一些固定液及方法介绍
组织学技术固定（1）
组织学技术固定（1）固定：利用化学试剂将组织内的成分凝固，防止组织和细胞的死后变化，保持其与生活时状态相仿。
使组织成分凝固的化学试剂称固定剂。
可以是固体的（如重铬酸钾、苦味酸、升汞，配成水溶液），也可以是液体的（如甲醛、酒精、三氯醋酸、冰醋酸等）固定剂：液体：甲醛、酒精、三氯醋酸、醋酸（冰醋酸）固体：重铬酸钾、升汞、三氧化铬、多聚甲醛、苦味酸、锇酸1 常用固定剂的特性与用途（1）甲醛甲醛易溶于水，在水中的溶解度为36~40%（商品名福尔马林）。
酸性，有强烈刺激味。
甲醛久存产生乳白色沉淀为三聚甲醛。
甲醛与空气接触将近被氧化成甲酸而增加酸性。
常用10%甲醛：甲醛10毫升，加水90毫升。
甲醛渗透力强，固定均匀。
组织膨胀5%左右，酒精脱水时收缩较大。
能保存脂肪和类脂，不能沉淀核蛋白和白蛋白。
甲醛为还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等混合，24小时失效。
长期固定于甲醛的组织，会产生暗褐色结晶样沉淀称福尔马林色素。
它多沉着于充血、出血及血液溶解的组织如肝、脾。
该色素不溶于水、酒精、二甲苯、甘油、丙酮、脂溶剂和稀酸，且影响染色效果。
可用下法除去。
氨过氧化氢浸泡法：将未染色的切片浸泡于3%过氧化氢水溶液25毫升加浓氨水1滴1~2小时，充分水洗后染色氨酒精浸泡法：将切片浸泡于25%氨水1毫升加75%酒精200毫升30分钟，水洗后染色碱酒精浸泡法：将切片浸泡于1%氢氧化钠或氢氧化钾1毫升和75%酒精 100毫升10分钟，水洗后染色2 酒精（乙醇）无色透明液体。
可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。
能溶解脂肪和类脂。
能沉淀糖，但遇水能溶解。
还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等混合使用。
常用95%酒精配成各种浓度的酒精。
电镜观察固定方法
电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。
若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min 50%10min 70%10min 到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min 90%15min 95%15min 100%30min 100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min 环氧丙烷20min 包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。
（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）。
小鼠眼球标本固定液及制片方法的改进
没 有 明显变化 ，没 有皱 缩和 凹陷变形 ，基本上 能保 持原 有 的状态 和外形 ，色泽亮 白透 明 ；显微镜镜 下 可观 察 到 眼球 各 层 组 织 结 构完 整 ，无 明 显 结 构 改 变 ，未见 视网膜 的脱 落 和分 离 ，眼球 各层 组织结 构 清晰无裂隙。切片厚薄均匀 ，没有脱片现象 。组织 细胞 间无 龟裂 变形 ，无细 胞过 度收缩 和膨胀 ，未见 组织 的 自溶 ；细 胞 核 仁 、核膜 清 晰 ，染 色质 均 匀 ， 色泽 亮丽 ，颜 色对 比明显 。
讨 论 Βιβλιοθήκη 的不 同容 易造成 组织分 离 ，特 别是 造成 视 网膜 的分 离甚至脱落［ １ ］ 。其他的一些 固定液虽然可以保证眼
球内部各层组织完整，但是细胞肿胀肥大 ，细胞着 色不均匀 ，给在显微镜下观察带来困难。因此我们 结合眼球 的结构特点 ，总结出一种比较适合固定眼
球 组织 的 固定 液 以及采 用适 当的取 材方式 ，有 助 于
Ｖｏ ｌ ＿ １ ６ ． Ｎｏ ． １ Ｆ ｅ ｂ ． ２ ０ ０ ７
小 鼠 眼球 标 本 固定 液 及 制 片 方 法 的改进
罗灿 峤 梁 英杰 吴 惠群 钟觉民 梁 惠珍
（ 中山大学 附属第一 医院病理科 ，广州 ５ １ ０ ０ ８ ０ ） ［ 关键词］ 跟球 固定 ； 固定液 ； 染 色 ［ 文献标识码］ Ａ
［ 中图分类号］ Ｒ３ ２ ２ ． ９ １
在小 鼠眼球标 本石蜡 切片 制作过 程 中 ，由于眼 球组 织结 构 的特殊 ，各部 分组织 的软 硬度不 同 ，各
层 组织 之 间连接性 差 ，如 用 常规 １ Ｏ 甲醛 液 固定 ， 眼球 经过 固定 后用 乙醇脱水 ，各层 组织 由于收缩率
4%多聚甲醛固定液的配制方法
4%多聚甲醛固定液的配制方法4％多聚甲醛溶液配制方法--------------------------------------4％多聚甲醛溶液用途：进行免疫组织化学方法研究时常选用该固定液。
动物灌注固定及后固定（动物器官经该液灌注后，然后取材，再用该液浸泡2-24小时）也常选该固定液固定。
4％多聚甲醛溶液配制方法：1) 900 ml dd H20 + 500 ul 1N NaOH2) Heat to 65-70℃3) While stirring, add 40 g paraformaldehyde4) Continue heating and stirring until paraformaldehyde is dissolved5) Let cool to room temperature6) Add 100 ml of 10X PBS7) pH to 7.3 with HCl8) Sterile with filter9) Store at 4℃, protected from light称量2g，放置与50ml pbs中，37度孵箱2天后，4%的多聚甲醛就配好了。
配制0.1M的PBS，PH=7.2-7.4,100mlPBS+4g多聚甲醛，放入65℃水浴，一般半天左右就可以溶好。
因为需要现用现配所以一般就配10毫升。
用一个带盖的玻璃离心管加0.4克多聚甲醛，加8毫升PBS，加1毫升2N的NAOH，放到60度的水浴里，10分钟，拿出来用手颠倒几次，基本上就都溶了，再用HCL调ph到7.2，最后定容就行了，我最快10分钟搞定。
取4g多聚甲醛溶到100PBS缓冲液，加2滴1N的NaOH（pH7.4）,60度水浴磁力搅拌，大约1-2小时可以溶解。
在放置磁力搅拌棒的容器中,将4克多聚甲醛(EM级)溶解于100ml PBS,加入数滴NaOH,在通风橱中60℃加热(打开瓶盖)使溶解,冷却至室温,调整PH值为7.4,使用前新鲜配制.常用的固定剂种类很多,固定剂的正确选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性.固定剂可分为两类:有机溶剂和交联剂.有机溶剂如乙醇和丙酮能够去处脂类物质使细胞脱水,把蛋白质沉淀在细胞结构上.交联剂如多聚甲醛一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来,形成一个相互交联的抗原网.许多人发现用交联剂固定细胞效果较好,尤其是做免疫荧光的时候,当然没有固定的规则可言.不过,单独用多聚甲醛固定的细胞不能使抗体进入细胞内,因此,标本固定后必须用非离子去污剂(triton-x 100)透化标本.4％多聚甲醛溶液（PFA）配制称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60－65℃,使成乳白色悬液。
石蜡制片方法
202修与固着 1.选取所要切片的材料，用单面刀片从包埋的 石蜡块上切割下来，注意不可损伤所包埋的组 织。 2.确定切面的方位，用刀片将石蜡的四面作初 步的整修。 3.取一块台木，用镊子夹取少量的碎蜡放于台 木上，后点燃酒精灯，烧热镊子将台木上的石 蜡熔化，迅速将蜡块粘在台木上。 4.再用镊子夹取少许碎蜡放在蜡块四周，后在 酒精灯上将镊子烧热，迅速将蜡块四周的碎蜡 熔化烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。
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▪包埋中出现的问题及其解决办法 ➢问题 包埋后的石蜡块应为均匀的半透明状态， 但有时出现白色混浊的结晶部分，这样在切片时 就有妨碍。 ➢原因 1.脱水不干净。2.组织内部或石蜡中混 有透明剂。3.石蜡本身品质不良。4.纸盒中周围 的石蜡先成凝固状态，中部的石蜡凝固较晚。5. 石蜡冷凝得太慢。 ➢解决办法
3.二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染 色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否 则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白。
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4.二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿 度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周 缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在 封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水 气侵入，出现白色云雾状。
长度达到20—30cm时，可用毛笔挑起放于白 纸上备用。
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切片
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➢切片过程中常见现象分析 1、蜡片卷曲，主要由于：
a．切片刀不锋利 b．切片刀的角度不正确 c．切片太薄或太厚 d．石蜡太软或太硬(与温度有关) e．蜡块中的材料不在中央 2、材料与蜡片分离 石蜡温度与材料温度不一致。 3、蜡片上有条纹，是因为切片刀上有缺刻。 4、蜡带不成直线，是因为蜡块上下不平整。 5、蜡片破碎不成蜡带而吸附于切片刀上，由于材 料过脆与切口摩擦产生静电的原因。
气液色谱固定相介绍
第二节气液色谱固定相气液色谱固定相是固定液均匀地涂在载体上，载体是化学惰性的固体微粒，用来支持固定液的，气液色谱固定相中的固定液大多数是高沸点的有机化合物，在气相色谱工作条件下呈液态，所以叫固定液。
在气—液色谱柱内，被测物质中各组分的分离是基于各组分在固定液中溶解度的不同。
当载气携带被测物质进入色谱柱，和固定液接触时，气相中的被测组分就溶解到固定液中去。
载气连续进入色谱柱，溶解在固定液中的被测组分会从固定液中挥发到气相中去。
随着载气的流动，挥发到气相中的被测组分分子又会溶解到固定液中。
这样反复多次溶解、挥发、再溶解、再挥发。
由于各组分在固定液中溶解能力不同。
溶解度大的组分就较难挥发，停留在柱中的时间长些，往前移动得就慢些。
而溶解度小的组分，往前移动得快些，停留在柱中的时间就短些。
经过一定时间后，各组分就彼此分离。
固定液配比一般是3-25%，配比指固定液在固定相中所占重量，色谱柱起分离决定作用的是固定液。
载体作用是提供一个大的惰性表面，以便涂上固定液。
一、气液色谱载体载体是一种化学惰性、多孔性的颗粒，它的作用是提供一个大的惰性表面，用以承担固定液，使固定液以薄膜状态分布在其表面上。
（一）对载体的要求1．载体表面应是化学惰性的，即表面没有吸附性或和吸附性很弱，更不能与被测物质起化学反应。
2．足够大的表面积。
多孔性，即表面积较大，使固定液与试样的接触面较大。
3．热稳定性好，有一定的机械强度，不易破碎。
4．形状规则、大小均匀。
对担体粒度的要求，一般希望均匀、细小，这样有利于提高柱效。
（二）载体的分类气—液色谱中所用担体可分为硅藻土型和非硅藻土型两大类。
1．硅藻土类载体：由天然硅藻土煅烧而成的。
常用此类担体，主要成分无机盐。
根据制造工艺和助剂不同，又可分为红色担体和白色担体两种。
（１）红色载体：孔径较小，表面孔穴密集，比表面积较大(4 m2/g)，机械强度好。
适宜分离非极性或弱极性化合物。
缺点是表面存有活性吸附中心点。
悬浮细胞固定方法
悬浮细胞固定方法
悬浮细胞固定方法：
① 准备固定液，选择适合细胞类型的固定液，如甲醛或乙醇溶液；
② 收集细胞，通过离心收集悬浮细胞，去除培养基；
③ 洗涤细胞，用PBS或生理盐水轻轻洗涤细胞，去除残留培养基；
④ 重悬细胞，将洗涤后的细胞重悬于少量PBS中，形成较高浓度的细胞悬液；
⑤ 添加固定液，缓慢加入预冷的固定液至细胞悬液中，轻轻混匀；
⑥ 固定时间，根据细胞类型和实验需求，设定适当的固定时间，通常为10-30分钟；
⑦ 再次离心，固定完成后，再次离心去除固定液；
⑧ 洗涤固定细胞，用PBS洗涤固定后的细胞，去除多余的固定剂；
⑨ 二次固定，如果需要，可进行二次固定以增强固定效果；
⑩ 再次洗涤，重复洗涤步骤，确保固定剂完全去除；
⑪ 调整浓度，将固定后的细胞重悬于适量PBS中，调整至实验所需的细胞浓度；
⑫ 存储备用，将调整好的细胞悬液分装保存，根据需要冷藏或冷冻备用。
组织固定
5、苦味酸（Ｐicric acid） 苦味酸是一种黄色结晶，是一种相当强的 酸。它在水中的溶解度随室温而变化，约在 0.9—1.2%，在空气中能自燃，在密闭器中能 剧裂爆炸。为使用安全起见，常制成饱和水 溶液贮藏保存。
特性: 1）能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作 用。 2）穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组 织硬化。 3）有软化皮肤的作用，配制的Bouin氏液对 头皮及全身皮肤制片效果甚好。
4）固定温度：25℃， 酶组织化学染色应置于冰箱低温固定 5）做不同的染色应尽量选择合适的固定剂
6 、固定容器 容积较大，防止组织与容器粘连 底部垫有棉絮，使固定剂能均匀渗透组织块 固定期间应轻轻搅拌容器（自动脱水机）
7、常用的固定方法 1）蒸汽固定法 2）注射、灌注固定法 3）浸入和滴加法 4）微波固定法
（3）醋酸能使组织膨胀，因此，可抵偿因乙 醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和 硬化，故常配成混合固定液。 （4）醋酸穿透速度最快，米粒大的组织在单 纯醋酸固定液中1—2h即可。5％醋酸的pＨ值 在2.8，此时可停止细菌和酶的活动，可防止 组织自溶变性。
4、氯化汞（Ｍercury bichloride） 氯化汞俗称升汞。为白色粉末或针状结晶， 有剧毒，必须严格保管及注意使用。通常用 其饱和水溶液，在室温的水中饱和度为5%— 7%。
6、甲醛——生理盐水 配制 甲醛10ml+生理盐水90ml PH值为7，此固定液是应用最广的一种， 它可以保护脂类和细胞核。在作酸性染色时， 如Ｖ-Ｇ，或三重染色之前，还可以再使用第 2次固定。
7 、中性缓冲甲醛液 为免疫组化和原位杂交最常用的固定液，对 组织穿透性好，收缩小，对大多数抗原物质 保存较好。 配方：40%甲醛 10ml＋0.01mol/L PBS （PH7.4） 90ml
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一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4•2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin's液及改良Bouin's液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin's液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamboni's(Stefanini's)液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸150mlKarasson-Schwlt's PB至1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt's PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt's磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/L Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300 mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky's液（pH7.3）试剂：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB至1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）试剂：对苯醌 4.0g0．01mol/L PBS 1000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。
此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS500mlTris约14g浓HCl少许ECD10g25%戊二醛 3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD 单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解，应在用前几天配制。
（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。
此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
（2）1% OsO4-PB：试剂：A、2.26%NaH2PO4•2H2O 4.15mlB、2.52% NaOH 8.5mlC、5.4%葡萄糖5mlD、OsO40.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。
但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。
总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。
目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4 ℃的Karnovsky's液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni's液等混合固定液。