分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性
蔗糖代谢中蔗糖磷酸合成酶(SPS)的研究进展
Ａ Ｓ Ｒ Ｃ Ｓ ｃ ｓ ｐ ｏｐ ａ ｎ ａ （Ｐ ）ｓｎ ｏ ｄ ｎ ｌ ｔ ｒｗｈａｄｓｃ ｓ ｅ ｒ ｒ ｒ ｏ Ｂ Ｔ Ａ Ｔ ｕｒ ｅ ｈ ｓｈ ｔ ｓ ｔ ｓ Ｓ Ｓ ｉｉ ｌ ａ ｏ ｔ ｎ ｒ ｅ ｓｈ ｉ ｙ ｏ ｆ ｏ ｅｙ ｈ ｅ ｖ ｅ ｉｐ ｎ ｇ ｕ ｏ ｉｔ ｐ ｍａ ｆ ｍ
专题介绍
ＲＥＶⅡ Ｗ
蔗糖代谢 中蔗糖磷 酸合 成酶（Ｐ ） ｓ ｓ的研 究进展
刘凌霄 １ 沈法富 ， 卢合全 ， 韩庆点 刘云国
１ 山东农业大 学农学 院， 泰安，７０ ８２ ２ １１； 福建农 林大学作物科学 学院， 福州，５０２ ３ ３００； 山东农业大学 生命科学学 院， 安，７０８ 泰 ２ １１ ’ 通讯 作者，ｑｉ ｄｕ ｄ．１ ｙｌ ａ． ｕｅ ＠ｓ ｅ ｌ
０ ， Ｐ Ｓ Ｓ是 以 Ｕ Ｐ 为 供 体 ， 以 ６ Ｐ ＤＧ 一磷 酸 果 糖 ７％的糖来 自甘蔗） 茎中蔗糖的含量依赖与 Ｓ Ｓ的 Ｚ ｕ ｔ１ １９ ）尽管菜豆等 叶片在伸展期间， ． （一 Ｐ 为受体 的糖转移酶， Ｆ６ ） 一 合成 ６ 磷酸蔗糖。 一 ． ６ 磷 活力（ｈ ｅ ａ， ９ ７。 但 ｕ ｅ 等 酸蔗糖在 Ｓ Ｐ 磷酸蔗糖磷酸化酶） Ｐ（ 的作用下脱磷酸 蔗 糖磷酸合成酶活性 出现 周期性变 化 ， Ｈ ｂｒ
ＵＤＰ Ｇ＋ｆｕ ｔｓ － ｈ ｓ ｈ ｔ ￣ －｝ ｒ ｃｏ ｅ ６ ｐ ｏ ｐ ａｅ － －ＵＤＰ ｓ ｃ ｏ ｅ －－ － ＋ ｕ ｒ ｓ
一
谢 的调 节因子 ，可能通过影 响基 因表 达发挥 作用 （ ｎ ｄＳｅｎ １９） Ｊ ｇａ ｈｅ ， ９４。而 Ｓ Ｓ却在蔗 糖代谢 中起 ａ ｎ Ｐ 着重要 的作用 。
ｅ ｔｒｎ ａ ｈｍ ｅａ ｏ ｉ ａ ｗａ ｓｎ ｃ ｓａ ｉ ．ｎ ｔ ｉ ａｔ ｌ ｅｂ ｏｏ ｉａ ｎ ｔ ｎｏ Ｐ ， ｅ ｅｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｕ ｎ ｅｉｇｅ ｃ ｔｂ ｌ ｐ ｔ ｃ ｈ ｙ ｅ ｅ ｓｒｌ Ｉ ｓ ｒｉ ｅｔ ｉｌ ｇｃ ｌ ｕ ｃｉ ｆ Ｓ ｇ ｎ ｘ ｒ ｓｉｎｒ ｇ — ｙ ｈ ｃ ｈ ｆ ｏ Ｓ ｌｔ ｎ ａ ｄｅ ｏｕ ｉｎ ｇ ｎ ｌｎｎ ｄｒｐ ｅ ｅ ｔｔｏ ｆ ｅ ｅｉ ａ ｓｏ ｅ ｌ ｔ， ｄｔ ｅｐ ｏ ｅ ｓ ｓｏ ｅｒ— ａ ｉ ｖ ｌｔ ， ｅ ｅｃｏ ｉｇａ ｅ ｒ ｓｎ ｉｎ ｏ ｎ ｔ ｔｎ ｆ ｒ ｄｐａ ｓ ａ ｒ ｇ ｓｅ ｎ ｔ ｅ ｏ ｎ ｏ ｎ ａ ｇ ｃｒ ｍ ｎ ｎ ｈ ｒ ｈ ｓａ ｃ ｆ Ｐ ｒ ｔ ｄ ｃ ｄ ｅ ｒｈ ｏ Ｓｗｅｅｉ ｒ ｕ ｅ ． Ｓ ｎ ｏ
叶面肥对库尔勒香梨花芽分化过程中CN
叶面肥对库尔勒香梨花芽分化过程中C/N 及其代谢关键酶活性的影响吴先昂（塔里木大学园艺与林学学院，新疆阿拉尔843300）摘要：为了明确喷施叶面肥是否会对库尔勒香梨花芽代谢关键酶活性以及对花芽分化和花芽质量的影响，选择树体生长状况相对一致的30株主干形香梨进行喷施不同叶面肥试验。
结果表明：经过橙品精油和氨基酸叶面肥处理后的花芽相较于对照组均促进了蔗糖合成酶（SS ）、蔗糖磷酸合成酶（SPS ）、谷氨酰胺合成酶（GS ）、谷氨酸合成酶（GOGAT ）的酶活性，但2种处理之间的酶活性差异并不大。
硝酸还原酶（NR ）活性在5－8月之间一直呈上升趋势，8－9月活性稍有降低后，10月活性继续增加；经过氨基酸叶面肥处理的花芽硝酸还原酶（NR ）活性最高，橙品精油处理次之。
全碳含量先升高后降低，于7－8月份含量达到最高（58.254g/kg ），经过橙品精油和氨基酸叶面肥处理后的花芽全碳含量显著升高。
清水组中C/N 维持在1.9~2.5之间，但经过叶面肥处理后8月份最高C/N 为5.55，叶面肥的使用显著提高了花芽的C/N 比值，从而促进了花芽的分化。
综合分析，生产上喷施叶面肥（橙品精油和氨基酸叶面肥）能够提升代谢关键酶活性，提高花芽C/N 比值，促进库尔勒香梨花芽分化，提高花芽质量。
关键词：库尔勒香梨；叶面肥；花芽分化；酶活性；C/N花芽进行研究。
本研究以库尔勒香梨为材料，调查在清水、100mg/L 橙品精油（国光生产）、100mg/L 氨基酸叶面肥（国光生产）处理后，香梨花芽分化过程中花芽碳氮代谢关键酶活性变化规律，探讨其与花芽分化的相关关系，从而揭示使用叶面肥是否会提高花芽质量，为生产上通过使用叶面肥改善香梨产量和品质提供理论依据。
1材料与方法1.1材料1.1.1样本来源。
本试验在新疆阿拉尔市九团梨园（81°09′E ；40°60′N ）处进行，选择4年生以野杜梨籽育苗作砧木且树体生长状况相对一致的30株库尔勒香梨作为采样株，树体为主干形，选树冠西侧外围中部短果枝上的芽编号挂牌。
蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定
实验四蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定参考一、实验意义和目的 (2)二、实验原理 (2)三、材料、设备与试剂 (3)四、实验步骤 (3)1.蔗糖合成酶活性测定实验 (3)2.转化酶活性测定 (4)五、实验结果与分析 (4)1.蔗糖合成酶活性测定.................................................................... 错误!未定义书签。
2.转化酶活性测定............................................................................ 错误!未定义书签。
六、误差分析........................................................................................... 错误!未定义书签。
一、实验意义和目的蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质，其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响。
蔗糖合成酶(SuSy)是植物进行蔗糖代谢的关键酶之一,与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关，在植物的生长发育和代谢活动中具有重要作用。
转化酶也是催化蔗糖降解的重要酶类，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，还是控制淀粉合成的关键酶，测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。
通过本实验要掌握三种酶的作用、酶活力测定的原理和方法、学习酶活力的计算方法，了解糖类水解。
二、实验原理1.蔗糖合成酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+UDP 果糖+UDPG。
2.转化酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+H2O—►葡萄糖+果糖。
根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶分为两种：一种称为酸性转化酶，主要分布在液泡和细胞壁中，另一类转化酶称为碱性或中性转化酶，主要分布在细胞质中。
蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)试剂盒说明书
货号：QS2505 规格：50管/24样蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）试剂盒说明书分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：蔗糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的贮存形式之一。
SPS（EC 2.4.1.14）以果糖-6-磷酸为受体，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。
一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径。
测定原理：蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水试剂的组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体4mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存；试剂四：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存；样品测定的准备：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
每个测定管需要设一个对照管。
SPS活力单位的计算：第1页，共2页1、按照蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SPS活性(μg /min/mg prot)= C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷Cpr2、按照样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC4310规格:50T/24S产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体8mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。
临用前加入2.5mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
标准品：粉剂×1支，20mg果糖；4℃保存。
临用前加入1mL蒸馏水溶解，配成20mg/mL果糖溶液备用。
4℃保存一周。
产品简介：蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖，参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。
分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5-二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：一、粗酶液提取：组织：按照质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1mg/mL的标准溶液备用。
3、操作表：(在1.5mL离心管中操作)试剂名称（µL）对照管测定管标准管空白管样本2020--标准溶液--20-蒸馏水---20试剂一808080试剂二-80--混匀，30℃水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，防止水分散失）。
南丰蜜橘果实蔗糖代谢相关酶提取测定实验方案
蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性测定蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。
蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化其合成的两种酶。
这两种酶在生物体内的功能有所不同。
蔗糖合成酶（SS）以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体。
后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。
一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。
UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。
蔗糖的合成（二条途径）：1、蔗糖合成酶（非光合组织）UDPG+果糖→蔗糖+UDP2、磷酸蔗糖合成酶（光合组织）UDPG+F-6-P→磷酸蔗糖+UDP磷酸蔗糖+H2O→蔗糖+Pi一、仪器设备1、冷冻离心机2、恒温水浴3、分光光度计4、研钵一套5、磁力搅拌器6、天平（感量0.01mg）7、移液管：0.1ml、0.5ml、1ml、5ml各一支8、试管：10ml具塞试管10支9、5ml两瓶：一个10、冰箱二、试剂1、提取缓冲液(200mmol/L hepes-NoaH缓冲液，含5mmol/LMgCl2，0.1%DTT，0.05%Triton-X100，0.05%(W/V)BSA，2%PVP，1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，10mmol/L抗坏血酸钠，10mmol/L半胱氨酸-盐酸和2%甘油，pH=7.5)2、透析缓冲液(20 mmol/LHepes-NaOH，内含0.25 mmol/LMgCl2, 1 mmol/LEDTA, 1 mmol/LEGTA, 0.01%DTT, 0.05% BSA, 0.2%甘油, pH7.5)3、转化酶提取液(200mmol/L磷酸钾缓冲液，5mmol/LMgC12，0.1%B-疏基乙醇，0.05%Triton-X100，0.05%BSA，2%PVP，pH=7.5)4、转化酶透析液(20mmol/L磷酸钾缓冲液，0.25mmol/LMgC12，0.01%B-琉基乙醇，0.05%BSA，PH=7.5)5、SS合成方向酶反应液：hepes-NaOH缓冲液 (PH=8.5)，5mmol/LDTT，5mmol/LNaF，100mmol/L 果糖，15mmol/LUDPG6、SS分解方向酶反应液：80mmol/LMes缓冲液(P H =5.5)，5mmol/LNaF，100mmol/L蔗糖，5mmol/LUDP7、SPS酶反应液：50mmol/Lhepes-NooH缓冲液(PH=7.5)，15mmol/LMgC12，1mmol/LEDTA，5mmol/LNaF，16mmol/LUDPG，4mmol/LF-6-P，20mmol/LG-6-P8、0.1%间苯二酚：称取0.1g间苯二酚溶解并定溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。
菜用大豆籽粒发育过程中蔗糖积累及相关酶活性的研究
菜用大豆籽粒发育过程中蔗糖积累及相关酶活性的研究张古文;胡齐赞;徐盛春;龚亚明【摘要】选用蔗糖含量差异显著的菜用大豆品种——‘浙农6号'(蔗糖含量高)、‘辽鲜1号’(蔗糖含量中等)和‘夏丰2008’(蔗糖含量低),对三者籽粒发育过程中蔗糖、可溶性总糖含量以及蔗糖合成酶(SS)、酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)等蔗糖代谢相关酶活性进行了比较,并对蔗糖积累与酶活性的关系进行了分析.结果表明,菜用大豆籽粒干、鲜重积累均呈单“S”型曲线,三个品种的蔗糖代谢规律基本相似,整个菜用大豆籽粒发育过程中,蔗糖是可溶性总糖的主要成分,约占其总含量的70％.蔗糖代谢相关酶的净活性是影响蔗糖积累的主要因子,在籽粒发育早期,蔗糖代谢相关酶的净活性为负值,蔗糖以分解为主,此时蔗糖合成酶和酸性转化酶是催化其分解的关键酶；籽粒发育中期,蔗糖代谢相关酶的净活性转为正值,蔗糖代谢转为合成为主,蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶是催化其合成的关键酶；进入籽粒发育后期,蔗糖代谢相关酶的净活性仍为正值,但接近于零,表明蔗糖的合成与分解速率基本相当,此时蔗糖合成酶、酸性转化酶、中性转化酶和蔗糖磷酸合成酶在蔗糖代谢中起主导作用.%Three cultivars, Zhenong No. 6 (high sucrose content) , Liaoxian No. 1 (middle sucrose content) andXiafeng2008 (low sucrose content) were used to investigate the sucrose accumulation and enzyme activities involved in its metabolism in developing seeds of vegetable soybean. The results showed that the growth curves of vegetable soybean seeds showed single sigmoid pattern. The change trends of sucrose metabolism among three cultivars were similar. During the whole periods of vegetable soybean seeds development, sucrose was the major component of soluble sugar, takingabout 70% of total soluble sugar contents. The net activities of sucrose-metabolizing enzymes were the major factor affecting sucrose accumulation. During the early stage of seed development, net activities of sucrose-metabolizing enzymes were negative value. Sucrose metabolism is in the decomposition direction, when sucrose nvn-thase and acid invertase were key enzymes in sucrose decomposition. However, the net activities of sucrose-metabolizing enzymes turned to positive value in the middle stage of seed development. Sucrose metabolism was in the synthesis direction, when sucrose synthase and sucrose phosphate synthase were key enzymes in sucrose synthesis. Dur- ing the late stage of seed development, also the net activities of sucrose-metabolizing enzymes were positive value, but its value was close to zero, showing that the rate of sucrose decomposition and synthesis was similar and sucrose synthase, sucrose phosphate synthase, acid invertase and neutral invertase played a leading role in sucrose metabolism in this stage.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2012(024)006【总页数】6页(P1015-1020)【关键词】菜用大豆;籽粒发育;蔗糖代谢;酶活性【作者】张古文;胡齐赞;徐盛春;龚亚明【作者单位】浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021;浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021;浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021;浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021【正文语种】中文【中图分类】S643.7菜用大豆俗称毛豆，是指在豆荚鼓粒饱满、荚色翠绿、籽粒还没有完全成熟时采收做蔬菜食用的大豆总称［1］。
蔗糖合成酶的测定方法[方案]
![蔗糖合成酶的测定方法[方案]](https://img.taocdn.com/s3/m/a87931ec6529647d272852dc.png)
蔗糖合成酶的测定方法[方案]蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L，pH7.5)缓冲液，包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;20.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。
30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。
2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI， 220μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖)， 30?中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80?水浴保温10min，冷却后置于480nm 处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。
同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。
3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。
4、计算,1,1样品中酶活性(μg?g?h)=式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg);V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制;标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol?L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。
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蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。
蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。
对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。
【实验原理】
蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。
UDPG+果糖---蔗糖+UDP
这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。
该酶在分解方向的Km值相对较高
（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。
蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。
蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：
UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+
6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。
实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。
酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。
一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。
果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。
蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。
【实验材料】
植物茎
【仪器设备及设备】
冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），
0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱
【试剂药品】
1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl
2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。
2.透析缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含
2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。
3.酶反应液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果
糖,2mmol/LEDTA-Na2, 5mmol/L 醋酸镁，5mmol/LDTT。
4.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随用。
5.2mol/LNaOH
6.30%HCl
7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。
8.1mg/ml蔗糖标准液
【方法步骤】
1.酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。
2.蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。
3.蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2mol/LnaOH 0.1ml,沸水浴10min后，冷却至室温。
加30%HCl3.5ml,0.1%间苯二酚1ml，摇匀后于80度保温10min,冷却后480nm处比色，测定蔗糖生成的量。
4.蔗糖磷酸合成酶反应：在酶反应液中用10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法测定。
5.标准曲线制作：取7支10ml具塞试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。
以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。
试剂
管号
1 2 3 4 5 6 7
1mg/ml蔗糖标准液（ml）0 0
.1
.2
.4
.6
.8
1
.0
蒸馏水（ml）1
.0
.9
.8
.6
.4
.2
蔗糖含量（mg）0 0
.1
.2
.4
.6
.8
1
.0
A480
6.结果计算：蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖/(g*FW*L)
酶活力（mg蔗糖/(g*FW*L)）=C*Vt*n/(FW*t*Vs)
式中：C是从标准曲线查得的蔗糖量（mg）；FW是样品鲜重（g）;t是反应时间（h）；Vt是提取酶液总体积（ml）；Vs是测定时取用酶液体积（ml）；n是提取液测定中的稀释倍数。
【注意事项】透析袋不可装满，以防止吸水涨破。
蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。
蔗糖合成酶（SS）、（SPS）是植物体内催化其合成的两种酶。
这两种酶在生物体内的功能有所不同。
蔗糖合成酶（SS）以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体。
后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。
一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。
UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。
蔗糖的合成（二条途径）：
1、蔗糖合成酶（非光合组织）
UDPG+果糖→蔗糖+UDP
2、磷酸蔗糖合成酶（光合组织）
UDPG+F-6-P→磷酸蔗糖+UDP
磷酸蔗糖+H2O→蔗糖+Pi
一、仪器设备
冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计
二、试剂
HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；
2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；
0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。
30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖
三、操作方法
1、粗酶液制备
称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。
2、酶活性测定
依次加入 50μL粗酶液，
50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，
20μL 50 mmol/LMgCI2，
20μL 100mmol/L UDPG，
20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1%间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活
性为空白比色测定蔗糖含量。
同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。
3、蔗糖标线制作：
取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。
4、计算
样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=
式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；
V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；。