小鼠过氧化氢酶的制备与测定
过氧化氢酶(CAT)测定
实验器材：紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、天平、100微升枪2支、10ml容量瓶、10 mL试管、具塞试管、5 mL枪一支、研钵试剂：（1）0.05mo l·L-1磷酸缓冲液（PH7.0）。
pH 0.05mol/L NaH2PO4(ml) 0.05mol/L Na2HPO4(ml)5.7 93.56.55.8 92.0 8.05.9 90.0 10.06.0 87.7 12.36.1 85.0 15.06.2 81.5 18.56.3 77.5 22.56.4 73.5 26.56.5 68.5 31.56.6 62.5 37.56.7 56.5 43.56.8 51.0 49.06.9 45.0 55.07.0 39.0 61.07.1 33.0 67.07.2 28.0 72.07.3 23.0 67.07.4 19.0 81.07.5 16.0 84.07.6 13.0 87.07.7 10.5 89.57.8 8.5 91.57.9 7.0 93.08.0 5.3 94.7（2）200 mmo l·L-1H2O2溶液，30% H2O2 45.44 mL溶于磷酸缓冲液，定容至1 L。
（3）50 mmo l·L-1Tris-HCl缓冲液（PH7.0）(Tris三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；缓血酸胺，C4H11NO3):250ml 0.2mol/L的Tris（含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L）+450mL 0.1mol/L的HCl(取83ml浓度为37.2%的盐酸定容至1L)，加水稀释至1L。
步骤：1、酶液提取：取0.5g新鲜植物样品，置于预冷研钵中，加2mL磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆。
2、将研磨好的匀浆转移至10mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次（每次1-2mL）,转移至容量瓶，定容至10 mL。
3、取提取液5 mL于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。
过氧化氢酶活力测定CAT
过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。
学习几种测定CAT活性的方法，理解其测定原理。
一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。
H202的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。
其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。
根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。
其反应为：H2O2十2KI十H2S04→I2十K2S04十2H20I2+2Na2S2O3→2NaI+NaS406二、材料、设备与试剂1．植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。
2．主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml 三角瓶。
3．试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。
(3)10％的钼酸铵溶液：称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。
(4)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl2防腐)。
(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。
一天后进行标定。
标定方法：精确称取分析纯K2Cr207约0．15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr3+离子的颜色)为止。
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。
测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。
用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。
放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品氧电极仪记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。
操作步骤1.仪器的标定按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2.绘制酶活性标准曲线(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
(3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等)，记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。
3.样品测定(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
(3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
实验4、植物组织中过氧化氢酶的活力测定
2.反应
取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定 瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液 2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时， 于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
用0.02mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现 粉红色（在30S内不消失）为终点。
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测
定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量
பைடு நூலகம்
（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，
用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多 余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4
=5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
实验七、植物组织中过 氧化氢酶活力测定
——高锰酸钾滴定法
一、实验目的
1.掌握酶活力测定的方法
2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理
二、实验原理
过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，
它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过
程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化
剂又是还原剂。
R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2
3.滴定
五、计算
酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示 酶活(mgH2O2/g· min)= ( A B ) VT 1.7 式中：
过氧化氢酶的分离纯化及鉴定
一种嗜热嗜碱过氧化氢酶的分离纯化及鉴定摘要：试图从嗜热嗜碱的嗜热子囊菌中分离纯化过氧化氢酶,以得到具有嗜热嗜碱性质的过氧化氢酶。
根据研究表明，嗜热嗜碱的嗜热子囊菌中的过氧化氢酶该酶为双亚基结构,分子量约为1·9×105,亚基分子量约为9·5×104，。
并且嗜热嗜碱过氧化氢酶均在广泛的pH 范围内表现稳定,酶亚基分子量较大,而大分子亚基被发现有更好的温度、pH 稳定性, H2O2耐受性[19]。
现在通过对酶的盐析及透析除盐、DEAE-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200 凝胶过滤层析等方法对其进行分离纯化，通过对其分子质量的测定、酶活力的测定，等对其进行鉴定。
关键词：过氧化氢酶 分离纯化 鉴定1 实验流程图2 实验步骤2.1 菌种培养从-20 ℃冰箱保藏的嗜热子囊菌菌种挑取一环接入盛有70 mL种子培养基中(糖度为6°P的天然麦芽汁，pH 7.5)的250 mL 摇瓶中，在37 ℃、200 r/min 培养12 h. 然后以6%接种量接种至装有80 mL 发酵培养基的500 mL 摇瓶中，在37 ℃、200r/min 培养30 h.2.2 酶的盐析及透析除盐取发酵液,过滤去除菌体,加硫酸铵至饱和度50%, 5℃下过夜,10000 r ·min-1离心15 min,除去沉淀（除去其他不溶性杂质）,上清液继续加入硫酸铵至饱和度90%, 5℃下静置12 h,离心收集沉淀,用少量10 mmol ·L-1的Tris-HCl(pH 8·0)缓冲液溶解,蒸馏水透析48 h （除去硫酸铵等小分子离子杂质）,透析后的酶液5℃下保存，得到嗜热嗜碱过氧化氢酶的粗提取物。
2.3 DEAE-Sepharose 离子交换层析DEAE-Sepharose 离子交换层析柱经 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.2)平衡后，初酶液上样5mL ，用0～1mol/L 的NaCl 溶液(用0.05mol/L ，pH7.2 的磷酸缓冲液配制)进行线性梯度洗脱，流速 30mL/h ，每管收集 5mL ；然后测定各管 CAT 活力和蛋白质含量，收集活性较高的各管酶液（得到嗜热嗜碱过氧化氢酶的细提取物），4℃蒸馏水透析脱盐过夜。
过氧化氢酶活性测定
实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴； 5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3.0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液 5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
过氧化氢酶(CAT)酶活测定方法
过氧化氢酶酶活测定方法
一配溶液:
1. 1.5% NaBO3·4H2：
称取1.5g NaBO3·4H2O溶于100ml纯水
2. 0.067M 磷酸盐缓冲：
称取磷酸氢二钠 2.398g溶于100ml纯水，另称取磷酸二氢钠 1.05g 溶于100ml 纯水中，按配方配置成PH为6.8的PBS
3. 1M硫：
10.87ml浓硫酸加入200ml纯水中
4. 0.05M高锰：
0.79g高锰酸钾溶于100ml纯水中。
5. HCl溶液：调PH
二仪器：37°水浴箱，，滴定管，PH试纸，移液器，15ML的离心管，烧杯三步骤：
1.预先用HCL将pH调至6.8的1.5%NaBO3·4H2O 8mL加入含有1.5mL
0.067M ph6.8的磷酸盐缓冲液的烧杯中。
2.在37℃下保持20min后，实验组加入0.5ml酶，对照组加入等量的缓冲
液，混合摇匀。
3．5分钟后，加入到10ml1M硫酸中
4. 在烧瓶中用0.05M高锰酸钾滴定。
5. 结果表示为硼酸单位/每克酶
四计算公式：
酶活力=(V blank—V sample)×0.05×稀释倍数/(样品浓度×0.5) ×(1000/5min)×1000(U/g)
1。
8实验8-过氧化氢酶活性测定
4 、 0.1mol/L H2O2：取30%H2O2 （17.6mol/L）溶
液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02mol/L
KMnO4溶液（在酸性条件下）标定。 5 、 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g， 用蒸馏水溶解后，定容至1000mL。
2.2 材料:小麦叶片
2.3 主要设备 离心机，试管，研钵，烧杯，吸耳球，滤纸，擦镜 纸，恒温箱，铁架台，酸式滴定管
4 方法步骤
1、 酶液提取
取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶 液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量 瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液 转至容量瓶中，用同一缓冲液定容， 4000转离心15min，上清液即为过氧化 氢酶的粗提液。
2 、滴定
取50mL三角瓶2个（1个测定，另1个为对照），
测定瓶中加入酶液2.5mL，对照加煮死酶液2.5mL， 再加入0.1mol/L H2O2 2.5mL ，同时计时，于30℃ 恒温水浴中保温10min，立即加入 10%H2SO42.5mL。
3、用0.02mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色
小麦叶片离心机试管研钵烧杯吸耳球滤纸擦镜纸恒温箱铁架台酸式滴定管23主要设备酶液提取取小麦叶片25g加入ph78的磷酸缓冲溶液少量研磨成匀浆转移至25ml容量瓶中用该缓冲液冲洗研钵并将冲洗液转至容量瓶中用同一缓冲液定容4000转离心15min上清液即为过氧化滴定取50ml三角瓶2个1个测定另1个为对照测定瓶中加入酶液25ml对照加煮死酶液25ml再加入01moll25ml同时计时于30恒温水浴中保温10min立即加入10h25ml3用002mollkmno标准溶液滴定至出现粉红色在30s内不消失为终点
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1 小鼠过氧化氢酶的制备与测定
基础医学院09级四班19小班生化试验1组 任课老师：张静 成员：王春雪、吴舒、吴丹羽、鲍庭申
引言 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。 过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏、肾脏、红细胞中以高浓度存在。 过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。它还被用在隐形眼睛的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 过氧化氢酶在实验室中还常常被用作了解酶对反应速率影响的工具。
实验背景
小鼠过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由四个相同多肽链的亚基组成，是以铁卟琳为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水，几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最是温度为37℃，最适pH值为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
实验步骤
一.组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 1.颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏，用滤纸吸净血液后称重为6g； 2.加入51ml预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇，），用组织捣碎机匀浆3-5min； 3.缓慢滴加3ml氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min； 4.匀浆液离心，40℃, 6000rpm , 30min后，弃沉淀，收获上清液； 5.【留样】取匀浆后上清液60uL，加入20 uL 4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。另取60 uL匀浆后上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。 二.盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 1.冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h； 2
2.将盐析溶液离心（40℃，6000rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀； 3.用24ml磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）10min ，离心（40℃, 4000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液； 4.【留样】取盐析后上清样品60ul，用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，备用于SDS-PAGE检测。-20℃冰箱保存； 5.将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用； 6.将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液）中透析一周，中途更换一次透析液； 7.一周后，取出透析袋内混浊溶液， 离心（40℃，6000rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀； 8.用2mL-3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶）， 离心（40℃，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液；（测OD280。若蛋白浓度小于1mg/ml，则二或三组上清液合并后方可做下面的试验） 9.【留样】取透析后上清样品60ul，用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，备用于SDS-PAGE检测。放置-20℃冰箱保存； 10.将透析袋（截留量10KD，直径1公分）置于沸水中煮15min，清洗晾凉后备用； 11.将收获的样品液放入处理后的透析袋（截留量10KD，直径1公分）中，置于50%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至400-500ul收样，放置4℃冰箱保存。 三.凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶 1.凝胶的处理【准备室操作】； 2.装柱 ； 3.平衡：控制流速，应保持凝胶面平整； 4.浓缩样品【前次实验内容中已操作】； 5.加样：用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液400-500ul，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入； 6.洗脱：洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)，保持0.3-0.5mL/min（约5-10滴/min）的流速。洗脱速度不可过快，以防样品带扩散； 7.收集及检测：每管收集1mL（约20滴）。收集管依次在407nm和280nm波长下，以磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)调零，测定各管吸光度值。以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线； 8.收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280 nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物； 9.【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置4℃冰箱保存； 10.【留样】 取浓缩后的层析纯化样品60uL，用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，备用于SDS-PAGE检测，放置-20℃冰箱保存。 四.Lowry法测定纯化的过氧化物酶浓度 1.选择并配制标准蛋白； 2.按下表配成不同浓度的标准蛋白组，编号，并在分光光度计上测定650nm处的光密度值； 3
1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 生理盐水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂AB(9:1) 1 1 1 1 1 1 混合液（ml） 混合后置于50摄氏度水浴10分钟，冷却 试剂C(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 立即混匀，置50摄氏度水浴保温20分钟，冷却后比色
3．样品蛋白的测定： 7（层析后样品） 8（匀浆后样品） 稀释的待测样品（ml） 1．0 1．0 生理盐水（ml） ----------------- ------------------ 试剂AB(9:1)（ml） 1 1 混合后置于50摄氏度水浴10分钟，冷却 试剂C（ml） 3.0 3.0 立即混匀，置50摄氏度水浴保温20分钟，冷却后比色，以步骤2中1管为空白管即可。
4.以标准溶液浓度为横坐标，光密度值为纵坐标画图。并查标准曲线算待测样品的蛋白质含量。 五．SDS-PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量 1.制备凝胶：（1）装板（2）配胶（3）凝胶液的灌注与聚合； 2.处理蛋白质样品：将样品溶解在溶解液里，在100℃下加热2-3分钟； 3.加样； 4.电泳； 5.剥胶与固定； 6.染色与脱色； 7.胶板的干燥保存； 8.蛋白质的定量； 六.Lineweaver - Burk双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数 1. H2O2浓度的再标定：锥形瓶2只，各加H2O2溶液2ml和25% H2SO4 2ml，KMnO4
滴定；
2.按下表进行操作
所加试剂 1 2 3 4 5 H2O2溶液 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 蒸馏水 0 0.50 1.00 1.50 2.00 H2O2酶 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
10分钟后加入25% H2SO4 2ml，边加边摇； 3.用KMnO4滴定，记录毫升数； 4
4.计算，并求Km值。 实验结果
一.层析后蛋白吸光度变化 层析后蛋白吸光变化曲线
00.050.10.150.20.250.3
1234567891011121314151617181920212223242526272829303132管号
吸光值OD407
OD280
由上图可得第19管是最终纯化的过氧化氢酶 二.过氧化氢分子量的测定 SDS-PAGE图 匀浆 盐析 透析 Marker 层析 5
项目 1 2 3 4 5 待测 溴酚蓝 相对迁移率 0.092 0.165 0.268 0.402 0.720 0.247 1
分子量的对数 1.99 1.82 1.63 1.49 1.16 1.7
分子量标准曲线
00.20.40.60.811.21.41.61.822.22.4
00.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.8相对迁移率
分子量的对数系列1
过氧化氢酶的迁移率为0.247，由图示可得分子量的对数为1.7，则过氧化氢酶的分子量为50.12 三. 测定纯化的过氧化氢酶的米氏常数
过氧化氢浓度的再标定:
项目 1 2 高锰酸钾（ml） 14.7 15.2 过氧化氢浓度均值（mol/L） 0.037375
项目 1 2 3 4 5 滴定剩余过氧化氢所需高锰酸钾的体积（ml） 13.6 7.6 6.5 3.6 0.1
反应速度(mol/（L*min）） 0.0025 0.0037 0.0024 0.0020 0.0018 1/v 393.7 272.1 424.4 502.5 549.8 1/[s] 32.15 40.16 53.48 80.00 160.51