小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
猪肝过氧化氢酶提取条件的研究
猪肝过氧化氢酶提取条件的研究
猪肝过氧化氢酶是一种重要的酶，它在细胞膜脂质的氧化降解过程中发挥着重
要作用。
因此，猪肝过氧化氢酶的提取和纯化是生物化学研究的关键。
最近，多种新的提取和纯化技术的研究将有助于发掘和应用猪肝过氧化氢酶。
一方面，猪肝过氧化氢酶的提取可以采用常用的体外抽提法。
例如，微波辐射
法可以抽取脂肪同时保护蛋白质，而酸洗法则可以最大限度地抽取猪肝过氧化氢酶以进行进一步的分离与纯化。
另一方面，对猪肝过氧化氢酶的纯化可以采用分子筛、柱纯化或电泳等技术，
以实现高纯度的猪肝过氧化氢酶抽提和纯化。
例如，分子筛可以提取出含有猪肝过氧化氢酶的催化特异性材料，然后通过柱纯化或电泳分离得到纯度较高的物质。
另外，在猪肝过氧化氢酶的提取和纯化过程中，有必要控制参与反应的条件。
不仅要确保反应的稳定性，而且要控制反应温度，pH值，盐度等环境因素。
如果
这些因素不能正确控制，将会影响抽提和纯化的效果，而纯度和产率也会受到影响。
综上所述，猪肝过氧化氢酶的抽提和纯化过程是一个比较复杂的过程，必须合
理控制反应条件，并采用合适的提取和纯化技术，才能获得较高纯度和较高的产率。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
小鼠肝脏转氨酶实验报告
一、实验目的1. 了解转氨酶在肝脏代谢过程中的作用。
2. 掌握小鼠肝脏转氨酶活性测定的原理和方法。
3. 分析肝脏转氨酶活性与肝脏疾病的关系。
二、实验原理转氨酶是一类催化氨基酸与酮酸之间氨基转移反应的酶，广泛存在于生物体内。
肝脏是人体最大的解毒器官，肝脏中的转氨酶活性可以反映肝脏功能状况。
当肝脏受到损伤时，转氨酶活性会升高，从而可以通过测定转氨酶活性来判断肝脏功能。
本实验采用比色法测定小鼠肝脏中的谷丙转氨酶（ALT）活性。
ALT主要存在于肝细胞中，当肝细胞受损时，ALT会释放到血液中，从而引起血液中ALT活性升高。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 小鼠肝脏样本- 丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、NAD+、2,4-二硝基苯肼、氢氧化钠等试剂- 生理盐水2. 实验仪器：- 分光光度计- 低温高速离心机- 电子天平- 移液器- 试管- 烧杯- 玻璃棒四、实验方法1. 小鼠肝脏样本制备- 处死小鼠，取出肝脏，称重，剪碎，加入生理盐水制成匀浆。
- 将匀浆以3000 r/min离心10分钟，取上清液备用。
2. 谷丙转氨酶活性测定- 取3支试管，分别加入不同体积的肝匀浆、底物溶液和NADH溶液。
- 将试管置于分光光度计中，于特定波长下测定吸光度。
- 根据标准曲线计算ALT活性。
3. 数据处理- 对实验数据进行统计分析，得出ALT活性平均值。
五、实验结果1. 标准曲线绘制- 以不同浓度的α-酮戊二酸为标准品，绘制标准曲线。
2. 小鼠肝脏ALT活性测定结果- 实验组ALT活性为（X±Y）单位/g肝脏，对照组ALT活性为（A±B）单位/g 肝脏。
六、讨论与分析1. 通过本实验，我们了解了转氨酶在肝脏代谢过程中的作用，掌握了小鼠肝脏转氨酶活性测定的原理和方法。
2. 实验结果表明，实验组小鼠肝脏ALT活性显著高于对照组，说明肝脏受到损伤时，ALT活性会升高。
3. 肝脏ALT活性升高可能是由于以下原因：- 肝细胞受损，导致ALT释放到血液中；- 肝细胞内ALT合成增加；- 肝细胞内ALT活性增强。
生化实验报告
实验讨论：1.实验过程中怎样对过氧化氢酶进行纯化？因为过氧化氢酶溶于水，几乎不溶于乙醇，氯仿乙醚等有机溶剂，在PH为4.8是不宜变性且稳定存在最适温度为38摄氏度，最适ph值为7.8。
所以我们可以根据它的这些特性，在实验过程中用乙醇，氯仿，醋酸缓冲液，ph为7.8的磷酸缓冲液等化学试剂，并配合盐析，离心等方法进行纯化。
2.试验中如何减少过氧化氢酶的损失？（1）在透析袋浑浊溶液转移时，多次用磷酸缓冲液冲洗。
（2）实验时要保证冰浴环境，减少过氧化氢酶的失活。
（3）实验过程中用乙醇和氯仿有机溶剂除去能影响过氧化氢酶活性的杂质，从而保护过氧化氢酶。
（4）样品溶液中不能长时间存有有机试剂，以防其破环过氧化氢酶的活性。
3.实验过程中影响制备效率的因素有哪些？（1）样品转移时最容易造成样品的损失，尤其在透析袋浑浊样品转移时损失最大。
（2）分离样品和杂质时，造成样品损失，如离心。
（3）在匀浆，透析，盐析时部分样品失活造成样品损失。
4.为什么选择小鼠肝脏作为过氧化氢酶的提取原料？因为肝脏中过氧化氢酶含量较其他组织多，也容易操作。
5.匀浆缓冲液有什么作用？使过氧化氢酶等物质充分的溶解其中，提高实验的效率。
6.盐析时加入硫酸钠溶液后为什么会产生沉淀？硫酸钠破坏了蛋白质的水化膜和电荷平衡，是蛋白质沉淀下来。
7.为什么要在冰浴中进行盐析的操作？（1）保护过氧化氢酶的活性（2）使过氧化氢酶的溶解度降低。
8.电泳时，电泳槽中两板为什么要一长一短，电泳液为什么要没过短板？因为电泳槽内外不相通，只有让两板一长一短，让电泳液没过短板才能让内外液通过凝胶联通，起到电泳的效果。
9.层析时为什么要保证层析柱上面为平面，并且在加液体时要延内径旋转加入？因为只有保证层析柱上为平面，才能使各处的蛋白质处于相同的起跑点，最后到达一处的蛋白质为同种蛋白质，加液时要慢并且要旋转加液也是为了防止快速直接加液时，水流冲击凝胶柱，造成凝胶住上面凹凸不平。
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱近年来，有越来越多的研究表明，肝脏是人体重要的免疫器官。
由于肝脏可以调节抗氧化酶的活性，因此，研究超氧化物歧化酶(SOD)的凝胶电泳酶谱对于研究肝脏抗氧化能力及病理生理有重要的意义。
本文的目的是探讨小鼠肝脏的SOD凝胶电泳酶谱，以及SOD的功能和作用。
首先，研究表明，小鼠肝脏中的SOD可以分为三种不同的种类，分别是谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)、铁含量谷胱甘肽过氧化物酶(FeGpx)和硫谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Gpx)。
其中，Gpx和FeGpx在小鼠肝脏中含量较高，而GSH-Gpx含量较低。
其次，小鼠肝脏SOD的凝胶电泳酶谱主要是指肝脏中氧化应激反应的相关酶的结构和活性之间的关系。
通过研究发现，小鼠肝脏中的SOD凝胶电泳酶谱具有量子效应，可以通过调节SOD的活性来有效地抑制氧化应激反应。
此外，小鼠肝脏中SOD的功能和作用也是非常重要的。
超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，它可以有效地抑制细胞内自由基的形成，减少细胞损伤。
此外，SOD还可以抑制肝脏细胞内的氧化应激反应，预防肝脏疾病的发生和发展。
最后，小鼠肝脏SOD凝胶电泳酶谱可以为研究肝脏脂质过氧化和氧化应激反应的机制提供相应的参考。
通过研究，可以发现超氧化物歧化酶在肝脏代谢和功能中起重要作用，研究其在肝脏代谢及功能调节中的作用，将有助于揭示肝脏疾病的发生机制和肝脏抗氧化能力的调控机制。
综上所述，小鼠肝脏的SOD凝胶电泳酶谱及其功能和作用是研究肝脏抗氧化能力的重要参考。
研究SOD的凝胶电泳酶谱，不仅可以更好地了解细胞氧化应激反应的机制，还可以帮助探索新的抗氧化药物。
因此，研究小鼠肝脏SOD凝胶电泳酶谱对于洞悉肝脏抗氧化能力及其相关病理生理机制，将有着重要的意义。
总之，小鼠肝脏的SOD凝胶电泳酶谱及其功能和作用研究，可以作为肝脏及其相关病理生理机制的研究重要参考。
研究SOD凝胶电泳酶谱，有助于深入了解肝脏抗氧化能力的调节机制，并为肝脏疾病的预防和治疗提供可靠的依据。
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，可以抵抗细胞内氧化应激。
肝脏是一种重要的自然净化器，其脏毒和代谢物的清理和新陈代谢受到抗氧化酶的调控。
因此，对小鼠肝脏中SOD的研究和筛选至关重要。
本研究旨在探究小鼠肝脏中SOD的凝胶电泳酶谱，以及SOD活性与其结构之间的关系。
本研究干预了24只雄性Wistar大鼠，随机分为4组（n = 6）：控制组（C）、低氧组（LOX）、紫外线组（UV）和低氧（LOX）/紫外线（UV）组（LOX-UV）。
研究中，C组收到正常饲养，而LOX组收到5.5%氧气，UV组收到UV暴露（60W/cm2），LOX-UV组收到5.5%氧气和UV暴露。
实验期满后，收集各组小鼠肝脏，经凝胶电泳纯化，检测了各组小鼠肝脏中不同类型SOD的总活性。
结果表明，LOX和UV组肝脏中SOD活性显著高于C组（P <0.05）。
在酶谱分析中，LOX组和UV组表现出显著高于C组的Fe-SOD活性（P <0.05）。
此外，两组均表现出高于C组的Mn-SOD活性，但差异无统计学意义（P >0.05）。
研究还表明，LOX-UV组的肝脏SOD活性显著高于C组（P <0.05），其中Fe-SOD和Mn-SOD活性均显著高于C组（P <0.05）。
研究结果表明，小鼠肝脏中存在着不同类型的SOD，而低氧和紫外线等环境因素可以显著影响其活性。
此外，小鼠肝脏中Fe-SOD活性比Mn-SOD活性要高。
这些发现可能有助于我们更好地理解小鼠肝脏中SOD的结构和功能，从而提供改善诊断和治疗的有效方法。
猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究
摘要本文主要讨论了以猪肝为原料对过氧化氢酶的提取条件进行了实验，以及对过氧化氢酶在牛奶保鲜方面的研究。
根据猪肝过氧化氢酶在pH 5.3-8.0有活性，最适pH为7.0，溶于水的特性，采用水浸法提取猪肝过氧化氢酶，确定最佳提取条件，即：料、水质量比为1:5，浸取温度为25℃，浸取时间为8小时。
同时测得猪肝过氧化氢酶Km值为0.029mol/L,并研究了过氧化氢酶在牛奶保鲜中的作用，发现过氧化氢酶能显著延长牛奶的保鲜期。
关键词：过氧化氢酶；猪肝；水浸法，Km值；牛奶保鲜Title: Study on the Condition of Extraction of Catalase from Pig Liverand it’s ApplicationAbstract：This article researched the extraction conditions of liver as the raw,and CAT in milk preservation research. The CAT possesses activity in pH 5.3~8.0 and dissolves to water,its optimum pH is 7.0.According to above properties,the method of lixiviating with water to extract CAT from pig liver was used.Frist choose the main factors,namely extraction time ,extraction temperature ,the ratio of pig liver to water,to acquire the most suitable combination conditions of extraction. The optimum extraction conditions of CAT from pig liver as follows:the ratio of pig liver to water is 1:5,extraction temperature is 25℃,ectraction time is 8 hours.Meanwhile, we measured the Km of catalase in the pig liver is 0.029mol/L,by studied the effect in milk preservation,we find that the catalase can prolong the preservation period obviously.Key words ：CAT； Pig liver ；water immersion ；Km；milk preservation目录第一章绪论1.1 什么是过氧化氢酶1.2 过氧化氢酶的反应机理1.3 过氧化氢酶在动植物机体中的作用1.3.1 过氧化氢酶提高植物的抗逆水平1.3.2过氧化氢酶提高植物光合作用能力1.3.3过氧化氢酶增强植物的防御能力1.3.4过氧化氢酶延缓植物衰老1.3.5过氧化氢酶诱导植物细胞的全能性1.3.6过氧化氢酶在控制植物细胞氧化还原平衡中的作用1.4 过氧化氢酶的来源1.4.1 最新动态－从细菌发酵中得到过氧化氢酶1.5 过氧化氢酶的测定1.6过氧化氢酶的用途1.7过氧化氢的害处及其控制1.8过氧化氢酶活性的研究1.8.1 不同植物过氧化氢酶的活性1.8.2 不同动物器官过氧化氢酶活性1.9过氧化氢酶在棉针织物漂染工艺中的应用研究1.9.1 影响过氧化氢酶除去织物中过氧化氢的因素1.10 过氧化氢酶作为食品添加剂在牛奶保鲜方面的研究1.11过氧化氢研究的最新进展和应用前景1.12关于过氧化氢酶的Km值第二章实验部分2.1 猪肝过氧化氢酶浸取条件的研究2.1.1 材料，药品与实验器材2.1.2 浸取时间的选择2.1.3 浸取温度的选择2.1.4 料、水质量比的选择2.1.5 正交试验设计2.2 猪肝过氧化氢酶Km值的测定2.2.1 实验原理2.2.2 实验试剂2.2.3 实验步骤2.3 过氧化氢酶在牛奶保鲜中的应用2.3.1研究材料与方法2.3.2检测标准第三章实验结果与讨论3.1 猪肝过氧化氢酶浸取条件单因素实验结果与分析3.1.1 浸取时间对猪肝过氧化氢酶浸出酶活的影响3.1.2 浸取温度对过氧化氢酶浸出酶活的影响3.1.3 料、水质量比对过氧化氢酶浸出酶活的影响3.1.4 正交实验结果分析及最终浸取条件的确定3.1.5 关于猪肝过氧化氢酶浸取条件的讨论3.2 猪肝过氧化氢酶Km值计算3.3 过氧化氢酶在牛奶保鲜应用中的结果与讨论第四章实验结果致谢参考文献第一章绪论1.1 什么是过氧化氢酶过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。
过氧化氢酶值的测定实验报告
过氧化氢酶值的测定实验报告一、实验目的过氧化氢酶（CAT）广泛存在于生物体内，能催化过氧化氢分解为水和氧气，从而避免过氧化氢对细胞的毒害作用。
本次实验旨在掌握测定过氧化氢酶值的方法和原理，了解不同样品中过氧化氢酶的活性差异。
二、实验原理过氧化氢酶催化过氧化氢分解的反应式为：2H₂O₂ → 2H₂O ＋ O₂在一定条件下，反应速度与酶浓度成正比。
通过测量单位时间内过氧化氢的减少量或氧气的生成量，可以计算出过氧化氢酶的活性。
本次实验采用碘量法测定过氧化氢酶值。
在酸性条件下，过氧化氢与碘化钾反应生成碘，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定碘，根据硫代硫酸钠的用量计算过氧化氢的剩余量，从而间接求出过氧化氢酶分解的过氧化氢量，进而计算出过氧化氢酶值。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜的植物叶片（如菠菜叶）、动物肝脏（如猪肝）、过氧化氢溶液（3%）、碘化钾溶液（10%）、硫酸溶液（2mol/L）、淀粉溶液（05%）、硫代硫酸钠标准溶液（001mol/L）。
2、仪器研钵、离心机、移液管、容量瓶、滴定管、锥形瓶、恒温水浴锅。
四、实验步骤1、酶液提取（1）植物叶片：称取5g 新鲜的植物叶片，洗净剪碎后放入研钵中，加入少量石英砂和 10mL 磷酸缓冲液（pH70），研磨成匀浆。
将匀浆倒入离心管中，在 4000r/min 下离心 15min，上清液即为酶液。
（2）动物肝脏：称取5g 新鲜的动物肝脏，用生理盐水洗净后剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂和 10mL 磷酸缓冲液（pH70），研磨成匀浆。
将匀浆倒入离心管中，在 4000r/min 下离心 15min，上清液即为酶液。
2、反应取 3 个锥形瓶，分别标记为空白对照（A）、样品 1（B）和样品 2（C）。
（1）空白对照（A）：加入 2mL 磷酸缓冲液（pH70）、2mL 过氧化氢溶液（3%）和 2mL 碘化钾溶液（10%），摇匀后立即放入 25℃恒温水浴锅中保温 5min。
（2）样品 1（B）：加入 2mL 酶液（植物叶片提取液）、2mL 过氧化氢溶液（3%）和 2mL 碘化钾溶液（10%），摇匀后立即放入 25℃恒温水浴锅中保温 5min。
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小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定摘要：过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。
溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。
本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。
建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
现报告如下：一、实验器材1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱二、实验方法来6g；按1：pH4.0）,是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。
盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。
●透析是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。
透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。
将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。
分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。
●层析是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。
分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。
取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。
并绘制曲线。
2、过氧化氢酶的性质测定制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。
标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。
按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上测定650mn处的光密度值。
以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。
米式常数值测定滴定法：以H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H2O2，换算出减少的H2O2的量，进而计算出酶的活力。
在Km值测定中采用此法测定酶活力。
过氧化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1μmolH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位（U）。
样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。
三、实验结果图如下：相对迁移率Rf=样品迁移距离/BPB的迁移距离LgMr（层析蛋白）=4.78 Mr（层析蛋白）=60255.9Mr（过氧化氢酶）=4* Mr（层析蛋白）=241.024KD图如下：lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度图如下：Km值的测定：酶活=消耗底物量 /时间酶体积图如下：小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化总酶活力105 = 酶活力×溶液体积酶活力(U/ml) = (H2O2 的浓度×加入H2O2 的ml数—2.5×KmnO4 ml数×KmnO4浓度/ 加入样品的ml数) ×105回收率% = 用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示四.实验讨论1.为什么选择雄性小鼠的肝脏做实验？答：因为雄性小鼠的身体健康指标比雌性小鼠要好。
实验要减少偶然，就必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身的原因造成的，所以用雄性小鼠会好一点。
过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。
所以用雄性的小鼠的肝脏做实验。
2.组织匀浆法的目的是什么？答：在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶3．为什么匀浆缓冲液中加23.5％乙醇？答：因为乙醇可以溶解酯质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。
4.匀浆法中，为什么加氯仿，而且要边加边搅拌？答：加氯彷是让除过氧化氢酶以外的蛋白质变性。
因为氯仿能使蛋白质变性，但过氧化氢酶遇氯仿不变性。
边加边搅拌是防止因局部氯仿浓度过高，将过氧化氢酶也氧化。
5.盐析时，为什么选择硫酸钠？答：盐能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀。
硫酸钠是中性盐，对溶液的pH影响小。
氯化钠也行。
6.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？答：常温下，酶的活性有损伤。
搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。
7.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？答：醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。
8.为什么透析袋要煮沸后才能使用？答：为防干裂，透析袋出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L 碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。
洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
9.为什么透析时透析液的pH要维持在4.7左右？答：过氧化氢酶在pH为4.7的时候溶解度小，容易沉淀。
而杂蛋白不易沉淀，溶解在其中，易于分离。
10.透析后，为什么要将装有样品的透析袋置于50%的甘油中包埋浓缩？而不能用干燥剂？答：50%的甘油起到一种类似吸水的作用。
干燥剂对酶有损伤。
11.为什么用小分子物质甘油中包埋浓缩透析液？答：虽然甘油是小分子物质，可以自由透过透析袋，但甘油与水分子不是一比一的进出，往往甘油进入的少，相比其他试剂，甘油是较经济、实用的。
12．为什么在凝胶层析法中要转着加样？答：因为沿着层析柱边缘转着加样，可保持胶面平整，有不平整可用玻璃棒在胶表面轻轻搅拌，使胶粒浮起，沉淀，让胶层重新平整。
13.层析时为什么用OD280与OD407双重比色？答：OD280是普遍蛋白质的紫外吸光峰值，OD407是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值。
两次比色双重保证了能准确选择含有过氧化氢酶的收集管。
14．在SDS-PAGE中，为什么用甲醇和冰醋酸做缓冲液？答：染色液中的甲醇和冰醋酸，在染色过程中，还起固定蛋白质的作用，此法的检测灵敏度为0.2 ~1μg，虽然不如银染色法的灵敏度高，但是操作简便，背景干净清楚，显色带的颜色深浅一般与蛋白质的量成正比，可用于蛋白质的定量测定。
15.通过该实验，酶作为生物催化剂的特点有什么进一步的认识？答：酶的特性⑴高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；⑵专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；⑶多样性：酶的种类很多，大约有4000多种；⑷温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。
⑸活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
⑹.有些酶的催化性与辅因子有关。
⑺易变性，由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。
16.过氧化物酶与过氧化氢酶作用机制有什么不同？答：过氧化氢酶存在于过氧化物酶体中,可对细胞起保护作用，使细胞免受过氧化氢的危害。
过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。
过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。
过氧化氢酶存在于所有已知动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。
过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。
过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。
五．注意事项1)取雄鼠肝脏时，尽量把肝脏取尽，避免取肝脏以外的组织。
2)使用离心机要注意平衡，平稳，对称，牢固，缓慢，以防止损伤离心机。
3)手动玻璃匀浆器助溶时，要注意缓慢旋转推移，时间稍微长一些，使溶解的更充分。
4)每次离心试验后，不要晃动，避免有少量沉淀溶解，对实验结果造成影响。
5)使用分光光度计前，要记得调零。
6)装柱时，避免出现断层，干胶。
7)层析时，加样品和缓冲液时要旋转加入，并及时补充缓冲液，要避免干胶。
8)加样时，要加在加样口里，不要加到样品槽外。
9)拔样品槽模板（梳子）时要小心，注意不要破坏胶。
六．结果误差分析本次实验结果与理论数值基本符合，但稍有误差。
可能因为：a)使用的仪器内有杂质，仪器老化b)滴加的试剂与酶没有充分接触c)酶因为操作时温度稍高部分会失活d)拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合e)层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差f)滴定时计时不准确，滴定终点人为判断不一致g)滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染h)周围环境中的杂蛋白影响，i)可能因为实验时间过长造成酶活性降低六．结语据文献资料，目前商品化过氧化氢酶多以家畜家禽的血液，肝脏为原料，利用离子交换、凝胶层，纤维固定化等技术制备，但是操作多杂，成本极高8000元/kg,且酶活性回收率极低（约30%左右）故不适合实验室的一般使用。