琼脂稀释法操作步骤课件
琼脂稀释法操作步骤ppt课件
22
质控菌株
质控菌株
药敏
金黄色葡萄球菌
ATCC29213
+
大肠埃希菌
ATCC25922
+
大肠埃希菌
ATCC35218
+
肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌
ATCC700603
+
ATCC27853
+
其他
产β内酰胺酶 产超广谱β内酰胺酶
23
质控菌株
质控菌株
肺炎链球菌 粪肠球菌
流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌
ATCC49619 ATCC29212 ATCC49766 ATCC49247
淋病柰瑟球菌：
厌氧菌
ATCC49226 ATCC25285
药敏
+ + + + +
其他
检测胸腺嘧啶 氨苄西林敏感株 产β内酰胺酶(-) 氨苄西林耐药株
24
常见问题及解决指南
抗菌药 氨基糖苷类 喹诺酮类 多种药物
3
抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,
稀释液需要量见下列公式：
抗菌药物实际称量*效价
稀释液体积= 保存液浓度（1920ug/ml）
4
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用量
多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每 次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药 物名称,浓度,体积数及配制日期,置与≤20℃保存,备用。
现象 MIC太高 MIC太低 跳管
可能原因
解决办法
培养基PH太低 培养基PH太高
PH范围7.2-7.4。避 免CO2孵育降低PH
琼脂稀释法操作步骤
琼脂稀释法利用了琼脂培养基的固化特性，使得抗菌药物能够在培养基中均匀分布并保持相对稳定的浓度。当 接种了待测微生物后，微生物在含有不同药物浓度的琼脂平板上生长，通过比较不同平板上的菌落生长情况， 可以确定药物的最低抑菌浓度。
应用领域及意义
临床医学
用于指导临床用药，协助医生选择合 适的抗菌药物和剂量，提高治疗效果 。
02
实验准备
试剂与仪器
试剂
琼脂粉、培养基、抗生素标准品、无菌水等。
仪器
电子天平、pH计、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、移液器、无菌吸管、无菌平 皿等。
实验前准备事项
实验室环境准备
确保实验室干净整洁，定期进行消毒处理。 实验前开启紫外灯照射30分钟，确保无菌操 作环境。
试剂与仪器准备
检查所需试剂是否齐全，有无过期或污染现 象。对实验所需仪器进行清洗和烘干，确保 无菌状态。
用计数板或显微镜对菌落进行计数，记录每 个培养皿中的菌落数。
根据菌落计数结果计算菌液浓度，以CFU/ml 表示。同时记录实验过程中的操作细节和观 察结果，以便后续分析和比较。
04
结果分析与解读
菌落计数方法
平板菌落计数法
将待测样品经过适当稀释后，涂布在琼脂平板上，培养一定 时间后形成可见的菌落，通过计数菌落数量来推算样品中的 微生物数量。
药学研究
用于评价新药的抗菌活性，为药物研 发提供实验依据。
应用领域及意义
• 微生物学研究：用于研究微生物对抗菌药物的敏感性及其 耐药机制。
应用领域及意义
意义
可用于监测微生物的耐药性变迁，为临床抗感染治疗提 供重要参考。
提供了定量的药物敏感性试验方法，有助于准确评价抗 菌药物的疗效。
有助于指导临床合理用药，减少抗菌药物的滥用和误用， 降低医疗成本。
琼脂稀释法操作步骤
需氧菌
苛氧菌
MH肉汤或琼脂
嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158
链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血
卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血
淋球菌：CC Agar Base+L53
厌氧菌 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/ 点 点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板
药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静臵至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒臵，于 35℃孵育16-20小时 如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果 万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果 淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果
琼脂稀释法药敏平板的制备4
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照 所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉 眼可见的水珠(可在35℃孵箱内倒臵平板 开盖烘干15-20分钟)
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平板, 则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻璃 试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
琼脂稀释法操作步骤
抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成
15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml
如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10 ml 抗菌药物的效价
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药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于 35℃孵育16-20小时
如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果
万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果
用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置 上多点接种器的点种板位置上
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测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/ 点
点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板
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培养基
需氧菌 苛氧菌
厌氧菌
MH肉汤或琼脂 嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血 卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血 淋球菌：CC Agar Base+L53 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度MIC
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)|琼脂稀释法琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
稀释琼脂法MIC
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)2008-01-27 22:27:10 相关论文相关书籍Tags：微生物学琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
琼脂的溶解方法
琼脂的溶解方法
琼脂是一种常用的实验室试剂，它在生物学、生物化学、分子生物学
等领域中被广泛使用。
在实验中，我们经常需要将琼脂溶解成液态状态，以便于后续操作。
下面是一种简单易行的琼脂溶解方法。
材料：
1. 琼脂粉
2. 烧杯或容量瓶
3. 蒸馏水或去离子水
步骤：
1. 准备一个干净的烧杯或容量瓶。
2. 根据需要加入适量的琼脂粉。
通常情况下，每100ml液体中加入0.5-1g的琼脂粉即可。
3. 加入足够的蒸馏水或去离子水，搅拌均匀。
注意不要加入过多的水，否则会导致溶液过于稀释。
4. 将混合物加热至沸点，并持续搅拌直到琼脂完全溶解为止。
注意不
要让溶液沸腾过度，以免出现气泡和泡沫。
5. 将溶液倒入需要使用的容器中，并放置冷却至室温。
在冷却过程中，溶液会逐渐凝固成为琼脂凝胶。
注意事项：
1. 在制备琼脂溶液时，一定要使用干净的烧杯或容量瓶，并尽可能避免异物的污染。
2. 加入水时，最好使用蒸馏水或去离子水，以免影响实验结果。
3. 加热过程中要持续搅拌，以免出现结块和沉淀。
4. 在倒入容器之前，要等待溶液冷却至室温，以免出现变形和气泡。
总之，以上是一种简单易行的琼脂溶解方法。
在实验中使用时，请根据具体情况进行调整，并严格按照操作规程进行操作。
琼脂稀释法测抑菌率试验
琼脂稀释法测抑菌率一、试验原理目的在琼脂培养基中加入不同浓度的抑菌剂，配置成抑菌剂培养基，凝固后涂抹一定数量的菌悬液，根据增长情况计算出抑菌率。
最好在已知抑菌剂MIC的前体下做本试验减少无效操作。
二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、涂布棒、量杯、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验准备1、培养基的配置及工器具的灭菌称取营养琼脂培养基42g，蒸馏水900ml。
加热至澄清后，用量杯量取19ml 加入到大试管中，盖好塞子，同PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、抑菌剂的配置抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解，而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性，采用甲醇，缓冲液，NaOH 溶液，DMSO溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后，作为抗菌药原液。
3.、菌悬液的配置从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第四支试管（即浓度约为103CFU/mL左右的菌悬液）待用。
四、试验步骤1、吸取2ml配置好的各稀释度抑菌剂加入到培养皿中，倒入冷却后试管中的培养基后迅速摇匀，（顺时针三圈逆时针三圈），待凝固。
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抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,
稀释液需要量见下列公式：
抗菌药物实际称量*效价
稀释液体积= 保存液浓度（1920ug/ml）
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菌液准备4
如一次实验需完成50株或100株细菌,则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号
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菌液准备1
生长法： 无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落
顶部后接种于4-5mlMH肉汤内 35℃ 培养4-6小时到对数生长期，亦可过
夜培养,但不允许超过18小时 用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1-
2X108CFU/ml
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菌液准备2
直接菌落悬浮法： 从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用
无菌环取单个菌落 接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS
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菌液准备3
对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直接 菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液, 应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10稀释, 此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调整好 的菌液应该在制备后的15分钟内完成点种
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抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成
15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml
如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10 ml 抗菌药物的效价
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原理：
将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128ｕ g/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06ｕ g/ml对倍稀释的浓度系列
多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养
肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)
琼脂稀释法药敏平板的制备 1
配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、 厌氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到4850℃，浇制药物平板。
取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平 板底部作好“点种标记”、“药物名称”、 “药物浓度”,浓度从0.06ｕg/ml……128 ｕg/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用量
多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每 次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药 物名称,浓度,体积数及配制日期,置与≤20℃保存,备用。
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培养基
需氧菌 苛氧菌
移液管内剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml标记 的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml
依次类推,直至最后一个0.06ｕg/ml标记的平皿 内加入1ml,则抗菌药物稀释完成
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琼脂稀释法药敏平板的制备4
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照
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琼脂稀释法药敏平板的制备2
取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支 试管标记为： 960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.87 5,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用无 菌移液管加无菌稀释液1.5ml
所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉眼 可见的水珠(可在35℃孵箱内倒置平板开 盖烘干15-仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平 板,则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻 璃试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
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测试菌液的点种1
预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干 （52孔、100孔、或21孔）
将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作好 与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入 菌液270ｕl。每批试验均须保留有质控菌位置和 无菌菌液位置
厌氧菌
MH肉汤或琼脂
嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血
卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血
淋球菌：CC Agar Base+L53
Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
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琼脂稀释法药敏平板的制备3
将保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml浓度的 抗菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取 2.5ml加入到128ｕg/ml标记的平板内1ml
移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内, 混匀后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml标记的平 板内1ml