化学酶工程

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3．活性酯法

（1）原理：根据多肽合成原理发展起来
（2）特点：反应条件温和，避免了活泼的
双功能交联剂直接与酶接触所可能产生的
酶失活，减少了副反应的产生。

（3）工艺步骤：
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a 白蛋白琥珀酰化
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b 活性酯形成反应
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c 修饰反应
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二．金属离子置换修饰

1． 概念
通过改变酶分子中所含的金属离子， 使酶的特性和功能发生改变的方法称为金 属离子置换修饰。


部分可消除。 PEG（聚二乙醇）、人血清白蛋白在消除酶抗 原性上效果明显。
原因： 1. 组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价 键，破坏了抗原决定簇的结构。 2.大分子修饰剂遮盖抗原决定决定簇和阻碍抗 原、抗体产生结合反应。
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三．体内半衰期

体内半衰期延长
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四．最适pH

有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化
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抗体酶的发现

Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组首次 观察到了抗体具有选择性的催化活性。 1986年美国Lerner和Schultz两个实验室同时在 Science上发表论文，报道他们成功地得到了具 有催化活性的抗体。 并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化抗 体，即抗体酶。


糖及糖的衍生物 高分子化合物 具有生物活性的大分子物质
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3. 蛋白质类及其它

一．蛋白质类修饰 二．金属离子置换修饰
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一．蛋白质类修饰

什么蛋白质具有优越性？ 血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多！
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常用方法

1．戊二醛法：戊二醛双功能基团 2．碳二亚胺法：碳二亚胺作为交联剂 3．活性酯法：☆



一．热稳定性 二．抗原性 三．体内半衰期 四．最适pH 五．酶学性质的改变 六．对组织的分布能力变化
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一．热稳定性

例：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结
合，可使该酶的活力提高到原有酶活力的2.25倍。

原因： 1．修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象， 增强了酶的结构刚性。 2．减少了酶分子内部基团的热振动。
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热稳定性举例：
例：



过氧化氢酶：右旋糖酐：50℃/10min，40%90% 溶菌酶：右旋糖酐：100℃/30min，20%-90% 糜蛋白酶：右旋糖酐：37℃/6h，0%-70% 糜蛋白酶：肝素：37℃/6h，0%-80% 尿酸酶：人血清白蛋白： 37℃/48h，50%95%
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二．抗原性
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4．芳香环取代反应
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二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
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1．巯基的化学修饰

常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺
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2．氨基的化学修饰
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3．羧基的化学修饰
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4．咪唑基的化学修饰
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5．胍（gua）基的化学修饰
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三. 研究热点-核酸类酶的修饰

RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能 团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的 氨基和羟基。

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1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作 为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。 诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。
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抗体酶

抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalytic antibody) 一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了 酶的属性。 它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究 的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力 巧妙结合的产物。
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抗体酶的特性

2、有更强的专一性和稳定性

抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合 成的分子 抗体酶催化反应的介质效应


酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中 具稳定性。
脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应 速率增加。 酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中， 活性较高。
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抗体酶的制备
例如： 猪肝尿酸酶的最适pH为10.5，在pH7.4生理环 境时5%-10%，但用白蛋白修饰后， 可保留 60% 吲哚-3-链烷羟化酶修饰后，最适pH从3.5变到 5.5，在pH为7时，修饰酶活比天然酶增加3倍。
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五．酶学性质的改变

绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但 有些酶在修饰后，米氏常数会增大。
第五章 化学酶工程

第一节 酶分子的化学修饰


第二节 抗体酶
第三节 印迹酶
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第一节 酶分子的化学修饰
（一）概

述
一． 酶的化学修饰原因

1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。（热、蛋白） 2． 作用的最适条件不符。（半衰期延长，最适PH扩大）
3． 酶的主要动力学性质的不适应。（Km增大，结合差） 4． 临床应用的特殊要求。 (异源蛋白-抗原-抗体-降低酶类药物抗原性）
条件下抗变性能提高，耐热性也有所加强。
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三． 蛋白质化学修饰的局限性

化学修饰专一性相对
酶的构象有些变化
只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行
研究酶结构与功能缺乏准确性和系统性
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第二节 抗体酶

抗体酶概念
抗体酶产生的理论基础
抗体酶的制备方法 抗体酶的应用
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抗 体

由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补 并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。
测定酶的氨基酸序列和研究变构酶时，也
是以化学修饰为基础。


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二． 化学修饰酶在医药和生物技术中的应用

例：精氨酸酶具有抗癌作用，它用PEG 修饰后，修饰率
为53%时，酶活力保持65%。与抗体结合能力和诱导产 生新抗体的能力均消失，在血液中停留时间延长，显著 地延长了移植肝癌后的小鼠生命。

例：辣根过氧化物酶用MPEG共价修饰后，在极端pH
抗体的最显著的特征是： 多样性和专一性

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酶是生物催化剂

酶是一类具有催化功能的生物分子 酶反应有两个主要的特征： 高催化效率、高选择性 1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的 实质 酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结 合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从 而降低反应能级。


凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共 价结构发生改变，称为蛋白的化学修饰。
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（二） 酶化学修饰的方法及修饰剂

一． 修饰剂的要求
二． 酶性质的了解
三． 反应条件的选择
四． 酶修饰方法
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一． 修饰剂的要求


1． 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋 白质的吸附性。 2． 修饰剂上反应基团的数目及位置。 3． 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。

1． 酶分子侧链基团的化学修饰 2． 有机大分子对酶的化学修饰 3． 蛋白质类及其他。
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1. 酶分子侧链基团的化学修饰

一．几种重要的修饰反应
二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 三. 研究新热点
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一．几种重要的修饰反应

1．酰化及其相关反应
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2．烷基化反应
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3．氧化和还原反应
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过渡态理论

过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。

对任何化学反应，反应物 在变为产物之前，必须获 得一定的能量，成为活化 态或称过渡态。过渡态处 于最高能阶上。 过渡态与反应物的能阶之 差称为活化能。 获得活化能的多少与反应 的速度成正比。 54


过渡态理论

过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了 一个易于形成产物的过渡态，实际上是降 低了反应所需的活化能。
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六．对组织的分布能力变化

对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶 器官选择性地吸收。
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六．对组织的分布能力变化举例

a-葡萄糖苷酶在体内希望尽量避免受到吞噬细胞 的破坏，利用白蛋白修饰后肝溶酶体摄入量达 35%，吞噬细胞3%

辣根过氧化物酶用聚赖氨酸修饰后，穿透细胞的 能力增强从0.2%-15.9% 天然溶菌酶几乎不被肝细胞吸收，用唾液酸糖肽 修饰溶菌酶后每分钟肝摄入量3.2%-34%。
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二． 酶性质的了解


1． 酶活性部位情况 2． 酶的稳定条件、酶反应最适条件 3． 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼 性等。
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三． 反应条件的选择

1． 反应体系中酶与修饰剂的分子比例。 2． 反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。 3． 反应温度及时间。
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四． 酶修饰方法
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过渡态理论与抗体酶

如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过 渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥 催化作用。

实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计的过 渡态类似物。
用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非 该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。

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抗体酶的特性

一种对酶促反应过渡态特异的抗体 结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用， 又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。