拟南芥突变体kea的表型分析及对生长素的响应特征
拟南芥插入突变体鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定【摘要】拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。
实验将获得T-DNA插入某基因造成的突变种，插入基因功能进行判断。
筛选出纯种突变型，同时进行PCR法序列鉴定纯种突变型、杂种突变型与野生型。
1.引言：反向遗传学：经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
实验材料拟南芥：拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。
这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。
突变体获得：插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中，获得突变体。
当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。
常用的插入诱变方法为农杆菌转化法。
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
拟南芥突变体的功能鉴定及应用
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
突变基因的拟南芥实验研究
突变基因的拟南芥实验研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它的基因组序列已经被完整解读，并且其外观简单、生长周期短等特点，使得其成为基因功能研究的最佳实验材料。
突变基因是指由于DNA序列的变异，造成突变的基因。
拟南芥的突变基因贡献了大量关于植物发育与繁殖等方面的科学研究成果。
突变基因的发现突变基因的发现可以通过自然突变和诱导突变两种途径实现。
自然突变是指在自然条件下，由于DNA杂交、突变等自然因素，使得基因产生突变。
而诱导突变，则需要使用特殊的化学试剂或是电磁辐射等手段对DNA进行干预，从而获得突变基因。
诱导突变的方法目前，诱导突变的方法主要有以下几种：1. EMS法EMS是Ethyl methanesulfonate的缩写，是一种碱基化剂，能够导致DNA中的鸟嘌呤碱基突变。
通过对拟南芥幼苗进行EMS浸泡处理，可以获得大量的突变体。
2. Gamma射线法Gamma射线是一种高能辐射，能够直接影响DNA分子结构，从而导致基因突变。
使用Gamma射线进行诱导突变，可以获得不同类型的突变体，包括缺失、插入、点突变等。
3. T-DNA插入法T-DNA是一种细菌表现元（bacterial virulence factor），广泛存在于土壤中的根际细菌Agrobacterium tumefaciens中。
因为T-DNA能够与植物基因组发生同源重组，因此可以通过向植物中转化Agrobacterium，从而将T-DNA插入到植物基因组中，诱导基因突变。
突变基因的分析方法了解突变基因的表达情况，可以通过基因表达谱、荧光素酶检测、Northern blotting、Western blotting等多种方法实现。
其中基因表达谱是最常用的一种方法，能够快速、准确地检测基因的表达情况。
拟南芥突变基因的研究拟南芥作为模式植物，其突变基因的研究对于植物的发育和繁殖等方面具有重要的意义，以下是一些拟南芥突变基因的研究案例。
拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位
拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位摘要：拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为广泛应用于植物遗传学研究的模式植物，其高叶绿素荧光突变体的筛选和基因定位，对于深入理解植物生长发育和光能利用机制具有重要意义。
本研究通过化学诱变的方法，筛选得到了一批具有高叶绿素荧光的突变体，并通过遗传学分析和基因定位技术，成功地将其突变基因位点进行了精确定位。
进一步的研究表明，这些突变基因在拟南芥的叶绿素合成和光能利用过程中起到重要的调控作用。
1. 引言拟南芥是一种广泛应用于植物遗传学研究的小型模式植物，由于其基因组小、生命周期短、易于培养和遗传转化等特点，成为了研究植物生物学和发育生物学的理想模式。
2. 实验方法本研究采用化学诱变的方法，通过处理拟南芥种子或幼苗，引发基因突变的发生。
随后，对得到的突变体进行高叶绿素荧光筛选。
将荧光强度明显高于野生型的突变体进行收集和保存，以进一步研究其突变基因的特性。
3. 筛选结果经过筛选，我们获得了一批荧光强度较高的突变体。
通过对这些突变体进行高通量测序和遗传学分析，我们成功地将其突变基因位点定位到染色体上的特定区域。
4. 突变基因的特性进一步对这些突变体进行了功能验证和表型分析，发现突变基因在叶绿素的合成和光能利用过程中起到重要的调控作用。
部分突变体表现出叶绿素合成受阻或过度积累的特征，说明突变基因可能是相关代谢途径中的重要调控基因。
5. 基因定位技术本研究采用了CRISPR/Cas9和T-DNA插入等基因定位技术，成功地将突变基因位点精确定位到拟南芥基因组中。
这些定位结果为进一步研究突变基因的功能和调控机制提供了基础。
6. 结论通过化学诱变筛选和基因定位技术，我们成功地获得了一批拟南芥高叶绿素荧光突变体，并将其突变基因的位点进行了定位。
这些突变体对于深入研究植物叶绿素合成和光能利用机制非常重要，为植物生长发育和农作物的遗传改良提供了有力的工具。
拟南芥基因突变体研究及其分子机理分析
拟南芥基因突变体研究及其分子机理分析拟南芥是一种重要的模式植物，在基因突变体研究中发挥着重要的作用。
本文将从拟南芥基因突变体的定义、研究方法、重要性以及其分子机理等方面进行探讨和分析。
一、拟南芥基因突变体定义及研究方法基因突变体是指在基因序列中发生变异的个体，与野生型（WT）相比，基因突变体的表型有明显的差异。
拟南芥基因突变体是以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料的基因突变研究。
它具有许多优秀的特性，如短生命周期、小型体型、遗传变异多样化和基因功能高度保守等。
目前，拟南芥基因突变体的研究方法主要分为化学诱变、遗传转化和基因编辑。
其中，化学诱变是通过化学物质引起基因突变，常用的化学物质有Ethyl methane-sulfonate (EMS)和Sodium azide (NaN3)等。
遗传转化是利用外源DNA片段引入目标基因，达到基因敲入/敲除的目的。
基因编辑则是指利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术对目标基因进行精准的编辑，从而实现目的基因的敲入/敲除。
这些方法的优缺点各有不同，可以根据实验目的和条件选择适宜的研究方法。
二、拟南芥基因突变体的重要性拟南芥基因突变体研究有着重要的科研意义和现实意义。
首先，拟南芥是植物领域中最具代表性的模式植物之一，研究拟南芥基因突变体可以为解析生物分子机理和育种提供重要的理论依据。
其次，拟南芥基因突变体的发现对研究复杂性状、生长发育和环境响应等现象起着重要作用，同时也对人类生命健康、农业生产、环境保护等方面具有深远的影响。
三、拟南芥基因突变体分子机理分析拟南芥基因突变体分子机理分析是对基因突变体的表型变化进行解析的过程。
在基因突变体的研究中，通常采用遗传学、生物化学和分子生物学等多种技术手段进行深入研究。
遗传学方法主要包括染色体显微镜观察、连锁分析、基因定位和基因组学分析等。
在染色体显微镜观察中，通过观察细胞染色体数目、形状、大小和染色体带的特点，可以发现染色体异常和染色体突变。
拟南芥突变体相关分析
拟南芥突变体的相关研究遗传学摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。
关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析1 拟南芥突变体的筛选拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。
拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。
拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。
这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。
1.1植物材料诱变以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml 重蒸水，搅拌30 分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L 磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。
然后用50ml 蒸馏水漂洗种子4 次，每次15min。
将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。
1.2诱变植株培养将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。
18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。
1.3 突变体的筛选拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10 分钟，再用无菌水冲洗3遍。
接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS 培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。
拟南芥突变体的观察和鉴别
拟南芥突变体的观察和鉴别00911081程万里周一组摘要：拟南芥是目前世界通用的一种高等植物研究的模式生物，属于十字花科，鼠耳芥属，具有其生长快速、后代数量大、遗传和分子实验易操作等等的特点。
这些优点使其成为遗传、发育研究中很好的素材。
本实验选用两种突变型（pid-2和scr-3）与野生型（Ler）进行观察和鉴别，比较其表型上的不同之处并做各种指标的测量以进行确认，最终结果表明pid-2品系发育畸形(表现在花形态异常角果弯曲)，scr-3个体生长缓慢（表现在植株和根的长度较短以及败育现象严重）关键词：拟南芥突变体 pid-2 scr-3 Ler1.引言拟南芥是一种世界通用的，在高等植物研究方面十分重要的模式生物，属于十字花科，鼠耳芥属，个体形态小，具有生长周期快，生命力顽强，后代数量多且遗传操作相对简单等诸多优势。
拟南芥基因组小且测序已全部完成。
这些特点也决定了其在遗传学，发育生物学上的不可替代性。
目前发现的拟南芥共有750多个生态型，不同生态型的拟南芥在形态发育，生理反应方面有着相当大的差异，本次选用的Ler野生型属于常见拟南芥品系之一。
而是用pid-2和scr-3突变体与野生型（Ler）进行对比，可以通过各项指标的对比，确定突变基因对拟南芥发育的影响。
2.材料与方法12.1 材料2.1.1生物材料：拟南芥野生型（Ler）种子突变体（pid-2、scr-3）种子1发育生物学实验讲义2.1.2试剂溶液：70%乙醇10%NaClO（次氯酸钠）无菌水2.1.3 仪器用具：MS固体培养平板玻璃涂棒剪刀镊子胶头吸管三角瓶显微镜1.5ml离心管培养土培养钵2.2方法(1)将种子放于4℃冰箱内2-3天，进行种子的纯化处理(2)取适量种子于1.5ml离心管中，加入1ml 70%乙醇，轻微震荡1min(3)吸去乙醇，加入1ml体积分数为10%的NaClO（次氯酸钠），消毒8-10min(4)吸去NaClO，用无菌水冲洗种子5次后，加入600ul无菌水(5)用移液器将水连同种子吸起，均匀涂布于MS 平板(6)吸去并风干培养基表面多余的水分(7)加盖，封口，置于光照培养箱内(8)7-14天后，当幼苗具4片真叶时转入土壤(9)植株生长6周后，进行野生型和突变体的性状鉴别和数据统计3.结果3.1拟南芥发育各时期图图1示拟南芥发育2周整体观2图2 示发育6周的pid-2突变体外观3图3 示发育6周scr-3品系外观43.2发育6周植株数量统计2由于本人样品未拍摄，此图引自施逸豪同学的样品3引自标准图4引自标准图3.2.1 个人移栽统计情况本组共领取约15颗种子，移栽11颗种子，个人共计移栽2颗种子，在2周时成活两棵，在6周时仅有1棵成活。
拟南芥mapkkk15突变体的鉴定及非生物胁迫下的功能分析
热带作物学报2021, 42(9): 2494 2500 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2020-07-23；修回日期 2020-09-03基金项目 国家重点研发计划项目“橡胶树抗寒高产品种改良”（No. 2019YFD1001102）；国家自然科学基金项目（No. 31870646）。
作者简介 梁 群（1993—），女，硕士，研究方向：作物遗传育种。
*通信作者（Corresponding auther ）：程 汉（CHENG Han ），E-mail ：******************。
拟南芥mapkkk15突变体的鉴定及非生物胁迫下的功能分析梁 群1,2，邓 治2，雷柯煜1,2，黄华孙2，安泽伟2，程 汉2*1. 海南大学热带作物学院，海南海口 570228；2. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海南海口 571101摘 要：低温寒害是制约我国天然橡胶种植的最主要的环境限制因子，阐明橡胶树抗逆机制有助于保障天然橡胶的种植安全。
前期研究发现1个低温诱导的橡胶树MAPKKK 基因参与橡胶树抗寒能力调控，序列比对发现该基因与拟南芥MAPKKK15基因同源，但AtMAPKKK15的功能仍不清楚。
通过对拟南芥MAPKKK15基因功能的研究，揭示该类基因在植物逆境胁迫应答中的作用，将有助于进一步解析橡胶树MAPKKK 基因的功能。
本研究从DNA 和转录水平鉴定拟南芥mapkkk15纯合突变体植株，评价mapkkk15突变体低温和干旱胁迫抗性。
结果显示：低温抑制AtMAPKKK15基因表达。
对2个mapkkk15纯合缺失突变体进行分析，发现与野生型植株相比，mapkkk15突变体植株的抗冻存活率提高，电解质渗漏率下降。
脱水实验表明，突变体叶片脱水率要高于野生型。
上述结果表明，AtMAPKKK15基因在拟南芥中可能反向调控抗寒性，正向调控抗旱性。
关键词：mapkkk15突变体；拟南芥；非生物胁迫；功能鉴定；橡胶树 中图分类号：S961.6 文献标识码：AIdentification of mapkkk15 Mutant from Arabidopsis and Function Analysis to Abiotic StressLIANG Qun 1,2, DENG Zhi 2, LEI Keyi 1,2, HUANG Huasun 2, AN Zewei 2, CHENG Han 2* 1. College of Tropical Crops, Hainan Unviersity, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, ChinaAbstract: Abiotic stress severely affects the natural rubber yield in China, so it is necessary to clarify the resistant mechanism of rubber tree to improve natural rubber yield. In previous studies, we found that a MAPPKKK was induced by low temperature in rubber tree. Sequence alignment showed that HbMAPKKK was homologous with MAPKKK15 from Arabidopsis . However, the function of AtMAPKKK15 is unclear. Function of AtMAPKKK15 was identified in re-sponding to stress and provide theoretical basis for further elucidating the function of MAPKKK in rubber tree. The homozygous T-DNA insertion mutants of AtMAPKKK15 were identified at DNA and transcription level, and evaluated resistance under low temperature and drought treatments. The results showed that the expression of AtMAPKKK15 was inhibited by low temperature. Two homozygous null mutants of MAPKKK15 were obtained from Arabidopsis . The mapkkk15 mutant improved low temperature tolerance by increasing survival and decreasing electrolyte leakage com-pared with the wild-type. However, the dehydration ration of mutant leaves increased with the extension of in vitro time. The results indicate that MAPKKK15 negatively regulated tolerance to low temperature and postively regulated resisi-tance to drought.Keywords: mapkkk15 mutant; Arabidopsis thaliana ; abiotic stress; function identification; Hevea brasiliensis DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.008All Rights Reserved.第9期梁群等: 拟南芥mapkkk15突变体的鉴定及非生物胁迫下的功能分析 2495植物在整个生长发育过程中不可避免的会遭受低温、干旱和高盐等非生物胁迫危害，导致作物品质及产量下降。
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拟南芥突变体kea的表型分析及对生长素的响应特征作者：韩蕾李俊林苏彦华来源：《江苏农业科学》2016年第06期摘要：对拟南芥kea突变体表型分析的结果表明，在黑暗条件下，单个KEA缺失后下胚轴和主根伸长与野生型相比没有明显差异，而多个KEA缺失导致幼苗出现去黄化现象，表现为下胚轴伸长受到抑制，子叶完全打开，真叶开始出现，主根发育良好。
qRT-PCT结果表明，呈现去黄化现象的kea多突变体内生长素合成基因[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]的表达下调，而生长素转运基因[WTBX][STBX]AUX1、PIN1、PIN3、PIN7[WTBZ][STBZ]的表达没有明显变化。
外源施加生长素类似物NAA能够恢复kea多突变体去黄化现象。
上述结果暗示KEA在调控拟南芥光调控发育的某些方面发挥重要作用。
关键词：拟南芥；去黄化；生长素；暗形态建成中图分类号： Q945.12文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）06-0030-03植物在光照下和黑暗中表现为不同的生长特性；光照下萌发的幼苗表现为：下胚轴伸长受抑制、主根伸长、子叶展开、叶绿素累积，称为光形态建成（photomorphogenesis）。
在黑暗中，植物的生长呈现出多种黄化特征，称为暗形态建成（skotomorphogenesis）[1]。
黄化苗主要特点为迅速生长和伸长的下胚轴、发育迟缓的主根、闭合的子叶形成顶端弯钩（apical hook）[2]。
在自然界中，种子发芽起始于暗形态建成过程：种子萌发后，大部分营养资源流向下胚轴，用于下胚轴伸长而不是子叶和根系的发育，这种快速伸长的方式为幼苗更早的接收光照提供了物理支持。
此外，子叶通过紧闭形成顶端弯钩以保护地上部分生组织在幼苗破土而出时免遭伤害。
这一生长策略能够保证幼苗在光合作用之前种子中贮备的有限营养物质更有效利用[3]。
暗形态建成过程受多种植物激素如生长素、脱落酸、细胞分裂素、油菜素内酯、赤霉素和乙烯的调控[2，4-7]。
生长素能够促进多种植物器官的伸长，例如：下胚轴、胚芽鞘和根，其机理早在20世纪70年代由酸生长理论所解释[8-9]。
此理论表明在数分钟内，通过细胞质膜H+-ATPase生长素促进质子外排，此过程降低了质外体间pH值，促进细胞壁松弛[10]。
本研究筛选到几个kea突变体，其暗形态过程发生改变，通过分析下胚轴、主根的表观特征，并利用基因表达和药理学试验初步研究了其去黄化特征对生长素响应的改变，以期探讨KEA基因在拟南芥发育过程中的功能，为进一步阐述拟南芥光发育的相关机制提供良好的试验材料。
1材料与方法1.1供试材料1.1.1[JP2]植物材料拟南芥野生型Col-0，单突变体[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]；双突变体[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]，多突变体体[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]。
其中[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]单突变体种子从ABRC拟南芥种子资源库购得。
双突变体和多突变体通过杂交方法得来。
[JP]1.1.2生长条件和培养基光照培养箱（MMM，Germany）的培养条件为：温度23 ℃，相对湿度70%，连续黑暗培养。
培养基修改自Pilot 等的配方[11]，成分包括：1 mmol/L CaSO4，2 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgSO4，50 μmol/L NaFe-EDTA，50 μmol/L H3BO3，12 μmol/L MnCl2，1 μmol/L CuCl2，1 μmol/L ZnCl2，30 nmol/L （NH4）6Mo7O24，2.4 mmol/L MES（2-吗啉己磺酸），10 g/L蔗糖，8 g/L琼脂，用1 mmol/L KOH调至pH值5.7，121 ℃，100 kPa 灭菌20 min。
1.2试验方法1.2.1拟南芥种子消毒和播种拟南芥种子，先用70%乙醇冲洗30 s，再用含有体积分数1%次氯酸钠和5 g/L SDS （十二烷基硫酸钠）的消毒液冲洗，并且剧烈振荡5 min，然后用无菌水冲洗5次，最后再加少量无菌水，4 ℃冰箱放置 48 h。
播种于培养基，用医用胶带密封后竖直放置在生长箱培养。
1.2.2激素处理试验配制10 mmol/L 生长素类似物NAA，待培养基灭菌冷却至65 ℃左右，在超净工作台中，将NAA母液按照一定的稀释倍数添加到培养基。
1.2.3下胚轴和主根长测量拟南芥野生型和突变体在正常培养基或含有不同浓度NAA的培养基黑暗培养8 d后，以直尺为参照进行拍照（Cannon G8），使用ImageJ软件按照直尺比例分析下胚轴和主根长。
1.2.4拟南芥RNA提取及反转录采用Trizol（TaKaRa）分别提取野生型和突变体总RNA，并且用DNA酶去除基因组DNA污染。
取2份RNA，一份用于测定在260 nm和 280 nm 处的吸光度，通过D260 nm/D280 nm的值得出总RNA的纯度，此比值介于1.8～2.2之间为佳；另一份通过变性胶检测RNA完整性，如果28S和18S清晰无拖尾，而且亮度比值约为2 ∶[KG-*3]1，说明提取的总RNA无降解且完整性较高。
取2 μg RNA，用反转录试剂盒（TAKARA）合成cDNA。
1.2.5实时定量荧光PCR采用荧光染料SYBR Green I （TaKaRa）进行分析。
本研究所用引物见表1。
定量PCR加样量：2 × SYBR green Ⅰ Premix 10 μL，PrimerF （10 μmol/L） 0.4 μL，PrimerR （10 μmol/L）0.4 μL，cDNA模板（稀释4倍）2.5 μL，去离子水补充至20 μL。
PCR程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，45个循环；熔解曲线从 65 ℃到95 ℃，每0.5 ℃进行记录；最后16 ℃。
PCR结束后先分析熔解曲线，每对引物的溶解曲线一致，说明该PCR特异，数据可信。
另外分析扩增曲线，我们用Actin2为内参，以2-ΔΔCT 相对定量的方法计算目的基因的相对表达量。
cDNA模板的CT值基本保证在15～30之间，超出此范围，数据不可信。
根据经验，一般稀释4倍。
1.2.6数据统计与作图所得统计结果用Microsoft Excel软件进行计量，用Sigmaplot 10.0软件进行计算和作图。
2结果与分析2.1KEA多突变体黄化苗出现去黄化现象试验发现，在黑暗条件下生长5 d，与野生型（WT）相比，KEA单突变体的下胚轴长度略长或者没有差别（图1-A）；而KEA多突变体，除了[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]外，[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]与单突变体或野生型相比，下胚轴长度较小，主根较长，特别是[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，其下胚轴长度比野生型减小了2/3（图1-B、图1-C）。
另外还发现，除了[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]，大多数多突变体[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]子叶已经完全展开，而野生型和单突变体子叶还处于弯钩（hook）状态（图1-B）。
为了更进一步了解多突变体黄化苗发育状况，连续测量黄化苗在生长3 d至8 d的生长情况。
如图2-A、图2-B所示，从生长4 d开始，多突变体就开始表现为根伸长量增加而下胚轴伸长量减少。
具体到生长8 d时，野生型和双突变[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]表现为典型的黄化现象（etiolated），即较长的下胚轴，较短的主根；而多突变体则表现出明显的去黄化现象（de-etiolated），除了主根和下胚轴外，子叶完全展开，真叶开始冒出，呈现出类似于光照下的表型（图2-C）。
2.2kea突变体内生长素合成基因表达下调通过定量PCR，发现突变体内生长素合成相关基因下调，如[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]，而生长素运输基因[WTBX][STBX]AUX1[WTBZ][STBZ]或PIN 等表达没有发现明显变化（图3），因此推断，突变体的去黄化表型可能是与生长素的合成有关，而与生长素运输关系不大。
2.3生长素类似物NAA能够恢复kea突变体去黄化现象为了验证kea突变体去黄化现象是否与生长素合成有关，向培养基添加一系列浓度（0.01、0.1、1 μmol/L）生长素类似物萘乙酸NAA，如图4所示，黑暗条件下，低浓度NAA （0.01、0.1 μmol/L）对野生型和突变体[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]下胚轴生长没有明显的抑制作用，当NAA浓度达到1 μmol/L时，其下胚轴生长明显受到抑制，抑制率约为17%、21%。
[JP2]而对于突变体[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，NAA对其下胚轴生长有明显的促进作用，[JP][FK（W30][TPHL4.tif；S+1mm][FK）]特别是对[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，1 μmol/L NAA使其下胚轴伸长增加约82%。
同时发现，NAA（0.01、0.1 μmol/L）对野生型和突变体根系都有明显抑制作用，尤其是当浓度达到 1 μmol/L，所试株系的主根伸长均被抑制。
总之，NAA处理后，去黄化突变体[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]恢复或部分恢复黄化苗特征：较长的下胚轴，较短的主根，子叶保持弯钩状态或部分展开。
3讨论在正常生长条件下，不同于单突变，kea多突变体[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]呈现出明显的发育表型：下胚轴较短，主根较长，弯钩消失，子叶完全展开，真叶开始出现，这说明KEA基因在控制拟南芥生长发育的某些方面发挥重要作用。