土壤微生物量测定方法
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
)（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
土壤微生物量碳测定方法(精编文档).doc
【最新整理，下载后即可编辑】土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass ）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。
近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。
由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。
测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI ）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE ）。
熏蒸提取法（FE 法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。
Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol ·L -1K 2SO 4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。
Vance 等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol ·L -1K 2SO 4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。
Wu 等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。
该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。
林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。
对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的研究。
测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C 底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP 法及底物诱导呼吸法比较）。
土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物的别离鉴定及数量测定（一）培养基的制备Ⅰ测定微生物总量培养基：1. 细菌培养基〔牛肉膏蛋白胨琼脂培养基〕牛肉膏Beefextract5.0g蛋白胨Peptone10.0gNaCI5.0g蒸馏水H201000m1琼脂15～20gPH7.2~7.4制备步骤：⑴ 在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.⑵ 向小铝锅中参加500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.参加5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌.⑶ 参加洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL.⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精细pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。
一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。
⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶。
注意分装时防止培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。
如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。
，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞局部包好. 标签说明培养基的名称、配制日期等。
⑹ 高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa〔15lb/in2〕121℃灭菌〔15-20〕30min.2.放线菌培养基〔改进高氏1号琼脂培养基〕可溶性淀粉20gKNO3 1gK2HPO40.5gMgSO4• 7H2O 0.5gNaCl 0.5g原0.05gFeSO4• 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4制备步骤：. .jz.（1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。
（2）称量准确称量各种成分。
（3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH〔可不调〕。
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
土壤微生物生物量的濃定方法1 土壤撤生物碳的需定方法（H蒸提取一一仪器分林法）1.1基本原理新節土样经氯仿熏蒸后（24h）, 土壤撤生物死亡细胞发生裂解，释赦岀攒生物生物量碳，用一定体枳的0.5mol/LK2S04溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定攒生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸士壤测定有机碳的差值员转换系数（屉），从而廿算士壤做生物生物量碳。
1.2实验妆器自动总有机碳（TOC ）分tfi 仪（Shimadzu Model TOC—500,JAN PAN ）、真空干煤器、烧杯、三角眦、聚乙烯熟料管、离心管、滤红、漏斗等。
1.3实验试剂1 ）无乙諄氯仿（CHCLs）;2 ）0.5mol/L麻酸钾溶液:称取87g K2S04濬于1L蒸耀水中3 ）工作曲线的配制:用0.5mol/L硝酸钾落裁配制10ugC/L、30ugC/L. 50ugC/L.70ugC/L. 100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节m）1.4.2熏蒸称収新卸（相肖于干土10.0°,这个可以根摇自己土样的悄猊而定）3价分别朋人25ml小烧杯中。
将烧杯朋人真空干煤器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3） m15ml 杯2或3只，烧杯故入少量lifi暴彿玻同时笊人一盛有N aOH S 液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的co2,干煤器婕部加人少量水以保持容器湿度。
盖上真空干煤器盖子，用真空泵抽真空，使氮仿沸嘴5分抑。
关冈真空干煤器W0,于25T黑喑条件下培养24小时。
1.4.2抽真空处理熏蒸结東后，打开真空干燥器Iffl门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做）,取岀盛有氯仿（可重复利用）和榆NaOH溶液的小烧杯，清常干煤器，反夏抽真空（5或6次，每«3min,毎次抽真空后最好完全扌T开干煤器盖子）, 直到土攘无氯仿味道为止。
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定
土壤微生物量氮的测定方法1.试剂配制：(1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、五水硫酸铜10g、硒粉1g。
均匀混合后研细,贮于瓶中。
(2)密度为1.84浓硫酸。
(3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解定容至1L。
(4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。
（按体积比100:2加入混合指示剂）(5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。
(6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定之。
(7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1L。
(8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。
再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。
将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。
2.试验步骤：。
（1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。
取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。
干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。
按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。
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方法:（1）土壤培养称取风干土（高砂土）9克于培养皿，加入1克煤灰（80目），混合均匀。
加入1ml新鲜土壤的浸提液作为接种菌液，再加入蒸馏水10ml，在28度恒温条件下7天。
(2)氯仿熏蒸将25ml无乙醇氯仿和培养的样品放入抽气皿，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5min，关紧活塞，关闭抽气机。
置于黑暗中24小时后取出氯仿，反复抽真空3～5次（每次5min）,排除氯仿。
同时做不熏蒸的处理（但同时进行暗培养）。
（3）浸提将上述经过氯仿熏蒸与未经过氯仿熏蒸的样品转移【注】到塑料瓶中，加入0.5mol/L K2SO4 Xml,在25度、200rpm 的水平恒温振荡机上振荡30min离心过滤，上TOC仪测定。
【注】为确定样液比，转移前称整个培养皿重(W1)，转移后再称重(W2)，二者之差再减去原来加入的样重（W3），即为转移时样品中的水分重量。
样液比＝W3/（W1-W2-W3+VK2SO4）样重W3＝煤灰重＋土重
W1(g)W2(g)水分重量（g)VK2SO4(ml)W3(g) 样液比TOC结果（ppm)
全＋熏蒸41.531.05 5.454050.1100128.2
厌＋熏蒸54.0139.15 4.8640100.2229129.6
好＋熏蒸45.1134.940.1735100.284332.9全47.7242.470.253550.14188.366
厌52.2736.09 6.1835100.242820.56
好42.3532.36-0.0135100.285831.34
样品有机C含量(ppm)Ec(ppm)微生物碳Bc(ppm)全＋熏蒸1165.31106.42456.1
厌＋熏蒸581.4496.71102.7
好＋熏蒸115.7 6.113.4
全59.0
厌84.7
好109.7。