发酵工程制药

4、工业用培养基---------定量组成培养基配方
（三）培养方法
• 按培养基类型分为----------固体培养法、液体培 养法。 • 按操作方式分为---------分批培养、半连续培养、 连续培养。 • 按氧气供应分为--------需氧培养、厌氧培养。
•下面分别介绍其中重要的5种方法：
1、浅盘培养
第五章 发酵工程制药
第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药） 生产原理 第二节：利用微生物进行药物的生产实例
第一节：微生物工程（发酵工程制药）生产原理
• 人工培养的微生物，通过体内的特定酶系，经过复杂的 生物化学反应过程和代谢作用，最终合成人们所需要的 药物如抗生素、氨基酸、有液体通风深层培养
• 简称深层培养法，是最先 进的方法。 • 在我国，抗生素、柠檬酸 的生产常常采用此法。
4、厌氧培养
• （1）简单的方法是，用一般的发酵槽，撤去 通风设备。 （2）真正的方法是必须把氧气抽除，采用真 空泵来抽去氧气。
较为先进的方法是 加拿大的BBL Gas Pak 150的厌氧培养器 采用由水发生氢气的方法 此氢气与氧气反应，遂形成真空。
2：放线菌
• 有以下分类 •委内瑞拉链霉菌（S.veneznelae） •能产生氯霉素
•金霉素链霉菌（S. aureofaciens） •能产生金霉素。
卡那霉素链霉菌（S.kanamycetieus） 能产生卡那霉素 红霉素链霉菌（S.enytnreus） 能产生红霉素。
3：霉菌
• （1）曲霉属-------米曲霉（Aspergillus oryzae）能 产生高峰淀粉酶。 • （2）黑霉属（A.niger）------能产生酸性蛋白酶、 蛋白酶。 • （3）青霉属--------点青霉（Penicillium.notatum）、 产黄青霉（P.chrysogenum）能产生青霉素。橘青 霉（P.citrinum）可产生核酸酶P1。
3、连续培养法的分类
• 可以分为以下3类：
• （1）单级连续培养 • （2）细胞回流式的单级连续培养 • （3）多级连续培养
（1）单级连续培养
• 新鲜培养基的加入速率=培 养之后的物料抽出速率。这 种培养方法称为单级连续培 养法。 • 在单级连续培养方法之中， 发酵液体积保持恒定，生物 反应器中各组分分布均匀。 • 单级连续培养是一种最简单 的连续培养方法。
（3）PH值
• 细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。
• 酵母菌、霉菌则喜酸性环境。
• 乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好 的耐受性。
（4）溶解氧浓度
• 不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求 • 应该根据具体情况来加以控制。
•空气过滤片
（5）代谢产物的抑制作用
• 细胞的代谢产物会影响到细胞的生长， 这种现象称作产物抑制作用。 • 而代谢产物多数就是生物制物的原材料。
4：酵母
• 酵母属-------最常用的是酿酒酵母，用于 进行酒精发酵。
二：微生物的培养技术
• • • • （一）培养基组成 （二）培养基的分类 （三）培养方法 （四）培养条件
（一）培养基组成
•1、碳源 •一般为蔗糖、葡萄糖。 •工业用碳源为淀粉水解液、 •糖蜜、干薯粉、甲醇、乙醇、 •石油、醋酸等等材料。
四：微生物发酵的工艺学原理
• （一）分批培养 • （二）连续培养 • （三）其它培养方法
（一）分批培养
•1、分批培养的定义 • 3点
•2、分批培养的生长过程
•3、分批培养过程中影响细胞生长的因素
• 分批培养是一种间 歇式的培养方法， 在每一批次的培养 过程中，不再加入 其它营养物料。待 为了提高生物反应器在分批培养中的效率 生物反应进行到一 通常采用多级分批培养的办法。 即在小型生物反应器中接入少量种子 定程度之后，将全 经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子 部培养液倒出、进 再转入到大型生物反应器中 行后道工序的处理。
• • • • • • 1、培养基浓度 2、温度 3、PH值 4、氧气 5、氮源 6、微量因子
1、培养基浓度
• 一般为含葡萄糖10%
• 最高可以通过流加法达到15%。
2、温度
• 一般为30-33℃
• 超过33℃时应该进行冷却。
3、PH值
• （1）酵母菌为PH=4.0--6.0 • （2）细菌的PH=6. 0--7.5 • （3）霉菌生产的PH值则在4.0--9.0之间。
4、氧气
• 微生物的类别有需氧菌、厌氧菌、兼性菌 三种。 • 各自需要不同的氧气条件。
测定培养剂的溶解氧是一个技术关键。
5、氮源
• 一般情况下，是以使用尿素为最适合， 因为一则尿素可以维持发酵液的PH值不 变，同时又能够供给氮源的需要。 使用硫酸铵时， 由于其残留的硫酸根使得发酵液PH值变小 必须用碱性物质中和
• 四川抗生素研究所
讲解分章节内容
•一：最常用的工业微生物 •二：微生物的培养技术 •三：细胞浓度的测量
•四：微生物发酵的工艺学原理
•五：工业微生物菌种的制备和改良 •六：发酵生产过程
•七：灭菌技术
•八：分离纯化技术 •九：干燥技术
一：最常用的工业微生物
• • • • 1：细菌 2：放线菌 3：霉菌 4：酵母
（1）营养物质浓度
• 营养物质的限制性浓度-------当某一种营 养物质的浓度下降到一定程度之后，就 会影响细菌的生长，此时的浓度就称为 营养物质的限制性浓度。
• 营养物质的最大浓度-------当某一种营养 物质的浓度超过一定程度之后，也会对 细菌的生长产生抑制作用。
（2）温度
• 当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低， • 随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快， • 当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变 性，导致细菌生长速率的急速下降。 微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的最佳生产温度。 因此在具体的生产过程中， 培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域， 而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度， 以获得较多的产物
1、细胞干重法
• 将一定体积的培养液离心，收集细胞， 洗涤、干燥、进行称重。 不足之处是此方法不适用于统计含有不 溶性沉淀物的培养液。
2、显微计数法
• 利用显微镜和血球计数器、测定单位体 积内培养液中的细胞个数。
缺点是： （1）不适用于丝状生物体的计数。 （2）不能区别活细胞和死细胞。 （3）由于细菌太小，不适于进行计数。
分批培养的设备要求较少 操作也较简单 工业微生物生产中经常采用
1、分批培养 的定义
2、分批培养的生长过程
• 培养中的细胞经过4个生长阶段：
• • • •
（1）延迟期 （2）指数生长期 （3）静止期 （4）衰亡期
1、延迟期 （1）种龄越长，延迟期越长， （2）接种量越少、延迟期越长
2、指数生长期 细胞的倍增时间 指细胞浓度增长一倍所需要的时间。 微生物的倍增时间一般为0.5—1小时。
6、微量因子
• 主要是指维生素，它是微生物生长所不可 缺少的营养成份所需。
很多天然的碳源与氮源之中 一般均含有众多的维生素物质 配制培养基时一般不需另外添加
三：细胞浓度的测量
• （一）直接测定法
• （二）间接测量法
（一）直接测定法
• 特点是直观精确
1 细胞干重法 2 显微计数法
3 平板计数法
4 浊度法
3、平板计数法
将样品用无菌生理盐水进行逐一数量级的稀释然后 取一定量的稀释液涂于琼脂平板培养基上，经过一 段时间的培养，从平板上长出的菌落数量，可以计 算出原培养液中微生物的浓度。
其优点是 可用于测定活细胞的浓度
4、浊度法
• 由于培养液的浊度和光密度与培养液中的细胞浓度 成正比关系，因此，可以通过分光光度计法用600700nm波长进行测定。 • 其优点是快速、准确。
• 该方法选用于固体 培养法、也适用于 液体培养法。 • 其方法是将固体或 者液体培养基盛于 不锈钢制的浅盘内， 接种菌种，在保温 室内培养。
2、厚层通风培养
• 此方法用于固体培养。
所用设备是在水面建造大型水泥槽 水泥槽底部铺上多孔板 板上放置固体培养基 接种之后 将空气由多孔板下部通入培养基内
• 这种方法的优点是培养量大，并且节省劳动力。 国内酱油厂多采用此法。
•2、氮源 •主要有硫酸铵、 •尿素、豆饼水解液。
•3、无机盐 •磷酸二氢钾、 •磷酸氢二钾 •七水硫酸镁。
4、微量生长因子 生物素 硫铵素 玉米浆最常用
（二）培养基的分类
1、细菌用培养基 以肉汤+蛋白胨+酵母膏作为其组成物质。 2、酵母、霉菌用培养基--------以曲汁和麦芽汁为最常用 将米曲（或者麦芽汁）添加适量水，在55℃下糖化2小时， 经过过滤，滤液稀释至糖度10度，备用。 3、培养霉菌则专用蔡氏霉菌培养剂 蔗糖20-30g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、 七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1L。
•
青霉菌
1：细菌
• （1）醋杆菌属--------醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）可以将酒精转 变为醋酸。弱氧化醋杆菌（Acetobacter suboxydans）可以将山梨糖 醇转变为山梨糖。 • （2）乳杆菌属--------德氏乳杆菌（Lactobacillus delbriiekii）可以将 糖转变为乳糖。 • （3）链球菌属（Streptococcus）-------用来生产乳酸。 • （4）片球菌属（Pediococcus）-------用来生产乳酸。 • （5）串珠菌属（Leuconostoc）-------用来生产乳酸。 • （6）芽孢杆菌属-------枯草杆菌（Bacillus subtilis）可以用来生产 α -淀粉酶、肌苷、鸟苷等核苷。 • （7）梭菌属------丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylium）用来生 产丙酮、丁醇。 • （8）大肠杆菌（Escherichia coli）用来作为基因工程的克隆菌。