3种贝类原虫多重荧光定量PCR方法的建立

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三重荧光定量PCR检测水产动物源细菌磺胺类耐药基因

三重荧光定量PCR检测水产动物源细菌磺胺类耐药基因黄国秋;童桂香;韦信贤;陈静;吴明媛;黎小正【摘要】Triple TaqMan real–time PCR method was developed to simultaneously detect sulfonamides–resistance genes Sul1,Sul2 andSul3, the three pathogenic bacteria in aquatic animals in the study. Three pairs of specific primers and fluorogenic–labeled probes were designed and synthesized in accordance with the above target genes using software PrimerExpress3.0. The reaction system and procedure were optimized, as well as the detection sensitivity, specificity, repeatability and clinical application of the method. Results showed that the method had a wide quantitative range from 1×101 to 1×108 copies per reaction, which presented a good linear relationship in its standard curve. The triple real–time PCR method had a high specificity in detecting mixed DNAofSul1,Sul2 andSul3, but not those DNA from other bacteria and viruses; it also had a high sensitivity to the detection limit low to 10 copies per reaction for the purified recombinant plasmids ofSul1,Sul2 andSul3. The variation coefficients of the established method were less than 2%. Sulfonamides–resistance genes of 72 clinical isolates were analyzed using triple real–time PCR method and they were compared to drug sensitive test, the coincidence rate could reach to 94.2%. The entire detection could be completed within 2 h. In conclusion, the tripleTaqMan real–time PCR method developed in the present study could be applied to the rapid detection and molecular epidemiology survey in sulfonamides–resistancegenesSul1,Sul2 andSul3 of clinical pathogenic strains isolated from aquatic animals.%根据GenBank中细菌磺胺类耐药基因Sul1、Sul2和Sul3的保守序列设计3对特异性引物及相应TaqMan探针，以重组质粒标准品为模板对反应条件进行优化，建立一种可同时检测上述3种耐药基因的三重荧光定量PCR方法，并对该方法进行敏感性、特异性、重复性及临床菌株检测试验。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

等病原体的检测，果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量ＰＲ具有特异、结Ｃ敏
感、快速、定量、重复性好等优点，用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。可关键词中图分类号单孢子虫折光马尔太虫二重荧光定量ＰＲＣ￥４．，８９４３Ｑ７文献识别码Ａ文章编号１０ —０５２１）３０７－７００７７（０００ —０７０
ｓ．ａｄＭａｔｉａｒｆｉｇｎ．ＴｈｕｌｅｌｉＣｓａａｏｎｏｂｐｃｉａｄｔｐｎｒｅｌｅｒｎｅｓｉｅｄｐｅｒａｔｘ — ｍｅＰＲａｓｙｗｓｆｕｄｔｅｓｅｉｃｎｏｆ
ｂｂｅｔｅｅｔａｄｄｆｅｅｔｔｐｌｓｏｉｉｒｐｎａｔｉｉｅｉｇｎ，ａｄｎｏｉｅａｌｏｄｔｃｎｉｒｎｉｅＨａｏｐｒｄｕｎｓ．ａｄＭｒｅｌｒｆｒｎｅｓｎｏｐｓ— ｆａａｔｖｅｕｔｒｂｅｖｄｗｈｎｎｃｅｃａｉｒｍｒｉｓｓｓ．ＰｓｕｏｎｎｓｕｒｓｅｓＶｉ— ｉｅｒｓｌｓｗｅｅｏｓｒｅｅｕｌｉｃｄｆｏＰｅｋｎｕｐ，ｅｄｒｏａｏｅｃｎ，ｂｆｌ
谢丽基谢芝勋
庞耀珊刘加波邓显文谢志勤
（西兽医研究所，宁５００）广南３０１
摘要
根据ＧｅＢｎｎａｋ中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列，ＰｉｒＥｐｅｓ２０软件设计了用ｒｍｅｘｒｓ．

贝类中3种组织血型抗原ELISA检测方法的建立与分型

关键词: 贝类; 组织血型抗原; 诺如病毒; 酶联免疫吸附; 单克隆抗体
中图分类号: S944
文献标志码: A
文章编号: 1005−8737−(2013)01−0211−06
诺如病毒(noroviruses, NoVs)属于杯状病毒科 (Caliciviridae), 是非细菌性急性肠胃炎的主要病原体, 是一种重要的食源性病毒。NoVs 分为 5 个遗传组(GGI−V), 其中 GGI、GGII 和 GGIV 型可以感染人[1]。在由食物污染造成的病毒性胃肠炎流行中, 90%的病原是 NoVs[2]。20 世纪 70 年代有人假设, NoVs 的感染与宿主的某种遗传因素有关[3]。最近的研究表明, 人类组织血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)作为病毒受体介导了 NoVs 感染人类的过程[4−5]。对 NoVs 感染者和志愿者的回顾性调查发现, 病毒的感染和人的 HBGAs 有着很大的相关性, O 型血的人比 A、B 型血的人更容易感染 NoVs[6−7]。人类 HBGAs 遗传多样性是导致对 NoVs 敏感性存在差异的重要原因之一[8]。
HBGAs 是一类与糖蛋白结合的碳水化合物, 分布于红细胞表面以及呼吸道、消化道和生殖道
黏膜上皮细胞表面, 同时也以游离低聚糖形式存在于唾液、肠内容物、乳汁及血液等体液中, 具有细胞表面受体、信号传导因子或离子转运通道的功能[9]。ABO 血型系统(包括 A、B 和 H 抗原)、 Lewis 血型系统(包括 Lea、Leb、Lex、Ley 等抗原) 和分泌型(secretor)是 3 种主要的人体 HBGAs。
本实验以牡蛎中的 A 型 HBGAs 为代表, 优化确定 ELISA 标准检测方法, 并应用于其他贝类品种的 B 型和 H 型组织血型抗原的检测。 1.2.2 贝类 HBGAs 的 ELISA 检测方法的建立

荧光定量PCR详细流程和问题解析

荧光定量PCR详细流程和问题解析一般PCR与荧光定量PCR技术区别？简单的讲PCR技术最先是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR 技术那么是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。

如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。

前些年有人讲过一般PCR后，通过电泳也能够进行定量，实际上是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。

近两年没有人再讲这种的话了。

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方式如何选择？从实验本钱来讲，Sybr Green是最好的，大体上确实是一般PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也专门好，还能够进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反映管内进行一种PCR反映的检测，另一个问题是非特异性扩增会阻碍实验结果，固然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。

关于研究人员来讲，若是需要检测的基因很多，而每一个反映管中进行一种PCR反映的检测能够知足实验要求，那么Sybr Green是最好的选择。

若是需要进行多通道实验，即在一个反映管中进行2种或以上的反映，那么要选择其他的方式，最经常使用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的确实是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成份。

因此商业用途的检测试剂盒多数采纳这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。

其缺点在于探针本钱较高，有时设计的探针并非适合，有造成损失的可能性。

而且要进行较多的实验条件的优化。

这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，听说取得Molecular beacon 的许可权的本钱相对较低，但只是听说。

另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方式的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，若是不考虑多通道实验，那么不如Sybr Green法选择单通道实验仍是多通道实验？这是要依如实验需要来选择的，若是有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，能够考虑选择多通道实验。

贝类包拉米虫和派琴虫二重荧光定量PCR方法的建立

关键词：包拉米虫；派琴虫；二重实类号：￥９４４．３４４文献标识码：Ａ文章编号：１００５ — ９４４Ｘ（２０１３）０５ — ００４９ — ０５
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤｕｐｌｅｘＲｅａｌ — ｔｉｍｅＰＣＲＡｓｓａｙｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｏｎａｍｉａａｎｄＰｅｒｋｉｎｓｕｓｉｎＳｈｅｌｌｉｓｆｈ
中国动物检疫２０１３年第３０卷第５期
贝类包拉米虫和派琴虫二重荧光定量ＰＣＲ方法的建立
张艳芳，谢芝勋，谢丽基，刘加波，庞耀珊，范晴，罗思思，邓显文，谢志勤（广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁５３０００１）
（ＧｕａｎｇｘｉＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＡｎｉｍａｌＶａｃｃｉｎｅｓａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００１，Ｃｈｉｎａ）
ｐｒｉｍｅｒｓ，ｔｗｏＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅｓａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｄｕｐｌｅｘｒｅａｌ — ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｏｒｆｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

荧光定量pcr步骤

荧光定量pcr步骤荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种利用荧光信号定量测定PCR产物数量的技术。

它在基本PCR技术的基础上，引入了特定的荧光探针，可以实时监测PCR反应过程中靶标DNA的扩增情况。

以下是荧光定量PCR的步骤及详细介绍：1.实验前准备a.收集所需试剂及材料，包括引物、探针、模板DNA、反应缓冲液、酶、核酸酶、荧光素等。

b.制备PCR反应混合液，包括酶、引物、探针和PCR缓冲液等。

c. 为了保持RNA稳定性，应采取相应的预防措施，如在实验室中使用RNAse除去剂。

2.引物和探针设计a.根据目标序列设计一对引物，以确保其与目标序列的特定区域能够特异性结合。

b.选择主键杂交靶标的位置以及检测利益的位置，并设计一个特异性且能识别绑定的荧光探针。

3.PCR反应a.将PCR反应混合液均匀地分配到PCR管或板中。

b.加入样本DNA模板和水，并确保液体混合均匀。

c.封上PCR管或板，放入PCR仪器中，并设定适当的PCR程序和参数。

-热启动：95°C，3分钟-循环阶段：95°C，15秒；60°C，60秒-扩增阶段：72°C，60秒；60°C，15秒（扩增40-45个周期）-最终延伸：72°C，5分钟4.荧光信号检测a.PCR反应中途和结束后，使用相关PCR仪器测量荧光信号。

b.根据所选荧光信号和阈值设定，观察监测每个循环的相对荧光强度。

c.在PCR反应过程中，可以根据荧光增强的速率和其峰值浓度判断PCR的效果和反应速率。

5.数据分析a.使用相关软件分析荧光定量PCR数据。

b.根据系统软件中的内置算法，计算出样品中目标序列的数量和浓度。

c.通过与标准曲线进行比较，确定目标序列在样品中的浓度。

荧光定量PCR的主要优势在于其快速、高灵敏度、高特异性以及实时性。

它已广泛应用于基因表达研究、病原体检测、突变分析和遗传位点分析等领域。

同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立

同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立王彩霞;冯春燕;王巧黎;袁向芬;邓俊花;吕继洲;吴绍强【摘要】为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18S rRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同时还进行了特异性检测和敏感性检测,并通过对扩增产物进行限制性内切酶酶切检验双重LAMP方法的准确性.结果表明本研究建立的贝类寄生虫双重LAMP方法具有较好的特异性,检测派琴虫时的最低检测限为10拷贝/μL质粒DNA,检测包纳米虫时的最低检测限为100拷贝/μL质粒DNA,同时酶切试验也验证了双重LAMP检测结果的准确性.对随机采自东海和黄海的20份菲律宾蛤仔和10份美国进口牡蛎的检测结果显示,该双重LAMP方法在口岸检疫工作中可以作为派琴虫和包纳米虫的快速检测方法.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)008【总页数】8页(P1935-1942)【关键词】贝类寄生虫病;环介导等温扩增反应(LAMP);检测;派琴虫;包纳米虫【作者】王彩霞;冯春燕;王巧黎;袁向芬;邓俊花;吕继洲;吴绍强【作者单位】中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;青岛市中心医疗集团,青岛266005;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029;中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所,北京100029【正文语种】中文【中图分类】Q78贝类寄生虫是危害世界各国贝类养殖业的主要病原，其中危害较为严重的为派琴虫(Perkinsus)和包纳米虫(Bonamia)，二者均为世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health，OIE)法定上报水生动物疫病的病原，部分在中国周边海域已有相关报道[1-2]。

多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立

多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立目的建立可同时检测四种疟原虫的多重荧光定量PCR方法。

方法PCR 扩增四种疟原虫目的片段，克隆并构建标准质粒，进行梯度稀释。

体系按浓度加入五重引物探针，对临床四种疟原虫阳性血样及单一腺病毒和肺炎支原体阳性血样、人基因组进行特异性检测。

将本地区优势虫种恶性疟及间日疟阳性血样混合并检测。

每个反应做一式三份验证重复性。

检测标准品梯度浓度，获得体系最低检测限。

结果成功构建四种疟原虫标准质粒。

对20份样本进行检测，其中15份恶性疟，3份间日疟，1份三日疟，1份卵形疟，与原有确证结果一致。

对单一腺病毒及肺炎支原体阳性血样、人基因组检测结果均为阴性。

恶性疟及间日疟阳性血样混合检测显示3条特异性扩增曲线。

三个复孔的变异系数在0.17～4.96之间。

恶性疟可检测到102 copies/mL，间日疟、三日疟、卵形疟可检测到103 copies/mL。

结论建立五重荧光定量PCR检测四种疟原虫特异性及重复性均较好，灵敏度高，可用于疟原虫快速筛选及分型鉴定。

[Abstract] Objective To establish the multiple fluorescence quantitative PCR measure to detect four types of plasmodium at the same time. Methods Target fragments of four types of plasmodium were extended by PCR，the standard plasmid was cloned，constructed and diluted by gradient. Five primers and probes were added into the system according to the concentration and the clinical four plasmodium positive blood sample，single adenovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample as well as human gene was detected specifically. The falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample caused by the local superior plasmodium were mixed and detected. Each experiment was performed for three times to validate the repetitiveness. The gradient concentration of the sample was detected and the lowest detection limitation was achieved. Results The standard plasmids of four plasmodiums were successfully constructed and 20 samples were detected. 15 samples were falciparum malaria and 3 samples were tertian malaria，1 sample was quartan malaria and 1 sample was ovale malaria，which was in accordance with the original validated results. The results of detection of single adnovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample and human gene were negative. 3 specifically extended curves were presented by the mixed detection of falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample. The variable coefficients of the three duplication holes were within 0.17-4.96. Falciparum malaria was detected to be 102 copies/mL and tertian malaria，quartan malaria as well as ovale malaria was detected to be 103 copies/mL. Conclusion The established five fluorescence quantitative-PCR in the detection of four types of plasmodium has good specificity and repetitiveness as well as high sensitivity，which can be used in the quick screening and type identification of plasmodium.[Key words] Multiple fluorescence quantitative-PCR；Plasmodium；Mosquito-borne diseases；Malaria疟疾是由蚊子传播的一种寄生虫病，由带有疟原虫的雌性按蚊叮咬人体而传染，其已经成为全球热带、亚热带最严重的公共卫生问题之一[1]。

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ＧｕａｘＶｅｅｎｒＲｅｅａｃＩｓｉｕｔ，ＧｕａｇｉｎｇｉｔｒａｙｉｓｒｈｎｔｔｅｎｘＫｅＬｂｒｔｒｆＡｎｍａｃｉｅｎｗＴｃｎｌｇ，ｙａｏａｏｏｉｌＶａｃｎｓａｄＮｅｅｈｏｏｙｙＮａｎｉ５３００１Ｃｈｉａｎｎｇ０，ｎ
ＤｅｅｏｖｌｐｍｅｏａｎｔｆＭｕｔｐｌｘｌｉｅＲｅｌａ－ＴｉｅｍＰＣＲＡｓａｆＤｅｅｔｏｏｓｙｏｒｔｃｉｎｆＴｈｒｅｅＰｒｔｚａｉＳｌｓｏｏｏｎｓｎｈｅｌｈｉｆ
ＸＥｈ－ｎ，ＸＩｉＪ，ＰＮＧＹｏＳａ，ＬＵＪ — ｏＤＮＧＸａ — ｎＩｈ－ｉＩＺｉＸｕＥＬ— ｉＡａ — ｈｎＩｉＢ，ＥｉｎＷｅ，ＸＥＺｉＱｎａ
反应条件和试剂浓度进行优化，立能够同时检测单孢子虫、琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量ＰＲ方法。结建派Ｃ果：方法对单孢子虫、琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性分别达到４、０和４个模板拷贝数；外抗干扰能力该派０４００此
研究报告
３贝类原虫多重荧光定量ＰＲ方法的建立种Ｃ
谢芝勋，丽基，谢庞耀珊，刘加波，显文，志勤邓谢
广西壮族自治区兽医研究所，西畜禽疫苗新技术重点实验室，西南宁５００广广３０１［要］目的：立能够同时检测单孢子虫、琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量ＰＲ方法。方法：据基因库摘建派Ｃ根中单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的基因序列，计３特异性引物和３用不同荧光基团标记的Ｔｑｎ针，设对条ａＭａ探对
ｅｃｐｏｏｏｎａａｉｒｄｓｇｅ．Ｔｅｒａｔｎａａｔｒｓｃｓｈｃｎｅｔａｉｎｆｔｒｅａｒｆｐｍｅｓａｈｒｔｚａｐｒｓｅｗｅｅｅｉｎｄｈｅｃｉｐｒｍｅｅｓｕｈａｔｅｏｃｎｒｔｏｈｅｐｉｔｏｏｏｒｒ，ｉｔｒｅＴｑｎｐｏｅｎｈｅｃｉｎｕｆｒｗｒｐｉｚｄｏｄｖｌｐａｍｕｉｌｘｅｌｔＰＲｓａ．Ｒｅｕｔ：ｈｅａＭａｒｂｓａｄｔｅｒａｔｂｆｅｅｏｔｏｅｍｉｅｔｅｅｏｈｐｅｒａ— ｉｍｅＣａｓｙｓｌｓＴｅｓｎｉｖｔｆｍｕｉｌｘｒａ — ｉＣＲａｓｙｗｓ４，４０ａｄ４ｅｌｔｏｉｓｆｒＨａｏｐｒｄｕｓ．ＰｒｈｅｓｔｉｏｈｐｅｅｌｔｉｙｍｅＰｓａａ００ｎ０ｔｍｐａｅｃｐｅｐｌｓｏｉｉｍｐ，ｅ — ｏ
强，单孢子虫、对派琴虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合，可有效地同时检测这３种原虫，嗜水气单胞菌、仍对荧光假单胞菌、副溶血弧菌、藻弧菌、弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果均为阴性。结论：立的单孢子虫、溶河建派琴虫和折光马尔太虫多重荧光定量ＰＲ具有特异、感、速、量和重复性好等优点，用于临床上单孢子虫、Ｃ敏快定可派
Ｃｏｒｓｏｄｉｇａｔｏ，Ｅ－ｍａｈｘｅｈｘｎ１６．ｏｒｅｐｎｎｕｈｒｉｉｚｉｕ＠２ｃｎ
［ｂｔａｔＯｊｃｉｅｏｄｖｌｐａｍｈｐｅｒｌｔＰＲａｓｙｆｒｔｅａｉｅｅｔｎｏｐｏｐｒｉｍＡｓｒｃ］ｂｅｔ：Ｔｅｅｕｉｌｖｏｘｅ－ｉａｍｅＣｓａｏｈｒｄｄｔｃｏｆＨａｌｏｉｕｐｉｓｄ
琴虫和折光马尔太虫感染的检测。［键词］单孢子虫；琴虫；光马尔太虫；重荧光定量ＰＲ关派折三Ｃ
［图分类号Ａ文
［章编号］１０ — ０２２１）５０１ — ５文０９００（０２０ — ７３０