WesternBlot结果条带分析
Western blot结果异常原因分析及对策(个人总结)
结果异常
原因
对策
1.假阴性，不出现 ⑴一抗、二抗等不匹配
⑴重新订购试剂，认真选取一抗与组织
蛋白条带或者蛋
种属，并设置内参。
白条带很弱
⑵一抗或/和二抗浓度低
⑵增加抗体浓度，延长孵育时间
⑶封闭剂或无关蛋白与一抗或二抗有交叉反应 ⑶封闭用温和去污剂，如TWEEN 20，
⑷SDS-PAGE 电泳上样 前， 煮沸 10
min，以增强蛋白质解聚变性
⑸蛋白样本降解
⑸新鲜制备标本，使用蛋白酶抑制剂
3. 背 景 非 特 异 染 ⑴封闭不充分
⑴延长封闭时间，更换合适的封闭剂
色过强
（脱脂奶粉，BSA，血清等）
⑵一抗浓度过高
⑵增加一抗稀释倍数
⑶抗体孵育温度过高
⑶4℃孵育
⑷二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应
（无关蛋白中含有与待测抗原结构类似多肽（共 或更换封闭剂（脱脂奶、BSA或明胶）
同抗原表位），与特异抗体发生交叉反应）
⑷一抗不识别目的物种的靶蛋白
⑷检查说明书，或做 ClustalW 比对，
设阳性对照
⑸样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低
⑸模索条件，设置阳性对照，增加标本
（抗原无效）
上样量，样本制备时使用蛋白酶抑制剂,
4. 背景出现不均 匀污点、斑点
5. 转膜不充分
⑴转膜时有气泡或抗体分布不均 ⑵抗体与封闭剂结合 ⑶镊子或玻璃平皿污染 ⑷膜湿润不够 ⑸标记膜采用不规范笔 ⑴膜没有完全均匀湿透 ⑵靶蛋白分子量小于 10,000 ⑶靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲 液 pH 值 ⑷甲醇浓度过高 ⑸转移时间不够Thick gel
⑷设置二抗对照(不加一抗),降低二抗
westernblot条带分析
w e s t e r n b l o t条带分析(总6页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。
特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。
其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。
限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。
我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。
再无，则压过夜。
共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。
这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。
然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。
取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。
在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。
荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- --精细操作*注13--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带 - - --- - ---使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
western-blot条带分析报告及解决方法
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到文案大全条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
Western blot 条带判定和图片处理标准流程
Western条带判定的标准流程
1、确认目的蛋白的理论分子量
2、通过Uniprot，确认蛋白是否有信号肽，酶切位点，异构体，糖基化修饰位点（一个糖
基化修饰能增加5KDa左右），磷酸化几乎不影响分子量大小。
3、进行肽链氨基酸的分子量判定：
计算出未修饰的全长肽链的分子量（uniport中的有），即理论分子量
计算分子中修饰基团的分子量。
目的蛋白实际分子量=异构体理论分子量-信号肽+糖基化位点数*5KDa，得到一个最大的分子量。
6、最后一步，将实验误差10%考虑进去，即得到一个蛋白的分子量对应的位置范围。
例如实际分子量为50kda，这目的蛋白实际分子量在45-55kda之间，均可接受。
7、最终每个指标的目的蛋白大小参考abcam、cst、novus、abcam4个公司做的实际分子量大小，如无较大出入则可，和别家公司有较大出入，则需进一步验证自己做出来的条带是否正确，通过阴性，阳性对照，KO实验，证明自己做的条带是真实的，即可上传官网。
1.在image lab中将原始图片调对比度，和亮度后，使图片背景干净，条带清晰，有微弱泳道痕迹即可，导出图片
2放入ppt中，剪切成大小合适，字体均用Arial 11号，黑色，短线均用0.6cm，黑色图片边框0.75磅，黑色，图片高度，宽度以目的条带为核心，上下无杂带尽量保留全maker。
3.图片另存为jep格式，A2016对应的货号为K0002354P,图片命名为K002354P-EIF5A-1/1000.。
western blot总结前人的经验
汇报人：
实验室安全规定：遵守实验室安全规定确保实验安全
操作规范：按照操作规范进行实验避免操作失误
防护措施：穿戴防护服、手套、口罩等防护用品避免接触有害物质
实验废弃物处理：妥善处理实验废弃物避免环境污染
实验室安全培训：定期进行实验室安全培训提高安全意识和操作技能
实验室安全检查：定期进行实验室安全检查确保实验室安全
汇报人：
,
01
02
03
04
05
06
蛋白质印迹：将样品中的蛋白质分离并转移到膜上
抗体结合：特异性抗体与目标蛋白质结合
显色反应：通过化学反应使结合的抗体显色
结果分析：通过显色区域确定目标蛋白质的存在和含量
孵育：加入一抗进行孵育
孵育二抗：加入二抗进行孵育
显色：加入ECL发光液进行化学发光显色
保存方法：根据试剂性质选择合适的保存方式和条件如冷藏、冷冻等
试剂有效期：注意试剂的有效期及时更换过期试剂
试剂污染：避免试剂受到污染影响实验结果
试Hale Waihona Puke 安全：注意试剂的安全性避免接触皮肤和眼睛必要时佩戴防护设备
试剂废弃：合理处理废弃试剂保护环境
样本选择：选择合适的样本类型和浓度
样本处理：对样本进行适当的处理如稀释、沉淀等
实验结束后应立即清理实验台面避免污染环境
实验废弃物应分类收集并按照相关规定进行处理
实验过程中产生的有害气体、液体等应进行有效处理避免对环境和人体造成危害
实验结束后应关闭电源、水源等确保实验室安全
实验安全：确保实验环境和设备的安全
实验记录：如实记录实验过程和数据确保可追溯性
实验伦理：尊重生命保护实验对象
WesternBlot结果条带分析
W e s t e r n B l o t结果条带全面分析1.空白原因：比较多,如果单纯一张没有任何显色,最可能是一抗加成其他抗体,或者二抗种属加错了,比如兔的加成鼠的;解决办法：仔细检查抗体是否加错,确认转膜没有问题;上面的图片展示的是一点信号都没有,如果是这样大部分情况是抗体加错了;如果中间出现了细微的条带,可能原因是蛋白上样量太少,一抗浓度过低,显色液失效;另外如果转膜出现了问题,比如膜放反了,自然是一个白片;2.高背景原因：封闭不够好,一抗浓度高,洗膜时间和次数不够;解决办法：降低一抗浓度,增加洗膜时间和次数;3.非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗4.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡;解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡5.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭结束之后要洗;6.条带拖尾原因：蛋白量太大,一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量,同时一抗浓度和时间也可以缩短;7.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中,都需要注意不要让膜干;8.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心,使用无杂质的液体;另外配胶用的水,SDS,Tris缓冲液要注意不要有杂质;9.条带呈哑铃状原因：配置胶有问题,胶凝固后不均一解决办法：把胶配好,不合格的胶坚决不用10.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔其他问题1蛋白分子量偏高或者偏低;可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应;2蛋白质降解;蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后会出现一些其他带,最主要特点是所有的条带比正常的都低,并且条带模糊不清晰;3所有条带连成一片没有间隔;原因最可能是上样量过多,其次是样品弥散比如电泳长时间停止样品弥散;4整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一,电泳槽老化;5整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好6溴酚蓝拖尾：样品溶解不好;7纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒8溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好,可能是浓缩胶太短,或者是浓缩胶配错;9在分离胶中跑不动：Tris-HClPH值不对,或者忘记加SDS;。
westernblot条带分析
近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。
特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。
其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。
限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量一一抗敏感度一二抗敏感度一底物敏感度一显影和定影效率这一系统。
我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s,看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。
再无，则压过夜。
共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述：先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。
这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。
然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。
取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。
在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。
荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象原因解决反影（白色条带,黑色背景） ----- 1 HRP 过高（背景较高） -----------------至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注1显影后膜上条带处变为黄色 ------ 2 HRP过高（敏感性太高） -------------至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注2 至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注7延长封闭时间4度过夜最好*注8信号弱或无 ------------------ 3 HRP -至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注3------------------------ 4--- 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4------------------------ 5---- 优化转膜条件*注5 ------------------------ 6 HRP-----* 6 过高引起底物迅速耗竭 ------------抗体-抗原系统敏感性过低 ---------- 转膜不充分/过转 --------------或底物活性降低 -------------------------------- 7 HRP过咼（背景较咼） --------------------------------- 8封闭时间不足 ---------------------------------------- 9——更换封闭液（如3%BS的TBST）*注9 ------------------------ 10 TBST----- 增加洗脱时间、次数、用量*注10 ------------------------ 11----降低暴光时间*注11------------------------ 12--- 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12抗体与封闭液有交叉 ------------洗脱不足-------------暴光时间过长 ----------------- 抗原-抗体浓度过高--------------条带内无显影的白点 ----------- 13转膜不良（如有气泡在胶-膜之间）---- 精细操作*注13 ------------------------ 14膜平衡不均/油脂污染 ------------ --- 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14非特异性条带 ------------------ 16 抗体交叉反应 ---------------------至少成倍稀释一抗/二抗（可4~10倍）*注16----------------------- 15----显影前去除气泡*注15 膜与X 光片间有气泡 -----------使用无SDS专膜液*注17散在小圆斑-- ----- ----- -----18 封闭液有杂质颗粒--- ----------------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带•形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
Western Blot 结果条带全面分析
Western Blot 结果条带全面分析Q1. 啥也没有[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
Q2. 高背景[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
Q3. 非特异性条带[原因]：一抗非特异性与蛋白结合[解决办法]：更换一抗[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
Q4. 条带中出现边缘规则的白圈[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
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W e s t e r n B l o t结果条带
分析
Revised final draft November 26, 2020
W e s t e r n B l o t结果条带全面分析
1.空白
原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2.高背景
原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
3.非特异性条带
原因：一抗非特异性与蛋白结合
解决办法：更换一抗
4.条带中出现边缘规则的白圈
原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
5.出现黑点和黑斑
原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合
解决办法：封闭结束之后要洗。
6.条带拖尾
原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长
解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
7.出现非均一性背景
原因：膜可能曾经干过
解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。
8.某个条带变形
原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。
9.条带呈哑铃状
原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一
解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用
10.最边缘条带弯曲
原因：电泳电流不均一
解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔
其他问题
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。
（2）蛋白质降解。
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。
原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
（4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
（5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好
（6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。
（7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒
（8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
（9）在分离胶中跑不动：Tris-HClPH值不对，或者忘记加SDS。