd↑，则Rf↓ [正向色谱]固定相的极性大于流动相的极性，非极性或极性小的溶质分子移动速度快。
[反向色谱]
小于
，极性大的溶质分子移动速度快。
影响 Rf 值的主要因素： 1. 物质结构的影响。物质极性大小决定其在水和有机溶剂中的分配情况，酸性与碱性AA的极 性大，在水（固定相）中分配多，Rf值低。另—CH2—是疏水基团，—CH2—长则极性降低。 2. 溶质与溶剂间的相互作用。溶质与溶剂间若形成氢键，对分配系数影响大，水大多都能与 溶质形成氢键，对溶质的引力就大。 3. PH 值对 Rf 的影响。PH 值变化影响溶质解离度，极性强的物质在溶剂中偏极性强的一相。 4. 滤纸的影响。 5. 温度的影响。
[分配系数]是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用 K
来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
kd
=
Cs Cm
Cs：固定相中的浓度；Cm：流动相中的浓度。
[迁移率]（或比移值）是指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流
动相本身移动的距离之比值。常用 Rf 来表示。 R f
层析法各种各样，但基本原理是一致的。它是利用混合物中各组分理化性质（分子形状和大小、 带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力等）的差别，使各组分以不 同程度分布在两相中，其中一相为固定的（称为固定相），另一相则流过此固定相（称为流动相）， 造成流动相对固定相作单向相对运动，流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移，使各组分迁移 速度不同，而对物质进行分离的方法。固定相可以是固体、液体或一种固体和一种液体的混合物， 而流动相可以是一种液体或一种气体。
氨基酸的分离纸层析法
增加实验次数
综合多种方法
通过增加实验次数，可以降低实验误差， 提高分离效果的可靠性。
可以结合其他分离方法如电泳、高效液相 色谱等，以提高氨基酸的分离效果。
05 结论
纸层析法在氨基酸分离中的应用价值
高效分离
纸层析法能够将氨基酸 进行高效分离，具有操 作简便、分离效果好的
优点。
成本低廉
纸层析法所需材料成本 较低，适合大规模分离 操作，降低了生产成本。
定型方法
选择适当的定型方法，如自然晾干、 加热或使用定型剂等，以固定氨基酸 的位置并保持其稳定性。
04 实验结果分析
分离效果的评价
分离度
通过比较不同氨基酸的迁移距离，可以评估分离效果。分 离度越大，说明氨基酸之间的分离越完全。
分辨率
分辨率是评价纸层析分离效果的重要参数，它反映了氨基 酸在层析图谱中的清晰程度。分辨率越高，层析图谱越清 晰。
02 纸层析法的基本原理
纸层析法的分离原理
纸层析法是一种基于不同物质在固定相和流动相之间分配系数差异的分离技术。 在纸层析法中，固定相是纸上的纤维素，流动相是展开剂。当流动相携带待分离 物质通过固定相时，由于分配系数不同，不同物质在固定相和流动相之间发生分 离。
氨基酸在纸层析法中的分离是基于它们的极性、相对分子质量和其它物理化学性 质的差异。极性较弱的氨基酸在流动相中的溶解度较大，移动较快；极性较强的 氨基酸在固定相中的溶解度较大，移动较慢。
疾病诊断和治疗
某些氨基酸的缺乏或过量与某些 疾病有关，检测氨基酸水平有助 于疾病的诊断和治疗。
纸层析法的简介
定义
应用
纸层析法是一种基于滤纸的层析技术， 用于分离和鉴定混合物中的组分。
纸层析法广泛应用于生物、化学和医 学领域，用于分离和鉴定各种化合物， 如氨基酸、糖类、脂类等。
实验三 氨基酸的分离鉴定
实验三氨基酸的分离鉴定—纸层析法一、实验目的通过对氨基酸的分离，学习运用纸层析法分离混合物的基本原理，掌握纸层析的操作方法。
二、实验原理纸层析从层析原理来讲属于分配层析，它是以纸作固定相的载体，纸纤维上的羟基具有亲水性，因此滤纸吸附的水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展开，样品中的各种溶质（如氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，因此不同的溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf＝原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离只要条件（如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。
故可根据Rf值作定性分析。
无色物质的纸层析图谱可用显色法鉴定，氨基酸纸层析图谱常用茚三酮作为显色剂。
三、仪器与试剂（一）实验器材大烧杯（1个）、毛细管（10支）、喷雾器（公用）、培养皿（1个）、层析滤纸（2张）、烘箱、镊子（1把）、刻度尺、铅笔、针线、手套（二）实验试剂1、扩展剂：是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。
将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。
2、氨基酸溶液：0.5％缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸溶液：分别称取上述5种氨基酸各0.5g，分别溶于20ml蒸馏水中，测其pH值并用5％KOH或HCl调至中性，然后用pH7.40.01mol/L磷酸缓冲液稀释至100ml。
PH7.4时Na2HPO4溶液与NaH2PO4溶液的体积比为81∶19。
样品1：用等量的组氨酸、谷氨酸、亮氨酸溶液混合。
样品2：用等量的缬氨酸、甘氨酸溶液混合。
3、显色剂：50~100mL0.5%水合茚三铜正丁醇容液。
四、操作步聚1.检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内100℃烘干。
2.平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL 展层溶液的小烧杯置于倒置的大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。
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1
氨基酸的分离（纸层析法）
一、实验原理
1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学
性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组
分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而
得到有效的分离。
操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等
分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等
2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水
组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间
形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在
水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。
由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
分配系数 溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度
物质被分离后在滤纸上的移动速率用 值表示：
原点到层析点中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变， 值是常数，故可根据 值作定性
依据。
氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
二、实验器材
标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。
三、实验试剂
1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2
2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5
四、实验操作
1、点样
量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。
戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。
在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点
作为点样原点。
用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风
冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。
2、层析与显色
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2
将滤纸卷成圆筒形，用钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。
将滤纸垂直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖（点样点的一端
朝下，展层剂液面需低于点样线1cm左右）。
待溶液前沿线距滤纸末端1~2cm（展层长度10cm，约2h）后，取出滤纸（需
带上手套），用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干（通风橱
中进行），即可看见层析斑点。
3、结果处理
用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到
层析前沿的距离，计算各种标准氨基酸的 值，并根据样品分离的情况鉴定混合
样品中氨基酸的组分。
五、结果与讨论
1、层析图谱
2、数据处理
Gly Phe Pro His 样品Y09
中心到原0.4 3.75 1.65 1.60 0.45 01.20 3.71
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3
点距离/cm
前沿/cm 10.3 9.75 9.55 9.50 9.85
/cm
0.0388 0.385 0.173 0.168 0.0457 0.122 0.377
参考 值
0.30 0.73 0.48 0.11 —— —— ——
3、将样品的层析图谱与标准氨基酸层析图谱对比得出，样品中含有的氨基酸是：
苯丙氨酸、脯氨酸和组氨酸。样品层析图谱中最下方的斑点难以判断是组氨酸还
是甘氨酸，结合 值和斑点的形状与颜色，初步判断是组氨酸。
4、本次层析的结果不好，各标准氨基酸的 值与参考值相差较大（偏小），且样
品的层析方向不垂直，斑点的朝向也不一致。如果仅仅是层析时纸筒没有放平，
也不可能出现斑点朝向不一致的现象。
将有层析结果的滤纸放置两天后，变成了以下情形：
图中显示，层析溶剂出现了明显的分层（水相和有机相），可能是因为层析
缸内壁有较多水，破坏了溶剂的比例。由于正丁醇与水的互溶有一定限度，过多
的水与有机相无法互溶。到层析后期，有机相大部分到滤纸上时，水相开始接触
滤纸并向上移动。由于水相的存在切断了有机相与下方溶液的通路，有机相无法
再向上移动，而水相不断在扩大其“势力范围”。因为有机相无法继续上移，有
机相中溶解的氨基酸也无法随溶液移动，因此 值也测不准确。
由图可以看出，层析斑点的形状与水相和有机相的分界线轮廓匹配，从而解
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释了为何斑点的朝向不一致。因为到层析后期，层析速度慢的氨基酸只能停留在
水相与有机相的交界处。
5、实验总结与改进：
1）在做纸层析时，应严格保证展层剂各组分的比例，因为 值与展层剂的组成
密切相关，且比例不对时还可能引起展层剂分层，严重影响实验结果。
2）将纸筒放入层析缸时一定要小心放平，否则层析方向会偏，后续测量层析点
到原点的距离时容易产生误差。
3）实验时一定要避免用手直接接触滤纸，也不要将滤纸随意放置，否则容易沾
上蛋白质或氨基酸，给实验带来干扰。
参考文献：
1.杨 丽，尤 丽，叶金秀，袁 燕，《纸层析分离鉴定氨基酸实验的改进》，云南
民族大学学报，2011 年 5 月，第 20 卷 第 3 期。