如何建立HPLC法测定有关物质的方法

药品研究及生产过程中有关物 质的控制方法和要求
上海药检所化学室 谢沐风
1
• 有关物质的来源
@ 原料药合成过程中带入; @ 制剂过程中产生; @ 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。
• 控制的必要性
2
有关物质的测定方法
仪器角度：
@ 高效液相色谱法（HPLC法）、 @ 薄层色谱法（TLC法）、 @ 紫外分光光度法（UV法）、 @ 气相色谱法（GC法）、 @ 毛细管电泳色谱法（CE）等
时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料 或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各 杂质均可与被分析物分离。
配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂 质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验 用溶液，来确证色谱条件的适用性。
5
专属性试验验证图谱
6
2 . 检测波长的确定
涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同， 即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） @ 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 @ 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 @ 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应 必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。 @ 目前国外有关该项研究的进展
试验角度：
@ 对照品法 @ 自身（稀释）对照法 @ 归一化法
3
有关物质的计算方法
@ 杂质对照品法 @ 加响应因子（即重量校正因子）计算
的自身对照法、 @ 不加响应因子计算的自身对照法 @ 根据不同杂质采用不同方法等。
* 有关物质的计算方法
定量检测和限度检测
4
高效液相色谱法（HPLC法）
1 .色谱条件的确定（即专属性试验） 专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在
9
3. 供试品溶液浓度的确定 • 举例说明：进样量为20μl，主成分的最低检出量
为1μg/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%， 此时供试品溶液的浓度可设定为 1mg/ml ~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成 分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。 • 拖尾情况也可通过流速进行适当调节
7
3. 供试品溶液浓度的确定 （灵敏度试验——最低检出量的测定）
• 供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定 是依据最低检出量和最大进样量来进行的。
• 最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义 确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓 度的多少而言。
其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。
• 最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被 分析物不拖尾的浓度为准。
同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中， 为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。
15
7. 保留时间的设定 经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的
保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏 试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为 止。
16
8. 强力破坏试验
水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在
8
3. 供试品溶液浓度的确定 • 设定杂质总量不得过%，最低检出量通常需达
到对照溶液浓度的1/10~1/50（即相当于供试品溶 液浓度的0.1%~0.02%）。也就是说供试品溶液 的浓度至少是最低检出量的1000倍~ 20000 倍， 又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐 受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾 的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上 再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。
90℃放置24小时。 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，
在90℃放置24小时。 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在
90℃放置24小时。 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温
下破坏至外观性状改变 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
10
3. 供试品溶液浓度的确定
浓 度 进样量 绝对值 相对于样品测定浓度的
最大进样量 50mg/ml 以上 20μl
供试品溶液 5mg/ml
20μl 100μg 100%（5000 倍）
对照溶液
50μg/ml 20μl 1μg
1%
最低检出量 1μg/ml
20μl 20ng
0.02%
11
4. 加样回收试验（即准确性试验） 准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的
方式来评价。准确称量各杂质，将含有1% (w/w) 浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用 的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该 原理同前面所述的专属性研究是一致的。
12
5. 流速、柱温与溶剂的选择
在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显 著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
17
9. 定量检测 如有关物质的检查为定量检测，即为杂质对
照品法，在上述项目的各项研究后，需增加线性 试验以及一些必要的方法论证项目。
溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来 衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对 照溶液的主成分峰面积精密度良好。
13
6. 积分参数的设定
积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、 峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。
采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同 一斜率、峰宽下进行积分计算。
这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接 导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是 基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂 质峰面积增加，易判断为不合格；如设定的太大，又 将反应不出杂质的存在情况。
14
6. 最小峰面积的设定
其设定，不是绝对值，而是相对值。
英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC 法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰 面积。普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样 品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%， 对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定 为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的 最小峰面积。