拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的 转化
不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化
不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化孙菲菲;侯喜林;李英;高红亮;张昌伟【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2009(042)002【摘要】[目的]克隆不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR),并转化拟南芥做初步的功能鉴定.[方法]采用分段RT-PCR及YRACE和5'RACE技术克隆了BcNR基因的金长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析.构建pCAM-BcNR 植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol·L-1KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性.[结果]获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR)的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸.其氨基酸序列与拟南芥、烟草,甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性.蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型.GenBank登录号为EU662272.转基因拟南芥T0代植株进行GVS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中.硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高.[结论]本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础.【总页数】11页(P577-587)【作者】孙菲菲;侯喜林;李英;高红亮;张昌伟【作者单位】南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京,210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京,210095;南京农业大学园艺学院,南京,210095;南京农业大学园艺学院,南京,210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京,210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】S6【相关文献】1.紫叶油菜硫同化还原酶基因APR2的克隆及在拟南芥中的遗传转化 [J], 张宏; 李刚; 韩凤英; 赵福永2.不结球白菜硝酸还原酶基因cDNA的克隆及序列分析 [J], 孙菲菲;侯喜林;李英;崔秀敏3.拟南芥中eIF-5A基因的克隆、载体构建及转化 [J], 赵金海;段楠;丁锐;宫禹;王雷;李瑶4.拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化 [J], 张芸;李会;车丽玲;黄思齐;邱承祥;杨志敏5.苹果生长素输入载体MdAUX1的基因克隆及在拟南芥和烟草中的遗传转化 [J], 安建平;王小非;刘鑫;李浩浩;由春香;郝玉金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甘蓝型油菜(Brassica napus)中与ATP6相互作用的蛋白质Bn359基因的克隆及植物表达载体的构建
20 09年3月 第46 卷第2期
四川大学学报( 自然科学版) Jo ur na l of Si e huan Uni ve r si t y( Na t ur a l Sc i e nce Edi t i on)
GAT CAT AGC CAC ACC TCT GAA GTC- 3’，
参照Bi oBRK RT- PCRKi t 操作说明书，用外侧引 物引导第一链cDNA的合 成．cDNA纯化后，用
TdT末端转移酶进行末端修饰．取加尾后的cDNA作为模板，以通用引物Ol i go d( T) 18： 5' - GCT
收稿日期 2007- 0 5- 31
基金项 目 作者简介 通讯作者
国家自然科学基金( 304 7109 5，3057 0986 )
余渝 ( 198l 一) ， 男．重 庆武隆 人．硬 士· 从事分 子生物 学研究 ．E- mai l ： yuyi n9 3125@163．c om
李旭 镶．E- ma i l I l i xf@$CU．edu．cn
470
四川大学学报( 自然科学Xt )
第46卷
1引 言
细胞质雄性不育( Cyt opl as mi c mal e s t er i li t y， 简称CMS) 是一种不能产生有活力花粉的遗传性 状，这种现象在高等植物中普遍存在[ ¨．通过研究 与细胞质雄性不育有关的基因，并利用基因工程的 方法创造雄性不育系，在杂交中的生产中具有重要 的意义．
拟南芥实验报告
一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。
在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。
RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。
本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。
五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。
拟南芥
拟南芥种植花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1：1/2）作为拟南芥种植土壤。
直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。
播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。
（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。
适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。
100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。
在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。
（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。
（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。
40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml 的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。
根据生长状况判断是否为转基因种子。
成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。
非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。
（9）转基因植株转土栽培。
转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。
转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。
根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。
拟南芥基因克隆及原核表达
拟南芥基因克隆及原核表达
要进行拟南芥 AtTCP4 基因的克隆和原核表达，可以按照以下步骤进行：
1. 获得目标基因序列：首先，需要获取拟南芥AtTCP4 基因的序列。
可以通过NCBI数据库或其他相关数据库搜索到目标基因的序列信息。
2. 购买引物：根据目标基因的序列设计引物，包括扩增该基因的起始引物和终止引物。
引物的设计应考虑适当的启动子和终止子，以便后续进行克隆和表达。
3. PCR扩增：使用目标基因的cDNA作为模板，使用合适的引物进行PCR扩增。
根据PCR反应条件，设置适当的温度和时间来实现特异性扩增。
扩增产物可以经过琼脂糖凝胶电泳检测，确认特定大小的DNA片段。
4. 克隆：将PCR扩增产物纯化，并将其连接到适当的质粒载体中。
质粒载体应包含合适的启动子、标签和抗生素抗性基因等元素。
使用大肠杆菌等宿主细胞进行转化，并培养在含有适当抗生素的培养基上，筛选出含有目标基因的克隆。
5. DNA测序：对选定的克隆进行DNA测序确认，以确保插入的基因片段没有错义突变或其他错误。
6. 准备原核表达系统：准备用于原核表达的适当宿主细胞（如大肠杆菌）并转化克隆。
选择合适的表达载体，并确保其包含适当的诱导子和选择标记。
7. 表达与纯化：培养转化后含有重组质粒的菌落，并在适当的条件下诱导表达目标基因。
收集细菌并通过细菌破碎、离心和层析等技术进行纯化。
以上步骤提供了一般的克隆和原核表达流程。
具体操作可能会因实验室和应用的不同而有所差异。
在进行实验之前，建议查阅相关的研究论文和方法手册，以获取更详细和具体的操作步骤和技术指导。
AtCS25基因过表达载体的构建和拟南芥的遗传转化
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ａｔ Ｓ ５ｉ ｎ ｔ ｎ ｕ ｋ ｏ ｅ ｅ ｉ ｒ ｂ ｄ ｐ ｉ ｔ ａ ｉ ｎ ｓ ｒ ｃ ： Ｃ ２ ｓａ ｆ ｃ ｉ ｎ ｎ ｗｎ ｇ ｎ ｎＡ ａ ｉ ｏ ｓｓ ｈ ｌ ａ．Ａｃ ｏ ｄ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ ｅ ｕ ｔ ｆｂｏ ｎｏ ｍａ ｉｓ ｕ ｏ ａ ｃ ｒ ｉ ｇ ｔ ｔ ｎ ｌ ｓｓｒ ｓ ｌ ｏ ｉｉ ｆｒ ｔ ， ｏｈ ｃ
越 多 的基 因 的功能 被 人 们 所 了解 ， 是 仍 然 有 大 量 但 的功能 未 知 的基 因等待 人们 去探 究 。随着 生物 信 息
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
学、 反向遗传学和现代分子生物学技术 的不断进步 ， 这些 功 能未 知基 因 的 定 位 ， 以及 对 于 它们 的表 达 与 调控 的研 究 ， 引起 了人们极 大 的兴 趣 。
ｔ ｓ ｇ ｎ ａ ｓ ｏ ｉｔ ｔ ｌｅ ｇ ｒ ｉａ ｉｎ ａ ｄ ｕｂ ｒ ｗｔ ． Ｉ ｒ ｒ ｔ ｃ ｖ ｒ ｔ ｅ ｆ ｎｃｉｎ ｏ ｈｓ ｇｅ ｅ， ｔｅ ｆ ｌ ｈｉ ｅ ｅ ｍ ｙ ａ ｓ ｃ ａｅ ｗｉｈ ｐｏｌｎ ｅ ｍ ｎ ｔｏ ｎ ｔ ｅ ｇ ｏ ｈ ｎ ｏ ｄｅ ｏ ｕｎ ｏ ｅ ｈ ｕ ｔｏ ｆｔ ｉ ｎ ｈ ｕｌ
ｌ ｎ ｔ ＤＳ ｏ Ｃ ２ ａ ｃ ｏ ｅ ｉｔ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｂ ｎ ｒ ｖ ｃｏ Ｂ １ １ ｎ ｓ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｎ ｏ ｅ ｇｈ Ｃ ｆＡＴ ５ ５ ｗ ｓ ｌｎ ｄ ｎ ｏ ｖ ｒｘ ｒ ｓ ｉｎ ｉ ａ ｙ ｅ ｔ ｒ ｐ Ｉ ２ ａ ｄ ｗａ ｔ ｓｏｍｅ ｉｔ ｗｉ — ｔｐ ａ ｌ ｄ ｙｅ
拟南芥基因组的组装与分析
拟南芥基因组的组装与分析拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为一种模式生物，在分子遗传和植物基因组学研究中发挥着重要作用。
由于其基因组组成相对简单和小，因此成为了植物基因组学研究的经典对象之一。
本文将探讨拟南芥基因组的组装与分析。
一、拟南芥的基因组特征拟南芥基因组大小约为125 Mb(百万碱基对)左右，由五条染色体组成，其中4条长染色体，1条短染色体。
整个基因组序列大约包含25000-30000个基因，其中90%以上是单拷贝基因。
拟南芥基因组大小相对较小，基因密度较高，这使得研究人员能够更方便高效地对其进行研究，并从其中获取相关信息。
二、拟南芥基因组的组装拟南芥基因组的组装是指通过在高通量测序平台上测序获得数百万条碱基对短序列，然后通过计算机算法将这些短序列拼接起来，最终得到完整的基因组序列。
由于拟南芥基因组序列较小，高通量测序和计算机算法的发展，我们已经获得了多个拟南芥基因组序列，并且这些序列的质量已经非常高。
拟南芥基因组序列的不断完善，为研究人员提供了更多更好的资源。
三、拟南芥基因组的分析拟南芥基因组的组装完善后，研究人员对其进行了多方面的分析。
通过对拟南芥基因组序列进行注释，我们发现拟南芥基因组中有大约27000个基因，其中90%以上为单拷贝基因，多数基因都参与调控生长发育、转录和代谢等基本功能。
此外，一个关键的发现是拟南芥基因组中存在着大量的基因家族，这些基因家族在植物的进化中发挥了非常重要的作用，多数基因家族充当植物的响应器官和环境适应的调控器。
通过对该基因组的研究，研究人员不仅揭示了拟南芥基因组的基本特征，还对其进行了各类功能分析，比如发掘功能性基因、分析基因调控网络、深入了解细胞信号传导、逆境胁迫应答任务等等。
此外，在RNA测序、蛋白质组分析等方面的应用也得到了广泛的应用。
四、拟南芥基因组的意义拟南芥基因组是植物基因组研究的典型对象，其解析程度已经达到前人难以想象的高度。
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化是利用其遗传特性实现不同的目的的一项技术。
通常来说，拟南芥的花浸渍转化方案分成三个步骤：1）花粉培养 2）植物体系建立 3）转基因表达系统构建。
首先，在进行拟南芥花浸渍转化方案时，花粉培养是必不可少的一个步骤。
在该步骤中，
一般利用磷酸三钠、核酸抗凝剂、复合氮肥和碳源构建适宜的花粉培养基，利用此基础培养拟
南芥花粉以便获得正常受精细胞。
其次，完成花粉培养和受精细胞形成后，将进行植物体系的建立。
在此步骤中，需要构筑
一个适宜的植物大培养体系，一般以磷酸铵、硝酸钾、硫酸钙和无机氮构建营养基，并加入2％的半乳糖等激素以利于受精细胞的胚胎发育，建立起适宜的植物体系。
最后，构建转基因表达系统，这是拟南芥花浸渍转化中最重要也是最复杂的一步。
常用的
基因载体可以分为普通的DNA质粒和Agrobacterium质粒载体，其中保护基因所需的抗生素
标记也不相同，它们分别是：对于普通的DNA质粒，采用Kanamycin标记；而对于Agrobacterium质粒载体，采用Bastinomycin标记。
在此步骤中，我们还需要将培养好的转
基因拟南芥细胞接种到拟南芥的植株上，以便获得转基因拟南芥以及转基因表达分析。
总之，拟南芥的花浸渍转化方案具有较强的通用性，可以用于实现拟南芥的转基因技术。
此外，拟南芥的花浸渍转化方案分为三个步骤：花粉培养，植物体系建立和转基因表达系统的
构建。
与传统的转基因技术相比，拟南芥的花浸渍转化方案具有更快的获得转基因拟南芥的速度，同时也具有更高的成功率，可以为科研活动提供更高的效率和更好的效果。
神奇的拟南芥
神奇的拟南芥拟南芥与油菜、萝卜、卷心菜等同为十字花科植物，向下细分为鼠耳芥属。
拟南芥又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，拉丁文名为Arabidopsis thaliala (L.) Heynh。
拟南芥作为一种草本植物广泛分布于欧亚大陆和非洲西北部。
在我国的内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有生长。
我国古人常将身边的一些卑微、低贱之物“视若草芥”，拟南芥早先也就是一种无声无息、名不见经传的小草。
拟南芥既不好吃、也不好看，对人类毫无经济价值。
但近一百年来，随着生物学和经典遗传学的蓬勃发展，科学家们逐渐注意到它的研究价值。
长期以来，科学家一直希望在植物中找到像动物中的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）那样繁殖快、易于在实验室培养、适于遗传操作的实验材料，进而从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。
拟南芥植株较小（一个8cm见方的培养钵可种植4-10株）、生长周期短（从发芽到开花约4-6周）、结实多（每株植物可产生数千粒种子）。
拟南芥的形态特征分明（图1），莲座叶着生在植株基部，呈倒卵形或匙形；茎生叶无柄，呈批针形或线形。
侧枝着生在叶腋基部，主茎及侧枝顶部生有总状花序，四片白色匙形花瓣，四强雄蕊。
长角果线形，长约1-1.5cm，每个果荚可着生50-60粒种子。
这些特点使得拟南芥的突变表型易于观察，为突变体筛选提供了便利。
拟南芥是典型的自交繁殖植物，易于保持遗传稳定性。
同时，可以方便的进行人工杂交，利于遗传研究。
拟南芥的另一个优点是易于转化。
经过不断的实践，浸花法（floral tip）已成为拟南芥转化最常用的方法。
对生长5-6周已抽苔的拟南芥打顶来促进侧枝生长（图2A），待花序大量产生时将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡几分钟（图2B），3-4周后对转化植株收种子（图2C）。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株（图2D）。
拟南芥中离子转运蛋白载体构建及烟草转化
低成本、 高效率 、 非侵入 、 符合审美观的技术 ， 可部分解决这一 问题并且备受人们的关 注 Ｉ． 目前许 ４但 Ｊ 多用于修复的超量积累植物存在生长缓慢、 植株矮小、 地上部生物量小等不足难 以大规模应用． 目前 ， 利
用转基因手段将重金属富集相关基 因转入高生物量植物以改变其对重金属吸收、 转运 、 积累和忍耐的机 制， 从而提高植物对重金属的富集能力． 植物吸收重金属离子和解毒的分子机制包括螯合作用 ＿ 及跨 ５ 圳 膜转运蛋 白的作用ｍ ． 迄今为止 ， 拟南芥 中部分重金属离子 的转运蛋 白已被克隆． 馏ｎ 基因编码 了一个 Ｆ¨转运蛋 白， ｅ 在酵母中表达能提高其对 Ｆｎ的摄取作用 ， 基因是包括一个金属结合域的完整 的膜蛋 白， ｅ 该 并且在铁 缺乏诱导下 ， 在根中特异表达¨ Ｚ Ｔ 基因则是根据动物中同源的 Ｚ Ｔ基酸组成 ， 包括了 ６ 个跨膜结构域． 在高浓度的 ｚ 培养基 中， ｎ 过量表达该基因的拟
ｎ Ｆ：ＣＴ ＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＡＡＡ ＴＩＲ ：ＣＧＧＴＡＡＴＡＴＧＴ ＣＡｒ ＡＡＡＡＴＡＣ Ｉ ＴＹ
Ｚ １Ｆ：Ａ ＧＧ Ａ７ ＇ Ｔ ＡＧＴ Ｔｒ ＡＡＧ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ ＣＣ
ｎ Ｒ：ＧＡ ＧＡＡ ＧＣ Ｇ Ａ ＡＡＡＡＡ Ｔ Ｔ ＡＴ Ｃ ＣＣ
用拟南芥根部组织抽取总 Ｒ Ａ， Ｍ Ｎ Ａ Ｖ反转录合成 ｃ Ｎ 以此为模板 ， Ｄ Ａ， 用天为时代公 司的 Ｔｇ ａ 酶扩 增 ｎ 及 ｎ Ｄ Ａ序列 ，Ｃ ｃＮ Ｐ Ｒ反应条件为 ９ ￣预变性 ５ ｉ， ４ 变性 ３ｓ ； ￣ 退火 ４ ｓ ；２ ４Ｃ ｍｎ ９ ￣ Ｃ ０ｅ ５ Ｃ ｃ ２ ０ｅ ７ ￣ ｃ Ｃ 延伸 ７ ｓ ，０个循 环 ；２Ｃ延伸 １ｍｎ ４Ｃ保 存． Ｃ ０ｅ ４ ｅ ７￣ ０ ｉ，￣ Ｐ Ｒ产物 直接 与 ｐ Ｄ ８一Ｔ载体相 连 ， Ａ Ｍ １ ｚｎｃ （ ｎ ） Ｔ的反向阳性质粒用 Ｓｌ Ｓ ａ 酶切 ， Ｘ ｏ（ Ｓｌ是同尾酶） Ｓ ａ 对 中间载体 ｐ Ｔ ２ ｃ一 ａ ，ｍ Ｉ Ｉ 用 ｈＩ与 ａ Ｉ ，ｍ Ｉ Ｒ Ｌ２ 进行酶切 ， 用博大泰克回收试剂盒 回收后连接， 将 ｎ Ｄ Ａ片段装入其 ３ Ｓ ｃＮ ５ 启动子后 ， 转化大肠杆菌