生化仪器分析
生化分析仪检测原理
生化分析仪检测原理生化分析仪是一种用于测定生物样本中化学成分的仪器，它可以对血液、尿液、唾液等生物样本进行快速、准确的化学分析。
生化分析仪的检测原理是基于生物化学反应和光学检测技术的结合，通过测定样本中特定化学物质的浓度来判断健康状况或疾病情况。
生化分析仪的检测原理主要包括样本处理、生化反应和光学检测三个部分。
首先，样本处理是生化分析的第一步，包括血清、血浆、尿液等生物样本的采集、预处理和稀释。
样本处理的质量直接影响到后续的生化分析结果，因此必须严格控制样本的采集和处理过程。
其次，生化反应是生化分析的核心环节，它是指将样本中的特定化学物质与试剂发生化学反应，产生可测定的光学信号。
生化反应的选择和条件控制对于分析结果的准确性和灵敏度至关重要。
最后，光学检测是利用光学仪器对生化反应产生的光学信号进行检测和分析，常见的光学检测技术包括吸光度测定、荧光测定、光散射测定等。
光学检测技术的发展使得生化分析仪能够实现多参数、高通量、高灵敏度的生化分析。
生化分析仪的检测原理基于生物样本中特定化学物质的浓度与健康状况或疾病情况之间的关系。
通过测定血液中的葡萄糖、胆固醇、肾功能指标、肝功能指标等化学物质的浓度，可以帮助医生判断糖尿病、高血压、肝炎等疾病的诊断和治疗。
通过测定尿液中的蛋白质、尿酸、尿素氮等化学物质的浓度，可以帮助医生判断肾脏功能、泌尿系统疾病等情况。
生化分析仪的检测结果可以为临床诊断和治疗提供重要的参考依据，也可以用于健康体检和疾病筛查。
总之，生化分析仪是一种基于生物化学反应和光学检测技术的仪器，其检测原理包括样本处理、生化反应和光学检测三个部分。
通过测定生物样本中特定化学物质的浓度，生化分析仪可以帮助医生进行疾病诊断和治疗，也可以用于健康体检和疾病筛查。
随着生化分析技术的不断发展，生化分析仪将在医疗、科研和健康管理领域发挥越来越重要的作用。
全自动生化分析仪工作原理
全自动生化分析仪工作原理
全自动生化分析仪是一种常见的实验室仪器，用于快速、准确地分析生物样本中的化学组分。
其工作原理如下：
1. 采样：全自动生化分析仪通过自动取样系统，从待测样品中抽取一定体积的样品。
2. 样品处理：取得样品后，生化分析仪会对样品进行预处理，通常包括离心、加热、稀释等操作，以便于后续分析。
3. 反应：样品经过处理后会被送入反应池中，与特定试剂发生相应的化学反应。
反应种类多样，常见的有酶促反应、免疫反应、化学反应等。
4. 光学检测：在反应池中发生的化学反应会产生各种信号，这些信号可以通过光学方式进行检测。
大多数生化分析仪是基于光学检测原理，其利用特定波长的光对反应物质进行测量。
5. 数据分析：生化分析仪会将检测到的光学信号转化为数字信号，并进行数据处理和分析。
仪器通常带有内置的电子计算机，可以自动计算和输出各种分析结果，如浓度、比例、反应速率等。
6. 结果输出：分析仪会将计算得到的分析结果显示在仪器屏幕上，并可通过打印机或数据输出接口将结果输出到其他设备或存储介质中。
全自动生化分析仪的工作原理可以大致归纳为采样、样品处理、反应、光学检测、数据分析和结果输出等步骤。
这些步骤的快速、自动化完成，使得生化分析结果准确可靠，并且大大提高了实验效率。
生化分析仪的主要功能是什么
生化分析仪的主要功能是什么生化分析仪是一种用于测定化学和生物反应的仪器，它在医疗、生物科学、环境科学等领域起着重要作用。
本文将介绍生化分析仪的主要功能，包括样本检测、生物分析、质量控制等方面，并探讨其在医学诊断、生物科学研究和环境监测等领域中的应用。
一、样本检测生化分析仪能够检测各种不同类型的样本，包括血液、尿液、唾液和组织液等。
它可以对这些样本进行定量分析，测量出其中特定物质的浓度，例如葡萄糖、尿素、电解质和脂肪等。
这对于医生进行疾病诊断和监测患者的治疗效果十分重要。
二、生物分析生化分析仪可用于研究生物体内各种化学反应和代谢过程。
例如，它可以测量酶的活性，判断某个酶是否异常，从而对疾病进行早期诊断。
此外，生化分析仪还可以测定蛋白质、核酸和细胞等生物分子的含量，为生物科学家提供重要的研究工具。
三、质量控制在医疗诊断和科学研究中，准确性和可靠性是非常重要的。
生化分析仪可以进行质量控制，确保测量结果的准确性。
它可以与标准物质进行比对，校准仪器的准确度。
此外，生化分析仪还可以监测仪器的稳定性和再现性，确保在不同时间和不同实验条件下的一致性。
四、医学诊断生化分析仪在医学诊断中起着不可替代的作用。
它可以通过检测血液中特定物质的浓度来判断患者是否患有某种疾病。
例如，高血糖浓度可能表明患者患有糖尿病，高胆固醇和甘油三酯水平可能提示患者有心血管疾病的风险。
生化分析仪能够快速、准确地测量这些指标，为医生的诊断和治疗提供重要依据。
五、生物科学研究生化分析仪在生物科学研究中扮演着关键角色。
它可以帮助科学家了解生物体内各种化学反应和代谢过程的机制，探究疾病的发生机理。
通过测量蛋白质、核酸和细胞等生物分子的含量，生化分析仪可以揭示这些分子在生物体内的作用和相互关系。
这对于开展基础研究和新药开发具有重要意义。
六、环境监测生化分析仪在环境科学中也有广泛应用。
它可以测定水、土壤和空气中的污染物浓度，例如重金属、有机物和细菌等。
生化分析仪常用分析方法—课件
（二）固定时间法（fixed-time assay)
①概述 ②计算公式 ③临床应用
①概述
1）固定时间法（fixed-time assay):指在时间-吸光度曲线上选择两个 测光点，此两点既非反应初始吸光度，亦非终点吸光度，即样品和 试剂混合后读取延滞期后的吸光度A1和反应一定时间的吸光度A2， 这两点的吸光度差值用于计算结果。如图
样品处理系统
样品架和样品盘 试剂架和试剂盘 加液器：包括定量吸量器和加样针
搅拌器：由电机和搅拌棒组成
检测系统
光路系统：前分光光路、后分光光路 分光装置：滤光片和单色器
比色杯：反应杯 信号检测器：光电信号转换 恒温装置：保持恒温，25℃、30℃、37℃
清洗装置：吸液针、吐液针、擦拭刷经化学 反应后随着被测物的消耗吸光度下降。
②分类
分类
一点终点法 两点终点法
一点终点法（one point end assay)
1）定义：在反应达到平衡时选择一个测光点的吸光度计算待测物 浓度，主要用于单试剂的测定。如图
2）计算公式
Cu=Au×Cs/As=Au×K
2）快速反应干扰物：在样本中含有明显干扰待测物反应的物质时， 固定时间法能有效去除这些干扰，提高特异性。某些干扰物比待测 物更快与试剂发生反应。
3）慢反应干扰物：一些干扰物在待测物反应完全后才开始发生反 应。
②计算公式
C=（A2-A1）×K K为校准系数 K=Cs/As
③临床应用
主要应用于样本中有物 质明显干扰待测物反应 的情况，如苦味酸法测 定肌酐、溴甲酚氯法测 定血清白蛋白等
（三）自动生化分析仪检测项目
常包括肝功能、血糖、血脂、 肾功能、心肌酶谱、骨代谢、 尿蛋白等，例如AST、ALT、 GGT、LDH、TBA、TG、TC、 ALP、GLU、UREA、UA、LDL、 HDL、CK、TP等
生化分析仪的原理和应用
生化分析仪的原理和应用一. 生化分析仪的原理生化分析仪是一种应用于生物医学领域的分析仪器，通过测量和分析生物样本中的化学成分来获得有关生物体内化学过程的信息。
生化分析仪基于一系列的原理和技术来进行样本的分析和测试。
1. 光谱分析原理生化分析仪的光谱分析原理是其中一项主要原理。
它利用吸收、发射、散射等光的特性来分析样本中的化学成分。
在生化分析仪中，常常采用紫外光、可见光和红外光等不同波长的光源，根据不同化学成分对不同波长光的吸收或发射情况进行测量和分析。
2. 电化学分析原理电化学分析原理是另一项常用于生化分析仪的原理。
它通过测量电化学响应来分析和检测样本中的化学成分。
常见的电化学分析方法包括电位法、电流法和阻抗法等。
电化学分析原理在药物代谢、血液检测、生物传感器等领域具有广泛的应用。
3. 酶标仪原理酶标仪是生化分析仪的一种常见类型，其原理是利用酶作用来测量和分析样本中的化学物质。
酶标仪通常会添加特定酶到样本中，酶与目标化学物质发生反应后产生可测量的信号。
常见的酶标仪原理包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶联免疫检测（EIA）等。
二. 生化分析仪的应用生化分析仪在生物医学领域有着广泛的应用，对于疾病诊断、药物研发和临床监测等方面起着重要作用。
以下列举了几个常见的生化分析仪的应用场景。
1. 临床化验生化分析仪在临床化验方面有着重要的应用。
它可以分析和测量血液、尿液、体液等样本中的生化指标，例如血液中的血红蛋白、白细胞计数和血糖水平等。
通过对这些指标的测量和分析，可以帮助医生诊断疾病、监测患者病情以及评估治疗效果。
2. 药物研发生化分析仪在药物研发过程中起到了至关重要的作用。
它可以用于分析和评估新药的药代动力学和药效学特性，例如药物的吸收速度、分布情况和代谢途径等。
通过生化分析仪的测试和分析，研究人员可以获得新药的关键信息，从而进行药物优化和剂量调整，提高药物疗效和安全性。
3. 食品安全检测生化分析仪在食品安全检测方面也有着广泛应用。
全自动生化分析仪的检测原理
全自动生化分析仪的检测原理1.吸光光度法：吸光光度法是一种常用的定量分析方法，通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收，来确定样品中其中一种物质的浓度。
全自动生化分析仪会通过光分束器将光束分成两部分，并分别通过待测样品和标准溶液。
经过样品和标准溶液后，光被光电二极管接收并转换成电信号，进而经过放大和滤波等处理，最后根据光强和标准曲线计算出待测样品中物质的浓度。
2.酶促反应法：全自动生化分析仪常用酶促反应法来测定样品中酶的活性。
在酶促反应过程中，待测样品中的底物通过酶的催化作用转化为产物，并与试剂中的其中一种物质发生化学反应，产生颜色变化或发光等特征。
全自动生化分析仪会通过光学系统测量样品中产生的颜色变化或发光强度，然后根据标准曲线计算出酶活性。
3.免疫分析法：免疫分析法是一种利用抗体与抗原之间的特异性结合反应来测定样品中其中一种物质的含量的方法。
全自动生化分析仪通过荧光、化学发光、放射免疫测定等不同的检测技术来实现免疫分析。
具体来说，全自动生化分析仪先将抗体或抗原固定在特定的载体上，然后将待测样品和标准溶液添加到反应孔中，使抗体与待测物质发生特异性结合反应。
接下来，根据具体的检测技术，全自动生化分析仪会检测标记的抗体或抗原，并通过光电二极管接收信号，最终根据标准曲线计算出待测样品中物质的含量。
4.电化学分析法：电化学分析法是利用电化学原理进行定量分析的方法。
全自动生化分析仪会采用电极对待测样品进行电化学测量。
例如，根据样品中其中一种物质的氧化还原反应，可以通过测量氧化还原电流或电势差来得到物质的浓度。
此外，电化学分析法还可以应用于测定氨基酸、蛋白质和核酸等特定化合物的含量。
以上仅为全自动生化分析仪检测原理的几个常见方面，实际应用中还涉及到许多其他的检测原理和技术。
全自动生化分析仪通过各种方法和技术的组合应用，能够实现对生物样本中多种参数的快速、高通量、准确的检测和分析。
现代生化仪器分析
现代生化仪器分析生化仪器是一类高端实验工具，主要用于研究生物体内的化学反应和生物分子之间的相互作用。
它们使用尖端技术来运行，使生物学家可以访问具有准确性和敏感性的数据，这是人类理解生命起源，维持和调节健康及治疗疾病的一项重要工作。
这篇文章将介绍一系列各式各样的现代生化仪器，这些仪器在生物医学领域中扮演了重要的角色，对生命科学做出了重要的贡献。
1. 气相色谱质谱仪（GC-MS）GC-MS 是一种生化分析仪器，用于鉴定和定量甲烷烃、硫醇、羧酸、脂肪酸等样品的化合物成分。
它将气相色谱技术和质量分析技术结合起来，可以分离样品中的混合成分，并对化学成分进行鉴定。
在生物医学领域，GC-MS 经常被用于检测血液、尿液和其他生物体液中的药物，以及确定代谢产物或毒理代谢物。
此外，它也被广泛应用于环境科学和食品科学等其他专业领域。
2. 高效液相色谱仪（HPLC）HPLC 是一种生化分析仪，用于检测样品中含量微量的化学物质。
它通过强制过程将样品溶解在一个流体中，然后通过色谱柱进行分离。
最终分离出来的化合物被检测器检测。
HPLC 在生物医学研究中也是非常常用的一种仪器。
它经常被用来分离、鉴定和测定药物代谢产物、酶反应产物和生物标志物等。
3. 红外光谱仪（FTIR）FTIR 是一种生化分析仪，用于确定研究物的分子结构和功能。
它通过分析红外辐射光谱来获取偏振光光谱和反射光谱，从而展示物质分子间的相互作用和其在生物体内的含量。
FTIR 在医学和生物科学研究中应用广泛，如结构生物学、化学测量、光学显微镜等。
4. 能谱仪（SEM）SEM 是一种生化仪器，主要用于确定生物体内的结构和形态。
它使用电子束扫描来扫描样品表面，并分析反射的电子图像。
SEM 尤其在细胞生物学和医学领域中，被用于研究细胞和神经元结构、蛋白质分子等生物体内重要组件的结构和空间位置。
5. 分子光度计（UV-VIS）UV-VIS 分光光度计是一种生化分析仪器，用于测量分子中特定化学键对紫外线或可见光的吸收性质，如蛋白质、核酸和肽链等。
全自动生化分析仪的检测原理
全自动生化分析仪的检测原理全自动生化分析仪是一种用于生物化学分析的仪器，主要用于检测血液或其他生物样本中的化学成分。
其检测原理基于一系列光电化学反应，通过测量特定波长的光吸收或光散射来定量分析样本中的生化物质。
下面将详细介绍全自动生化分析仪的检测原理。
一、光谱学基础知识全自动生化分析仪的检测原理主要基于光谱学基础知识。
光谱学是研究光与物质相互作用的科学，主要涉及光的吸收、散射、发射等特性。
在全自动生化分析仪中，主要利用了光的吸收和散射特性。
1.光吸收当一束光通过介质时，光会受到介质的吸收。
不同物质对光的吸收能力不同，这种差异可以用来进行物质鉴定和定量分析。
在全自动生化分析仪中，利用特定波长的光通过样本时被吸收的程度来推算样本中的生化物质浓度。
2.光散射光散射是指光通过介质时，部分光偏离原来方向的现象。
在全自动生化分析仪中，散射光被用来测量样本中颗粒的大小和浓度。
这些颗粒可能包括蛋白质、脂质和其他大分子化合物。
二、生化分析仪检测原理全自动生化分析仪主要包括以下几个关键部分：光源、光检测器、样本容器、搅拌器、温度控制系统和数据处理系统。
1.光源在全自动生化分析仪中，通常使用氙灯或卤素灯作为光源，可以发射出特定波长的光。
这些特定波长的光主要对应于血液中生化物质的吸收峰。
2.光检测器光检测器是用来检测光线通过样本后的吸收或散射光强度的装置。
全自动生化分析仪通常使用光电倍增管作为光检测器，它可以将微弱的光信号转化为电信号，再由数据处理系统进行进一步处理。
3.样本容器和搅拌器样本容器是用来容纳样本的，通常是一种具有光学透明性的容器，例如玻璃或塑料管。
搅拌器则用来混合样本和试剂，使反应能够充分进行。
4.温度控制系统温度控制系统是用来控制反应温度的装置，以确保反应在设定的温度下进行。
在全自动生化分析仪中，通常使用水浴、电热丝或微型加热器来控制温度。
5.数据处理系统数据处理系统是全自动生化分析仪的核心部分，它负责控制仪器的各个部件，进行数据处理和结果输出。
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动能→转动能级→分子的转动光谱;振动能→振动能级→分子的振动光谱;电子运动能→电子运动能级→分子的电子光谱.2由于平动能级只是在同一能级上运动,所以该能级不产生分子光谱.源.单色器.吸收池.光电检测器.显示器2主要技术指标:波长范围.波长精度.波长的重现性.光度的测量精度.光度测量的重现性.杂散光.分辨率.一步洗脱:实验室常用的洗脱方式,用一种浓度的洗脱剂进行洗脱,适用于组分比较单一或者被分离组分非常明确,吸附的量占主要部分2分布洗脱:采用不同浓度的洗脱剂或采用不同种类的洗脱剂进行洗脱,适用于两种以上的组分且吸附数量较少,分离度差别大的组分3梯度洗脱:采用浓度连续变化的洗脱剂进行洗脱,适用于多种组分且吸附数量较多,分离度差别较小,分离度差别较小,上述两种方法难以分离的组分 选择:缓冲容量: 在缓冲容量满足的前提下尽量降低缓冲液浓度;PH 值:缓冲液PH 值与等电点至少相差1个单位;离子强度:尽可能采用低离子强度;保护剂:某些特殊样品需加保护剂保持不稳定性质2选择原则有利于样品的稳定;有利于样品的吸附和洗脱;有利于样品的后处理;考虑缓冲液是否有毒性;考虑是否有热源 上样量:通常上样量不超过交换容量10%~20%2样液浓度:浓度不宜过高,若较高样液浓度,最好先用缓冲液进行稀释再上样3离子强度:样液离子强度不能过高,若高采用较高离子强度的缓冲液,若低采用低离子强度的缓冲液上样4流速:对浓度低的样液流速可快一些,对高浓度的样液流速可慢一些测器.显示器荧光~结构:激发光源.激发单射器.样品池.发射单色器.检测器.显示系统2差异:①测光角度不同,荧光分光光度计的检测器的位置与入射光源的方向成900角,其对面的背景为暗背景,紫外分光光度计检测器的位置与入射光源方向平行,其对面的背景为亮背景②单色器位置不同,荧光~设在检测器前面,样品的发射光经单色器分光后进入检测器,可以除去样品发射以外的辐射,使分析更有专一性,紫外~设在样品池前面,光束先进入分光器分光后再进入样品池③比色杯不同,荧光~使用的样品池是四面透光的样池可作为紫外用,紫外~两面透光的样池,不能作为荧光~用 缓冲液的选择:在被分析的蛋白质稳定的pH 范围内,凡是不与SDS 发生相互作用的缓冲液均可使用,但也要选择对蛋白质条带的分离和电泳速度有利的缓冲液.样品缓冲液要求低离子强度,均采用凝胶缓冲液的1/10,而SDS 含量应高于凝胶缓冲液 2.凝胶浓度的选择:不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度3.样品的处理:a 还原SDS 处理:在样品溶液中加入SDS,还原剂β-ME,DTT 在100℃煮3~5min.b 带有烷基化作用的还原SDS 处理:碘乙酰胺的烷基化作用可以保护SH 基不易再氧化.c 非还原SDS 处理:在测定一些生化样品如体液.血液.尿液时,不希望破坏免疫球蛋白的四级结构,一般只用1%SDS 而不加还原剂在100℃煮3min,这种情况下二硫键未断裂,蛋白质没有完全去折叠,但不能用来测分子量的作用 SDS 是一种阴离子去污剂,它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键,并结合到蛋白质分子上,使分子去折叠,破坏蛋白质分子内的二级和三级结构,使蛋白质变性而改变原有的空间构象2.解聚作用 β-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT),作为一种强还原剂,它的作用是使蛋白质分子中半胱氨酸残基之间的二硫键打开并不易再氧化,在样品和凝胶中同时加入SDS 和还原剂DTT 后,由于还原剂作用,蛋白质分子被解聚成多肽链,形成单链分子3.蛋白质-SDS 复合物 解聚后多肽链的氨基酸侧链与SDS 充分结合,形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物.由于SDS 带有大量负电荷,大大超过了蛋白质分子原有的净电荷量,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异.SDS 与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变,蛋白质-SDS 复合物在水溶液中的形状近似雪茄烟的长椭圆棒,不同相对分子质量的复合物棒状物短轴长度一样,长轴长度与分子量大小成正比.这样复合物的迁移率不再受蛋白质原有电荷与形状影响,只与分子量有关.4.聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应 不同相对分子质量的亚基受阻程度不同,表现出不同的电泳速度,这样利用凝胶的分子筛效应就把同一样品中不同大小相对分子质量的蛋白质亚基分离开.:非选择性洗脱方法,应用于高度特异性吸附剂的结合,经一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下来②分步洗脱:选择性洗脱方法,应用于基因特异性吸附剂,亲和吸附剂上吸附有特异性不尽相同的多组分样品,先用解吸附作用弱的洗脱液,再用解吸附作用强的洗脱液洗脱③梯度洗脱:选择性洗脱方法,利用洗脱液的浓度梯度变化,即解吸附能力逐渐增强,不同的被吸附物质被分别洗脱下来,比分步洗脱更有可能得到较纯的分离对象:在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基②离子强度洗脱:在强离子强度作用下,亲和层析的结合力减弱,将被吸附物洗脱下来③pH +离子强度洗脱:pH 变化再加上离子强度双重作用,适合洗脱结合得比较牢的物质④变性剂洗脱:加入变性剂有利于蛋白质的解离⑤化学断裂:采用专一的化学方法将配基将和载体之间的连接键裂解,避免发生不可逆失活:由激发单重态最低振动能级的跃迁产生的,磷光:由激发三重态最低振动能级的跃迁产生的.差别:二者都是在最低第一级电子激发态振动能级基础上以光子的形式释放能量的.谱线在通过原子化器时,被待测元素的基态原子所吸收,使原子灯发出被测元素特征谱线强弱发生改变,并引起原来辐射信号发生变化,通过检测特征谱线变化来测定原子特征吸收光谱,利用辐射信号变化的强弱来测定化合物中被测元素的含量对于已知被分离物质的等电点,若缓冲液的PH 值化被分离物质的等电点低,被分离物质带正电荷,选择阳离子交换介质,相反若Ph>Pi,被分离物质带负电荷,选择阴离子交换介质.2对于未知被分离物质的等电点,应做预实验,选择加入一种阴离子或阳离子交换介质等量加入若干试管,同时依次加入不同PH 缓冲液,再加入等量样品,混匀后检查每一试管上清液中待测样品被吸附后量的变化,若在某一试管中的样品恰好被吸附,该管就是在此离子交换介质下最佳的3吸附的差异,取两只试管分别加入等量的同一缓冲液,一支加入等量阴离子交换介质,另一支加入等量阳离子交换介质,在相同PH 条件下吸附被分离样品,然后测定两支试管吸附样品的量,做出判断电源不稳定,引起光源能量的波动或光电倍增管老化等原因,使仪器显示参数重现性差,造成测试数据不准确.②尤其是光源偶尔变化对测定结果影响较大.③当试样浓度过大或过稀时引起的误差更大.2如何减少误差:①当吸光值在0.15~1.00,尤其A=0.434,透光率控制在70%~10%,测量误差最小.②以最强的吸收带的最大吸收波长λmax 为入射光的波长,以得到最大测量灵敏度为准③狭缝的宽度与入射光的单色性成反比,狭缝宽度是测试时试样吸收峰半宽度的1/10为最佳.(狭缝的宽度增加,入射光的单色性下降,一定程度上使测试的灵敏度下降) 离子交换介质的影响 ①凝胶孔径对分离度的影响 大孔径的凝胶介质或实心球类介质对分离结果影响小 ②凝胶孔径对柱容量的影响 柱容量与介质的表面积成正比2离子交换柱长度的影响 离子交换柱的长短对分离影响不是很明显,一般选用短粗的层析柱,柱长容易造成分子筛效应,出现重叠现象,柱短有利于提高流速3缓冲溶液的影响①PH 影响:PH 值决定蛋白质带何种电荷,选择何种离子交换介质②缓冲容量的影响:缓冲容量的作用是保持溶液的PH 值稳定,若缓冲容量不能缓冲样品引起PH 值变化,溶液的PH 值发生漂移,导致解离度发生变化,从而影响溶液交换量③缓冲液浓度的影响:离子强度增加,离子与被分离物的亲和力增大,从而降低了被分离物质与离子交换介质的亲和力,会导致已结合上去的物质被洗脱下来④杂质的影响:样品中离子化合物受杂质反离子静电引力作用形成离子键,反离子与离子交换基团相互排斥,阻止样品与交换介质活性基团的活性作用4流速的影响:流速直接影响交换介质交换律,如果流速慢,溶液中的例子流过介质成需要的时间长,容易与介质发生交换作用,否则相反 1浓缩胶机理:在不连续系统中样品和浓缩胶缓冲液均使用pH6.8的Tris-HCl 系统,电极缓冲液使用Tris-Gly 系统,电泳开始后,在缓冲系统中HCl 全部解离成Cl -,在电场中迁移率快,为先导离子,甘氨酸解离度较小,仅0.1%到1%解离成Gly -,在电场中迁移很慢,为尾随离子,样品中蛋白质在此pH 下也带负电,一旦加上电压,这3种离子同时向正极方向移动,Cl-有效迁移率最大,走在前面,其后形成一个低电导区,Gly-由于解离度低,有效迁移率最小,蛋白质的有效迁移率介于2者之间,Cl-后面的低电导区有较高的点位梯度,使后面的蛋白质和尾随离子加速移动,当2种离子的迁移率与点位梯度的乘积相同时,他们的移动速度相同,在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个稳定的并向阳极移动的界面,由于蛋白质分子介于Gly-和Cl-之间泳动,使蛋白质在移动界面上逐步堆积成一个狭窄的中间层,从而达到样品浓缩的目的.2分离胶作用机理:当cl-蛋白质-Gly-的移动界面到达浓缩胶,分离胶界面是,由于分离胶pH8.9比浓缩胶ph 明显增大,导致Gly 大量解离,此时Gly-的有效迁移速率随之增大并超过蛋白质的有效迁移速率,很快就越过蛋白质紧随Cl-之后移动,蛋白质受阻大,移动速度较慢被留在后面,不在受离子界面的影响,被堆积的样品组分从凝胶不连续的界面开始在固定的电位梯度下进行电泳迁移,蛋白质在分离胶中受到电荷效应和分子筛效应作用,各个组分被分级分离样液体积的影响:与吸附剂结合能力强的样品队体积要求不很严格,但吸附弱的物质样品浓度要高,上样量一般不超过柱床体积最大吸附量的5%2.流速的影响:样品上柱的流速应尽量地慢,保证被结合物与配基之间有足够的时间达到吸附平衡 3.柱长的影响:若亲和介质的吸附容量高,可选择较短的柱子;弱亲和性很低,选择相对较长的柱子,保证待分离物与亲和介质有充分接触时间,使二者较好结合 4.温度的影响:亲和介质的吸附强度随温度升高而减小(4℃吸附,23℃洗脱) 条件:①化学反应条件,显色反应生成的有色溶液,有利于与单色光形成互补色,并且在所测定波长有较大的光吸收峰;显色反应生成的有色溶液理化性质稳定,显色条件易控制,重复性.对照性好,反应物和生成物的最大吸收波长之差要在60nm 以上.②参比溶液的选择,a.试剂参比,当样液的组分比较简单与其他组分共存对所测定波长无任何吸收,可选用溶剂为参比;b.试样参比,显色剂与其他试剂在所测定的波长有吸收,可按显色反应得到的条件,选用不加试样的容易为参比或不加显色剂的溶液为参比;c.平行操作的溶液参比,用不含被测组分的试样,在同样条件下与被测试样同样处理后作参比溶液.2影响因素:①温度的影响,室温时影响不大,低温时邻近分子间的能量交换减少,而使光吸收强度比室温高10%有些化合物可增至50%以上②PH 值影响,许多化合物具有酸性或碱性可解离基团,在不同PH 溶液中,有不同的解离度,其吸光值也不同.③溶液浓度的影响,待测溶液的浓度过高.低,会使溶液中的某些分子发生变化,引起解离.聚合或沉淀等反应,从而影响测定的精度④仪器狭缝宽度影响,狭缝质量不好,或太大,所截获的单色光波长的单一性差,杂波就会与测定波长一起进入待测样品,干扰测定,引起误差.⑤背景吸收的影响,待测样品中存在着一些杂质有较大光吸收,造成背景吸收,使待测物质的吸光值增加,或引起待测物质的吸收光谱相重叠.电场强度的影响:电场强度高,带电颗粒泳动速度快2溶液ph 值的影响:ph 值距离蛋白质等电点越远,蛋白质带电线越强,泳动速度越快3溶液离子强度的影响:溶液离子强度越大,电动电势越小,泳动速度越慢4电渗的影响:带电颗粒的表观泳动速度是颗粒本身的泳动速度与电渗作用使溶液携带颗粒移动5温度的影响:温度升高时,介质黏度下降,迁移率增加6介质影响:介质的交联度影响分离,纯度影响聚焦,非特异性吸附增大电渗分离胶缓冲系统的选择:确保样品中各组分在此pH 带有同性电荷2浓缩胶缓冲体系的选择:pH 应比选定的尾随离子的pKa 低2到3个pH 单位3先导离子的选择:应考虑它有很高迁移率,与样品分子有同性电荷,对样品组分没有破坏作用4尾随离子的选择:一般应用pKa 比分离胶缓冲系统高1个pH 单位的弱酸或氨基酸5反向离子的选择:应选用pKa 比分离胶低一个pH 的弱碱,常用的是tris 离子,作用使维持溶液的电中性及pH.6电极缓冲液的选择:可选用与反向离子pKa 相同的ph 缓冲系统浓缩,样品进入分离胶前浓缩成一条窄条带,样品可浓缩300多倍.b 蛋白质在分离胶中的分子筛效应和样品的电荷效应,使样品获得较好的分辨率,尤其为梯度胶时.c 能够分离比较复杂和一些特殊的样品2,4个不连续性:a 凝胶浓度的不连续性.B 缓冲液离子成分的不连续性-凝胶(tris-Hcl)电极(tris-gly) c 缓冲液ph 的不连续性-浓缩胶(6.8),分离胶(8.9)电极(8.3)样品(6.8) d 电位梯度的不连续性3.3种物理效应:样品的浓缩效应;凝胶的分子筛效应;电荷效应 溶液中SDS 单体的浓度:为保证SDS 与蛋白质充分结合,SDS 总量至少要比蛋白质的量高3倍以上2.样品缓冲液的离子强度:只有在较低的离子强度溶液中,SDS 单体才具有较高平衡浓度,才有利于结合到蛋白质 3.二硫键是否完全被还原:只有二硫键被彻底还原的情况下,蛋白质分子才能完全解聚,SDS 才能定量结合到蛋白质分子上去,并使之具有相同的构象,亚基分子量才能定量测出辐射信号或引起信号的变化所采用的分析方法,发射和散射等作用建立起来的光分析方法,被色散开的单色光按波长大小而依次排列的图案,特征是不连续的明暗相间的线条所组成的光谱,特征是数个光带与暗区相间组成的宽带光谱,系统以光形式释放多余能量并产生相对应波长,离子或原子等在辐射能的照射下,在系统内吸收外界能量的过程中,所对应吸收的波长产生光谱化很小,且发射的光谱是连续的-可见光波区190-800nm 的分子吸收光谱的分析方法,是某些有机化合物和生物大分子吸收光能后产生价电子和分子轨道上电子在能级上跃迁而形成的吸收光谱 ,在一定浓度和波长等条件下物质的光吸收值,K表示mol/L,光程厚度为1cm 时的消化系数,单位L/(mol.cm)(OD)或吸光值(A),表示溶液吸收光的强弱或吸收程度,该介质有选择的吸收某一波长的光使入射光强度减弱,一束单色光通过吸收介质的溶液,吸收介质吸收部分光能,引起单束光强度降低,吸收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低成正比表示,T=I/I 0,I 0为入射光强度,I为透射光强度,T 越大,溶液浓度越低,在紫外可见光波区有特殊吸收峰吸收峰,但与发色基因同存在于同一分子,能引起生色基因吸收峰发生位移和光吸收强度增加子对的基团,如-OH,-NH2等能使该化合物的最大吸收峰的波长向长波长的方向移动些取代基以后,如=C=O,能使该化合物的最大吸收峰向短波长方向移动强度迅速下降 ,用一种波长的光照射在某一荧光物质时,该物质被激发,若能在极短时间内发射出较激发波长更长的波长的光,在激发态停留的时间大约10-8~10-4S,次现象叫荧光现象,发射的光谱是荧光光谱(10-4~10S),系统内发射出比荧光波长更长波长的光,称磷光现象,发射光谱称磷光光谱池浓度太大引起的荧光变弱现象态下对该原子共振辐射进行元素测定的分析法 率的光而产生的吸收线,产生正误差的干扰该颗粒沉降系数,单位s,1S=10—13s,离心管与离心轴平行，运行时，离心管与离心轴垂直。