杀虫放线菌的诱变育种
诱变
一、诱变育种的工作流程诱变育种的工作流程：出发菌种（沙土管或冷冻管）®斜面（或肉汤培养24小时）®单孢子悬液（或细菌悬液）®诱变处理（处理前后的孢子液或细菌悬液活菌计数）®涂布平板®挑取单菌落传种斜面®摇瓶初筛®挑出高产斜面®留种保藏菌种®传种斜面®摇瓶复筛®挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察®放大试验罐中试考察®大型投产实验。
整个流程按诱变过程和筛选过程两部分说明如下：（一）诱变过程由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液（或细菌悬浮液）作诱变处理，然后以一定稀释度涂布平板，至平板上长出单菌落为止的各步骤为诱变过程。
简述如下：（1）菌种的斜面出发菌种的斜面非常重要，其培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件。
要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢子数量适中。
（2）单孢子悬浮液制备（见第一节）（3）孢子计数诱变处理前后的孢子悬液要孢子计数，以控制孢子悬液的孢子数和统计诱变致死率，常用于诱变处理的孢子悬液浓度为105~108个孢子/毫升。
孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数。
诱变致死率采用平板活菌计数来测定。
（4）单菌落分离平皿内倾入20毫升左右的培养基，凝固后，加入一定量经诱变处理的孢子液（以控制每一平皿生长10~50个菌落为合适的量），用刮棒涂布均匀后进行培养。
（二）筛选过程诱变处理的孢子，经单菌落分离长出单菌落后，随机挑选单菌落进行生产能力测定。
每一被挑选的单菌落传种斜面后，在模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其生产能力。
筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。
（1）传种斜面主要挑选生长良好的正常形态的菌落传种斜面，并可适当挑选少数形态或色素有变异的菌落。
经诱变处理，形态严重变异的往往为低产菌株。
（2）留种保藏菌种经筛选挑出的比对照生产能力高10%以上的菌株，要制成沙土管或冷冻管留种保藏。
微生物诱变育种的基本过程
微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。
这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。
二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。
诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。
化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。
这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。
三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。
为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。
这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。
同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。
四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。
遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。
这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。
五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。
生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。
这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。
菌种诱变方法
微生物诱变育种的方法摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。
关键词:诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。
微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。
作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。
目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。
1 物理诱变1.1紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。
紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。
二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。
马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。
顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。
紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。
1.2电离辐射γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。
其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。
诱变育种方案
概念：选用理、化致变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促使其突变率显著提高； 采用简便、快速和高效的筛选法筛选出少数符合育种目的的突变株来供生产实践与 研究应用。 诱变育种就是以人工手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，进而从变异 体中选育出产量高、性状优的适合工业化变育种 40年代初，Beadle和Tatum“一个基因一种酶”学说的提出，意味着 遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术的发展。如抗生素 工业的兴起。 诱变育种 是发酵工业育种的重要手段和技术，目前几乎所有工业生产菌种都经 过诱变处理。 诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传结构和功能，从中筛选 出产量高、性状优良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其 在最适的工艺条件下最有效地合成产物。
什么是诱变育种？
什么是诱变育种？
导读：诱变育种能大幅度地增加菌种的变异量，从而人们能从诱变后的群体中筛选优良菌株。
诱变育种常采用物理、化学等诱变剂来动摇菌种的遗传性，直接或间接地作用于核酸物质，能强烈地引起菌种的变异。
诱变育种的诱变剂很多，常用的有紫外线、X光线、Y射线及硫酸二乙醋(DFS)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、氮芥(Nm)、N广甲基N亚硝基胍(NTG)等。
诱变育种方法有三个步骤：
一是准备孢子悬浮液，将新鲜的食用菌无菌孢子移入5毫升无菌生理盐水或磷酸缓冲液中，摇匀后即成孢子悬浮液。
孢子悬浮液的浓度以每毫升含孢子106～109个为宜。
二是诱变处理，用诱变剂处理如紫外线处理，诱变处理应在暗箱内进行，箱内装15瓦紫外灯1支，悬挂于30厘米高处，诱变处理时应先开灯20分钟，使波长稳定，然后将悬浮液倒入直径为6厘米的无菌培养皿中，打开皿盖，照射0.5～1分钟。
照射后的孢子悬浮液每毫升所含的活抱子数约在105～108个。
因此要得到单个菌落，必需先用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释1000～10万倍。
然后取释释液0.2毫升涂布于装有琼脂培养基的培养皿上，在25℃下培养5～10天，这时就能在每个平板上得到数十个单菌落。
选纯正、健壮
的单个菌落移入斜面试管内，供进一步测定筛选。
三是挑菌筛选，诱变处理只是扩大了它的变异范围，并不能决定变异的方向，所以诱变最大的困难是筛选，只有在大量的、各种各样的变异中，才能筛选到符合需要的变异个体。
这样就需将诱变后的孢子经培养长出菌落后及时挑菌，选发育健全的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待外面长好后，再分别接入2～4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生产性能，择优留取。
微生物习题(题库)
微生物学习题库绪论1．什么是微生物？它包括那些类群？2．试述微生物与当代人类实践的重要关系。
3．微生物有哪五大共性，其中最基本的是哪一个？为什么？4．试分析微生物五大共性对人类的利弊。
5．试述微生物的多样性。
6．什么是微生物学？学习微生物学的任务是什么？第一章原核生物的形态、构造和功能1．测量微生物大小主要用几种单位？2．观察细菌形态时为何要用染色法？常用的染色法有几类？3．什么是革兰氏染色法？它的主要步骤是什么？哪一步是关键？为什么？4．试述革兰氏染色的机制及其重要意义。
5．试绘出细菌细胞构造的模式图，注明其一般构造和特殊构造，并扼要注明各部分的生理功能。
6．图示革兰氏阳性细菌和阴性细菌细胞壁构造，并简要说明其特点及成分。
7．什么是原生质体、球状体、L型细菌？试比较它们的异同？8．什么叫肽聚糖，其化学结构如何？革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的肽聚糖结构有何不同？9．什么叫溶菌酶？它的作用方式如何？10．什么叫磷壁酸？其构造和功能是怎样的？11．革兰氏阴性细菌细胞壁外层的脂多糖（LPS）是由哪些成分组成的？哪几种成分最为独特？脂多糖的功能是什么？12．什么是荚膜，其化学成分如何？有何生理功能？13．如何证实某一细菌存在着鞭毛？如何知道某一细菌运动能力的强弱？14．细菌鞭毛着生的方式有几类？试各举一例。
15．试列表比较细菌的鞭毛、菌毛和性菌毛的异同。
16．什么是芽孢，其结构如何？为何它具有极强的抗逆性，尤其是抗热性（根据“渗透调节皮层膨胀学说”加以分析）。
17．什么是伴孢晶体，它在何种细菌中产生，有何实践意义？18．什么叫菌落，细菌的菌落有何特点？试分析细菌的细胞形态与菌落形态间的相关性。
19．什么是放线菌？放线菌虽呈菌丝状生长，但为何目前都认为它不接近霉菌，而更接近于细菌？20．什么叫基内菌丝、气生菌丝和孢子丝？它们间有何联系？21．放线菌的菌落有何特点？试从细胞水平来分析其原因。
22．什么叫支原体，它有何特点，哪些特点是由于缺乏细胞壁引起的？什么叫类支原体？23．什么是立克次氏体、类立克次氏体？它们对人类的关系如何？24．什么是衣原体？为何不能称它为“大型病毒”？25．比较说明六大类原核生物的主要特性。
微生物育种――诱变育种
微生物育种――诱变育种微生物育种――诱变育种摘要分析了近几年国内外对微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物机理进行总结。
从物理诱变、化学诱变方面的诱变效应和作用机制及育种在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素及杀虫剂等高产菌种选育中的应用；对该技术与空间技术的结合在微生物菌种选育中的应用前景进行了分析。
关键词诱变微生物育种展望诱变育种是通过诱变剂的处理提高菌种突变的几率，从中筛选出具有优良特性的变异菌株，也是通过诱发基因突变为手段的微生物育种技术。
1927年发现X射线具有增加突变率的效应；1944年发现氮芥子气的诱变效应；其后，人们陆续发现了许多物理的和化学诱变因素。
诱变育种其操作简便，突变率高，突变谱也广，不仅提高产量，改良质量还可以扩大产品的品种和简化工艺条件，随着新的诱变因子不断发现和筛选体系进一步的完善，微生物的诱变育种有了开展。
一、诱变方法物理诱变1、紫外照射：是诱发微生物突变的常用的非常有用的物理诱变方法之一，紫外辐射的作用有许多解释，比拟确定的作用是能够使DNA 分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基也碱基之间正常配对。
2、电离辐射：是电离生物学上有高能量的产生电离作用，应用最广泛的电离射线之一，可直接或间接的变化DNA 结构。
直接效应可以氧化脱氧核糖的碱基，间接效应是使水或有机分子产生自由基。
3、激光：是一种光量子流，能量密度高、靶点小而且单色性与方向性都好的光微粒。
这种辐射通过产生光、热等效应的综合应用，直接、间接影响有机体，从而引起细胞染色体畸变效应和酶的激活与钝化。
4、微波：是一种有较强生物效应的低能电磁辐射，对生物体有热效应或非热效应。
热效应指它能引起生物体局部温度上升，非热效应是在其作用下，生物体产生非温度关系的各种反响。
所以，微波也被用作多个领域的诱变育种。
化学诱变1、烷化剂：诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，引起DNA 复制碱基配对的转换而遗传变异。
常用的烷化剂都有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍或硫酸二乙酯等。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--诱变育种的一般步骤：1.首先是天然菌种的选育：调查研究及查阅充分的资料↓设计实验方案↓确定采集样品的生态环境采样↓确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离↓原种斜面↓确定发酵培养基础条件筛选↓初筛（1株1瓶）↓复筛（1株3～5瓶）↓结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）↓3～5株↓单株纯种分离生产性能试验→毒性试验菌种鉴定2.诱变菌种：出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。
诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。
在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。
2)挑选优良的出发菌株。
最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。
4)处理单细胞或孢子悬液。
单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。
5)选用合适的诱变剂量。
一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。
6)选用高效的筛选方法。
紫外线诱变育种：紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。
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下， 照射 １ 、ＯＳ３ ， 离为 ３ ｍ， 用 磁力 ０ｓ ２ 、０Ｓ 距 ０ｃ 并 搅 拌器进 行搅拌 。在 暗室红 灯下 ， 释 涂皿 。 稀
１ ６ 效 价 测 定 ．
由于菜青虫 的来 源和数 量要受 到季 节和 其它 客 观条 件的 限制 ， 使用 很不 方便 。因此 ， 在这 里我
价 测定过 程 中 ， 我们 在 每个 平 皿 中放 ２片人 工 饲 料 或 １ 桑 叶 ， 投放 ５条 ３龄幼 蚕 ， 将发 酵液 片 并 再 作适 当稀 释后 ， 然后 从 高 到低 稀 释 度用 喉 头 喷 雾
器喷 ４ —５下 。２ 、８ｈ 观察 杀虫效 果 。 ４ｈ ４ ，
挑取单孢 子菌落一２ ８℃往复震荡 培养 ４ 一效 —５ｄ 价测定一选 出 ６ 株作为第二 次诱 变的 出发菌株 。
１ ２ １ 面和 平板培 养基 （ ．． 斜 高氏一 号） 可 溶性 淀
粉 ２ ， ０ｇ 硝酸 钾 １ ， 氯化 钠 ０ ５ｇ 磷酸 氢二钾０ ５ ｇ ． ， ． ｇ 硫 酸镁 ０ ５ｇ 硫 酸亚 铁 ０ ０ ， 脂 ２ ， ， ． ， ． １ｇ 琼 Ｏｇ 水
１ ０ ０ ｍｌ ｐＨ７ ０ ， ．２— ７ ４。 ．
第二 轮 ： ｌ Ｏ株 １ Ｏ株 ６ 出发 菌株一 １ 个 Ｏ株一 选 出 ６ 株
１ Ｏ株 １ ０株
１ Ｏ株
２ 结 果 与 讨论
２ １ 诱 变 剂 量 的 选 择 ．
２ １ １ 固定 浓 度 ， 制 时 间 亚 硝 酸 浓 度 为 ． ． 控 ０ ０ ５Ｍ ， ． ２ 分别 处理 ５ｍｉ、 ０ｍｉ、 ５ｍｉ。结果 ｎ １ ｎ １ ｎ
见表 １ 。
收 稿 日期 ： ０ ００ — ６ ２ １ —３ ０
陕
西
农
业
科
学
２ｌ（） Ｏ Ｏ ３
表 １ 处理时间与正变率及死亡率的关系
这 ５ 菌株 ４ 个 ８ｈ杀 虫情况 列 于表 ４ 。
表 ４ ４ ８ｈ优选 菌株 杀 虫情 况
次 诱变 而获得 ， 编号 为 ２ 。 其 ５ １ ２ 培养基 ．
两 环接入 有 １ 无 菌 水 和 玻 璃 珠 的小 三 角 瓶 ０ ｍｌ
内， 震荡 １ ｎ 然 后用无 菌滤 纸过 滤 ， 取 １ｍｌ ５ｍｉ ， 再 稀 释 １ 倍 即可 （ Ｏ 约含 １ 。 Ｏ 个孢 子／ ） Ｏ 一１ 。 ｍ１。 １ ５ ２ 亚硝酸诱 变处理 ．． 取 ２ｍｌ 单孢 子悬 浮 液
关键 词 ：杀 虫 ； 线 茵 ； 变Байду номын сангаас育种 放 诱
１ 材 料 与 方 法
１ １ 原始 出发菌株 ．
第三 轮 ： 。 …
１ ５ 诱变 因素及 处理 方法［ ． １ ］ １ ５ １ 制备单孢 子 悬 浮 液 ．． 将 成 熟斜 面 孢 子 刮
由 ３ 号 放 线 菌 （ ｔｅ ｔｍｙ ｅ ｐ ０ 经 多 Ｏ Ｓ ｒｐｏ ｃｓｓ ．３ ）
们 采用 了 ３龄幼 蚕作 为敏感 杀灭指 示对 象 。在效
菌落 一２ ８℃培 养 ３ ４ｄ一 接摇 瓶一 ２ — ８℃震 荡 培 养 ９ —１ ０ｈ 效 价测 定一 选 出 １株作 为第 一 ６ ２ 一 次诱变 出发 菌株 。 １４ ２ 诱 变筛选 第 一轮 ： ．． 出发菌株 一单 孢子悬 浮 液一诱 变处理一稀释涂 皿一２ ８℃培养 ３ 一 —４ｄ
和 １ｍｌ 酸缓 冲液放入 一支 无菌大 试管 内 ２ 醋 ８℃
保温 １ ｎ 再 加入 ０ ４Ｍ 亚 硝 酸钠 １ｍｌ ０ｍｉ ， ． 摇匀
后， ２ 置 ８℃保 温诱 变处理 １ ｎ ０ｍｉ 。然后 ， ２ｍｌ 取 放人 １支装有 １ ． ７Ｍ 磷 酸氢 二 钠 的无 菌 ０ｍｌ ０ ０
大试 管 内终 止诱变 。 １ ５ ３ 亚硝 酸 与 紫外 线 复合诱 变 孢 子悬 浮 液 ．．
１２ ２ 发酵培养基 葡萄糖 ５ｇ 黄豆粉 ３ｇ 碳酸 ．． ， ， 钙 ０７ｇ 酵母膏 ０ ５ｇ水 １００ｍ ，Ｈ７２ ． 。 ． ， ． ， ０ ｌｐ ．—７４
１ ３ 培 养 条 件 ．
摇床 往复 速度 为 １ ４次／ ｉ。 ２ ａ ｒ ｎ
１ ４ 诱变 筛选 方案 ． １ ４ １ 原 始 出发 菌 株 的 筛选 沙 土 管 菌 种 一 ． ． 斜 面 菌种 一 ２ ８℃培 养 ３ —４ｄ一 单孢 子 悬 浮 液
一 稀 释涂皿 一 ２ ８℃培 养 ４ ５ｄ一 挑取 单 孢 子 —
２ １ （） ０ ０ ３
陕
西
农
业
科
学
杀 虫 放 线 菌 的诱 变 育种
贺 建 超 贺 榆 霞 马 宏 军 李 利 军 王 玛 丽 。 。 。 ，
（ ． 西省 微 生物研 究所 ， 西 西安 １陕 陕
摘
７ ０ ４ ；． １ ０ ３ ２ 西北 大学 生命 科 学院 ， 陕西 西安 ７ ０ ６ ） １ ０ ９
斜 面菌种 ２ ８℃培 养 ３ ， 皿 菌种 ２ —４ｄ 平 ８℃
培养 ４ ， 瓶 ２ —５ｄ 摇 ８℃往复 振荡培 养 ９ —１ ０ｈ ６ ２ ，
经亚硝 酸处 理 后 ， ５ｍｌ 人 直径 ６ｃ 的无 菌 取 放 ｍ
平 皿 中 ， 功率 为 ６ ， 置 ３Ｊ 波长 为 ２ ３ ５ ７唉 的 紫外 灯
要 ： 陕 西 汉 中地 区 土壤 中分 离得 到 一 株 桔 抗 性放 线 茵 ３ 从 Ｏ号 ， 菌株 能 够 产 生一 种 对 菜 青 虫有 较 好 杀 灭 该
效 果 的抗 生 素 。 为 了进 一 步 提 高抗 生 素 的 效价 ， 们 对 由该 菌株 经 多次谤 变 ， 获 得 的 ２ 我 而 ５号 菌株 进 行 了五 次 亚硝 酸诱 变 和 一 次 亚硝 酸 与 紫外 线 复 合 诱 变 ， 选 出几 株 杀 虫 效 果 比 原 始 出发 茵 株 有 明 显 提 高 的 突 变型 菌 筛 株 ２ 一Ｄ一９ ２ 一Ｄ一４ 等 。 ５ ，５ ６