淋病奈瑟菌耐药性的分子基础初探
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法 Prepared on 22 November 2020细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml 的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
医学微生物学[第十三章性传播的病原微生物]山东大学期末考试知识点复习
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第十三章性传播的病原微生物学习纲要性传播疾病(sexually transmitted disease，STD)：通过性行为引起流行的传染病，简称性病。
引起性病的病原微生物有许多种，包括细菌、病毒、衣原体、支原体、螺旋体、真菌、原虫等。
我国当前发病最多的性病主要有由淋病奈瑟菌引起的淋病。
(一)淋病奈瑟菌1．生物学性状(1)形态与染色：菌体肾形，排列似一对咖啡豆，革兰染色阴性。
有荚膜和菌毛，无鞭毛，无芽孢。
(2)培养特性：营养要求高，常用巧克力(色)血琼脂培养基。
菌落凸起，圆形、灰白色或半透明、光滑。
(3)生化反应：只分解葡萄糖，产酸不产气，氧化酶试验阳性。
(4)抗原结构与分类：外膜蛋白可分为P I、PⅡ和PⅢ三种。
P I为主要外膜蛋白，是淋病奈瑟菌分型的主要基础。
PⅡ蛋白，主要功能是使细菌彼此黏附在一起或黏附于宿主细胞上，并参与营养物质的摄取。
脂多糖具有很强的致热毒性，与致病性及免疫性有关。
菌毛蛋白抗原存在于有毒株。
(5)抵抗力：不耐热和寒冷，对消毒剂敏感。
易产生耐药性。
2．致病性和免疫性(1)致病物质：主要是菌毛、荚膜、外膜蛋白，以及内毒素和IgAl蛋白酶。
IgAl蛋白酶破坏黏膜表面存在的特异性IgAl，有利于淋病奈瑟菌黏附。
PI可直接插入中性粒细胞的膜上，导致膜损伤。
菌毛和荚膜具有抗吞噬作用。
(2)所致疾病：人是淋病奈瑟菌的唯一宿主。
主要引起人类泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性感染。
儿童淋病包括：幼儿淋菌性阴道炎、新生儿淋菌性结膜炎。
(3)免疫性：人类对淋菌缺乏天然抵抗力。
3．微生物学检查方法用棉拭蘸取泌尿生殖道脓性分泌物直接涂片镜检；症状轻或无症状的患者均应作淋病奈瑟菌分离培养及鉴定；PCR检测核酸；还可做免疫酶试验和直接免疫荧光试验。
4．防治原则目前尚无淋病疫苗；预防淋病主要措施是使用安全套；婴儿出生时，不论母亲有无淋病，都应以l％硝酸银或其他银盐溶液滴眼，以预防新生儿淋菌性眼炎的发生。
淋病奈瑟菌129株耐药性分析
１２ １ 最低抑菌浓度（ Ｃ 测定 ．． ＭＩ）
采用琼脂稀 释法… ，
９ ．５ １ ７ １ ９ ； 孢 曲 松 中 敏 的 菌 株 ７ 株 ， ８ ４ ％（ ２ ／ ２ ） 头 ５ 占
５ ．４ ７ ／ ２ ） 大观霉 素 １ ０ ８ １ ％（ ５ １ ９ ； ０ ％敏感 。 株
表 １ ４种抗 菌药 物对 １９株淋病 奈 瑟菌 的 ＭＩ ２ Ｃ分 布
持 续开展 常规 耐 药性 监 测十 分重要 。
［ 关键 词 ］ 淋 病奈 瑟 茵 ； 生素 ； 药性 抗 耐 ［ 中图分类 号 ］ Ｒ ３ ８ １ ７ ． ［ 文献标 识码 ］ Ｂ ［ 文章 编 号］ １ ０ —８ ７ （ ０ ８ ０ ０ １ ０ ７ ２ ０ ）５—０ ８ ２ ２—０ ２
抗 生 素 株 数
８ ４ Ｏ
Ｏ
ＭＩ ，／ Ｃ（ｇ ｍＬ） ｕ
２ １ Ｏ． ０． ５ ０． ２ ０． ６ ０． ３ ０． １ ０． ０ ０． ０ ０． ０ ５ ２ １ ５ ０ ０ ０ ０ ０ ５ ０ ８ ０ ４ ０ ２
头 孢 曲 松 大 观霉 素
・
２２ ・ ８
中 国医 学 文 摘 一 肤 科 学 ２ ０ 皮 ０ ８年 １ Ｏ月 第 ２ ５卷 第 ５期
・
性传 播疾病 ・
淋病 奈 瑟 菌 １ ９株 耐 药 性 分 析 ２
钟娜， 王芳 乾 ， 陆玉 珠 ， 朱海 花 ， 郑文 爱 ［ 摘 要 ］ 目的 监测 海 口地 区淋病奈 瑟茵对 常 用抗 生 素 的耐 药状 况。方 法 收 集本 院性病 门诊 ２ ０ ０ ４年
～
２０ ０ ７年 ６月对 １ ９株淋 病 奈 瑟 菌 菌 株进 行 了耐 药 种于各 种浓度 的平板 ，６ ， ％ ２ ３℃ ５
淋病奈瑟菌的分子生物学检验
一、淋病奈瑟菌的基因组结构特征
淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成测序研 究的淋病奈瑟菌菌株之一，它的染色体DNA长度 为2.15Mbp，其中G+C含量为52.68%。编码区的 DNA长度占总长度的78%。共含有2069个基因，包 括2002个具有编码功能的基因和67个编码结构性 RNAs基。Chung GT等人在2008年报道了淋病奈瑟 菌新菌株NCCP11945的基因组结构。他们发现 NCCP11945染色体的DNA长度为2.23Mbp，据估计 可以编码2622个开放性阅读框。同时，NCP11945 含有一个能编码12个ORFs的质粒，其DNA长度为 4153bp。据他们估计，整个基因组的编码基因的 密度约为87%。全基因组平均G+C含量为52.4%。 这与FA1090菌株相类似。
4．链替代扩增技术
SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等 温扩增技术。目前使用较多的是Becton Dikinson公司生产的Probe Tec ET，可以同时 对CT和NG进行检测，Probe Tec ET特异性扩增 NG染色体PivNg基因，然后用荧光标记的探针 检测其相应的DNA靶序列，2小时可以完成96份 标本检测。与培养法相比具有很高的敏感性和 特异性。
1．克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高 了临床样本检测的阳性率和准确性。
2．通过分子生物学技术可以进行淋球菌感 染的分子流行病学调查。
3．可以准确、快速评价药物治疗的效果。 4．有利于淋病的鉴别诊断。
谢谢！
二、淋病奈瑟菌的分子生物学检验内容
（一）淋病奈瑟菌核酸的检测
1．聚合酶链反应
PCR是分子生物学中最常用检测基因的技术 手段，也是淋病奈瑟菌基因诊断中最基本的方法。 PCR引物的设计应选择与其相应的靶基因，多采 用：①隐蔽质粒cppB基因(cppBH01/3、1/2及 cppBN3/4)；②16s rRNA基因(SL67/59、NGPl/2)； ③porA假基因；④编码外膜蛋白基因（omp基 因）；⑤opa基因等；⑥胞嘧啶DNA甲基转移酶基 因(Roche Cobas Amplicor)。不同靶基因设计引 物对PCR的敏感性和特异性有一定的影响。
淋病奈瑟菌耐药机制研究进展
淋病奈瑟菌为革兰阴性球菌，是淋病的病原 体。据ＷＨＯ估计，全球每年新发病例超过６０００ 万，发展中国家发病率更呈明显上升的趋势。在我 国淋病的感染率居性传播疾病之首…。随着抗生 素的广泛使用，淋病奈瑟菌对抗生素的耐药率越来 越高，其机制主要由染色体和质粒的基因改变而引 起，按耐药性一般将淋病奈瑟菌分成以下几型：质 粒介导的产青霉素酶的淋病奈瑟菌（ＰＰＮＧ）；质粒 介导的高度耐四环素淋病奈瑟菌（ＴＲＮＧ）；ＰＰＮＧ／ ＴＲＮＧ质粒介导的对青霉素和四环素都耐药的淋病 奈瑟菌；ＣＭＲＮＧ染色体介导的对青霉素和四环素 都耐药的淋病奈瑟菌；ＱＲＮＧ染色体介导的对喹诺 酮类耐药的淋病奈瑟菌。因此，研究对淋病奈瑟菌 的耐药机制，对指导临床用药，从而有效地控制淋 病的传播有着十分重要的意义。
Ｂ Ａ
抗生素有不同的耐药率及耐药机制，对青霉素耐药
的主要机制是产生１３一内酰胺酶；对四环素耐药的 主要机制是细胞膜对药物的通透性降低；对大环内 酯类、大观霉素耐药的主要机制是作用靶位的改 变；对氟喹诺酮类耐药的主要机制是ｇｙｒＡ及ｐａｘＣ 基因的突变；对第三代头孢菌素类敏感性降低或耐 药的机制尚未明确。 ２．１青霉素青霉素属于１３一内酰胺类抗生素，淋 病奈瑟菌对其已普遍、高度耐药，这种耐药主要表 现为质粒和染色体介导两种机制。 ２．１．１质粒介导的耐药机制 质粒介导的耐药机
１．１．１
ＰＢＰｓ是一些位于细胞膜上的酶类，包括：
淋病奈瑟菌的耐药机制 ｓｙｓｔｅｍ）起着重要作用。
肽聚糖转肽酶、葡萄糖转基酶、羧肽酶，对维持细菌 胞壁的稳定起着重要作用，同时也是Ｂ一内酰胺类 抗生素的主要靶位点，Ｂ一内酰胺类抗生素是通过 与淋病奈瑟菌细胞膜上ＰＢＰｓ结合，影响细胞壁的 合成来杀灭淋病奈瑟菌。在淋病奈瑟菌的耐药机 制中，已知ｐｏｎＡ、ＰｅｎＡ等基因是编码ＰＢＰｓ的基 因，当ｐｏｎＡ及ＰｅｎＡ基因突变时，可以使相应氨基
106株淋病奈瑟菌的耐药性分析
【 ｅ ｏｄ】 Ｎｉｅ ａ ｏｏｈｅｅ Ｒ ｓｔ ｃ， ｕｃ ｔｉ ｙ Ｋ ｙ ｒｓ ｗ ｅ ｓ ｉ ｇ ｒ ｏａ， ｅ ｓｎｅ Ｓｓ ｐ ｂｉ ｓ ｒ ｎ ｉａ ｅ ｉｌ ｔ 【 ｕｈ ｒｓａ ｄ ｅｓ Ｔ ｅＣ ｎｒ ｆ ｏｐｔ ，ｈ ｔ １０ １ Ｃ ｉａ Ａ ｔｏ ｄ ｒｓ】 ｈ ｅ ｔ ｏ ｓｉ Ｓａ ｏ ５ ５ ３ ， ｈ ｅ Ｈ ｌ ａ ｎ ｕ ｎ 淋病奈 瑟菌是淋病 的病原体 ， 国 目 是我 前性传播 疾病中 发病率 最高 的一种 ， 它可造 成不孕 、 不育 及新生 儿淋 病性 眼
ｒ ｆｒ ｎ ｅ ｆｒ ｔ ｅｐ ｅ ｅ ｔ ｎ ａ ｄ ｔ ａｍｅ ｔ ｆ ｏ ｏ ｒ ｅ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｅｓ ｓ ｅ ｔ ｉ ｔ ｏ５ ａ ｔ ｉｔ ｇ ｎ ｓｗ ｓｔ ｓ ｅｅ ｅ ｃ ｏ ｈ ｒ ｖ ｎ ｉ ｅ ｔ ｎ ｎ ｒｈ ａ ｏ ｎ ｒ ｏｇ ｔｏ ｓ ｈ ｕ ｃ ｐ ｉ ｌ ｙ ｔ ｉ ｏ ｉ ａ ｅ ｔ ａ ｔ ｂｉ ｎ ｂ ｃｎ ｅ —
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PIB基因点突变与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药相关性的研究
【论著】ＰＩＢ基因点突变与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药相关性的研究孙爱华（浙江医学高等专科学校，杭州３１００５３）［摘要］目的：了解浙江地区分离的淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素的耐药率及该菌ＰＩＢ基因Ｇ１２０和Ａ１２１点突变与青霉素和四环素耐药性的关系。
方法：采用高保真ＰＣＲ扩增２５株淋病奈瑟菌ＰＩＢ基因序列，Ｔ—Ａ克隆后测序。
分析测序菌株ＰＩＢ基因中与耐药性密切相关的Ｇ１２０和Ａ１２１变异情况，采用二倍琼脂稀释法确定ＰＩＢ菌株的耐药性。
结果：２５株淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素均耐药，耐药率为１００％。
经测序的２５株ＰＩＢ淋病奈瑟菌中，１株（４．Ｏ％）Ｇ１２０或Ａ１２１均未突变，其对青霉素和四环素的ＭＩＣ分别为８¨ｇ／ｍｌ和４斗ｇ／ＩＩｌｌ。
５株（２０．０％）Ｇ１２０Ｄ／Ｎ突变而Ａ１２１不变，１株（４．０％）Ｇ１２０不变而Ａ１２１Ｇ突变，２株（８．Ｏ％）Ｇ１２０Ｎ突变但Ａ１２１缺失，１６株（６４．０％）Ｇ１２０Ｋ和Ａ１２１Ｄ双位点突变。
２４株Ｇ１２０和／或Ａ１２１突变的ＰＩＢ菌株均对青霉素和四环素的ＭＩＣ为４～１２８Ｉｘｇ／ｍｌ不等。
结论：浙江地区分离的ＰＩＢ型淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药率为１００％。
上述淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药与ＰＩＢ基因氨基酸序列Ｇ１２０和／或Ａ１２１突变密切相关。
［关键词］淋病奈瑟茵；青霉素／四环素；耐药性；ＰＩＢ基因；点突变［中圈分类号］Ｒ７５９．２［文献标识码］Ａ［文章绵号】１００４—８６８５（２００７）１２—２１５９—０３ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｉｎＩＢｇｅｎｅＳｕｎＡｉ—ｈｕａ（ＺｈｅｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５３，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇａｎｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔ１１ｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎＧ１２０ｏｒ／ａｎｄＡ１２１ｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌＰＩＢｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＰＩＢｇｅｎｅｓｏｆ２５Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒＴ—Ａｃｌｏｎｉｎｇ．ＴｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓＧ１２０ａｎｄＡ１２１ｔｈａｔｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄＰＩＢｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ａｎｄｔｈｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇｄｏｕｂｌｉｎｇａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｌｌｔｈｅ２５ｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ，１ｓｔｒａｉｎ（４．０％）ｈａｄｎｏａｎｙｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｈｅＧ１２０ａｎｄＡ１２１ｓｉｔｅｓａｎｄｉｔ’ＳＭＩＣｏｆｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｗａｓ８斗ｇ／ｍｌａｎｄ４Ｉｘｇ／ｍｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｗｈｉｌｅ５ｓｔｒａｉｎｓ（２０．０％）ｓｈｏｗｅｄＧ１２０Ｄ／ＮｏｒＡ１２１Ｇｍｕｔａｔｉｏｎ，１ｓｔｒａｉｎｏｎｌｙＡ１２１Ｇ，２ｓｔｒａｉｎｓＧ１２０ＮａｎｄＡ１２１ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ａｎｄ１６ｓｔｒａｉｎｓ（６４．Ｏ％）ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｄｏｕｂｌｅｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎ．ＭＩＣｏｆ２４ＰＩＢｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈＧ１２０ａｎｄ／ｏｒＡ１２１ｍｕｔａｔｉｏｎｒａｎｇｅｗａｓＭＩＣ４～１２８斗ｇ／ｍ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｒａｔｅｏｆｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇａｒｅａｉｓ１００％ａｎｄｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｎｄｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｉｓｃｌｏｓｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＧ１２０ａｎｄＡ１２１ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＰＩＢｇｅｎｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｉｓｏｌａｔｅｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ；Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＰＩＢｇｅｎｅ；Ｓｉｔｅｍｕｔａｔｉｏｎ从１９４５年到１９８８年，青霉素一直作为淋病治疗的首选药物，然而随着淋病奈瑟菌临床菌株耐药性的增加，青霉素治疗淋病的疗效不断下降导致青霉素不再是治疗淋病奈瑟菌感染的一线抗生素。
广州地区淋病奈瑟菌耐药性分析
菌科细菌产生，由质粒介导，从ＴＥＭ一１，ＴＥＭ一２和ＳＨＶ一１突变而来。
临床对Ｇ内酰胺类药物耐药（包括青霉素类、头孢菌素类和氨曲南），对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感，体外对酶抑制剂敏感。
在国内由于大量应用头孢噻肟，极易选筛出ＣＴＸ—Ｍ型的ＥＳＢＬｓ。
ＣＴＸ—Ｍ型ＥＳＢＬｓ属于ＡｍｂｌｅｒＡ类酶中Ｋ１一ｌｉｋｅ酶，其特点是对头孢噻肟耐药，对头孢他啶敏感［４］。
由于ＥＳＢＬｓ由质粒介导，可在菌株中传播，极易在病房内爆发流行，给临床抗菌治疗带来极大的困难。
在分离的革兰阳性球菌中，对万古霉素耐药率最低，其次为利福平，而对青霉素、红霉素、克林霉素和复方磺胺甲嗯唑的耐药率比较高。
链球菌属对青霉素的耐药率低于葡萄球菌。
２５株凝固酶阴性葡萄球菌和金葡菌中，检出耐苯唑西林的葡萄球菌（ＭＲＳ）分别为５６．２％和２２．２％。
ＭＲＳ对苯唑西林的耐药机制是由于染色体介导的青霉素结合蛋白（ＰＢＰ）２ａ所致，导致对所有Ｊ３内酰胺类抗生素的亲和力下降。
总之，为了延缓细菌耐药性的产生，控制耐药菌株的播散和流行，医院应加强综合管理，定期监测细菌的耐药趋势，合理使用抗菌药物。
参考文献［２］［３］［４］张卓然，倪语星，洪秀华，等．临床微生物学和微生物检验［Ｍ］．第３版．北京：人民卫生出版社，２００３．李景云，马越，张力，等．临床５２家医院常见分离菌株的药物敏感性监测［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００６，２９（５）；４５２—４５３．褚海青，李惠萍，何国钧．铜绿假单胞菌的耐药机制［Ｊ］．中国抗感染化疗杂志，２０（）３，３（１）：５４—５７．倪语星，王金良，徐英春，等．抗微生物药物敏感性试验规范［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，２００２．收稿日期：２（）０６—１１—１４广州地区淋病奈瑟菌耐药性分析吴兴中，郑和平，黄进梅，曾维英，潘慧清，李美玲，薛耀华・实验研究・摘要：目的监测广州地区２００５年分离的淋病奈瑟菌对青霉素、四环素、大观霉素、头孢曲松和环丙沙星的耐药性，分析耐药菌株的流行特点。
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・论著・作者单位:扬州大学医学院微生物学及免疫学教研室,扬州,225001淋病奈瑟菌耐药性的分子基础初探季明春 陈红菊 严 华 申厚凤[摘要] 目的: 研究染色体介导淋病奈瑟菌耐药的机制。
方法: 应用抑制性消减杂交技术构建和筛选耐药淋病奈瑟菌差异DNA 消减文库。
结果: 从削减文库中随机挑取的96个克隆,发现其中有47个克隆仅能与tester DNA 探针杂交,而不能与driver DNA 探针杂交。
结论: 这些克隆中载有特异基因片段,它们为RS M292C4基因组DNA 所特有,可能代表某些淋病奈瑟菌新基因。
[关键词] 淋病奈瑟菌; 耐药性; 差异基因Molecular b ase of antimicrobial resistance of Neisseria GonorrhoeaeJi Mingchun ,Chen Hongju ,Yan Hua ,et al .Department o f Microbiology and Immunology ,Yangzhou Univer sity ,Yangzhou 225001[Abstract ] Objective :T o study the mechanism of chrom os ome -mediated antimicrobial resistence of Neisseria gon 2orrhoeae (NG ).Methods :Using a technique kn own as suppressive subtractive hybridization to construct and screen thelibrary which contains the differential genes between antimicrobial resistance strain and standard strain of NG,and then ,the antimicrobial resistance related genes were cloned.R esults :Antimicrobial resistance of NG subtractive library with high subtractive efficiency was set up success fully.T he am plified library contained 2500positive clones.T he 47clones that hybridized only to the subtracted probe were strong candidates for differential genes of antimicrobial resis 2tance NG .Conclusion :T he constructed DNA subtractive library of antimicrobial resistance NGis a highly efficient one and lays s olid foundation for screening and cloning relational genes of drug resistance of NG .[K ey w ords ] Neisseria gonorrhoeae ;antimicrobial resistence ;genes 淋病奈瑟菌对抗生素曾经十分敏感,由于淋病奈瑟菌的变异和适应,以及抗生素的广泛不规则使用,淋病奈瑟菌逐步产生对抗生素的耐药性1。
为较全面的探索淋病奈瑟菌对抗生素耐药性的分子基础,我们首先采用抑制性消减杂交技术对淋病奈瑟菌耐药的机制从基因组水平上进行研究。
1 材料和方法1.1 细菌菌株 淋病奈瑟菌WH O 标准参考菌株A (WH O -A )和RS M292C4菌株由Hafizah 博士惠赠。
RS M292C4菌株为一临床分离耐药菌株,分离自南非德班ST D 诊所就诊的一名重复感染男性急性尿道炎患者。
淋病奈瑟菌菌株分离、鉴定的方法按文献方法进行2。
两株淋病奈瑟菌均不产生β-内酰胺酶,不含有质粒,它们的最小抑菌浓度见表1。
表1 细菌菌株及其最小抑菌浓度(MIC ,μg Πml )WH O -A RS M292C4青霉素 0.008>4.0四环素 0.25 4.0头孢曲松<0.00050.004环丙沙星0.01616.0大观霉素1282561.2 主要生化试剂 PCR -Select Bacterial G en ome Subtraction 试剂盒为Clontech 公司产品,Rsa I 等限制性内切酶为R oche 公司产品,p GE M -T easy 线性化质粒载体为Prom oga 公司产品,Megaprimer DNA labelling sys 2tems 和dCTP -32P 为Amersham 公司产品。
测序采用Pharmarcia Biotech 公司的A LFT M DNA Sequencer 系统。
1.3 细菌培养及抗药性测定 细菌株培养采用G C 琼脂平板(Oxiod ,England )含10%Is oVitale X (Becton Dickin 2s on ,C ockeysville ,M D ),37℃6%C O 2培养24小时。
抗生素敏感性实验采用平板稀释法测定最小抑菌浓度(MIC )2。
1.4 细菌染色体DNA 的制备 将淋病奈瑟菌菌株转种于G C 琼脂平板,6%C O 2、37℃培养24小时后,收集菌苔于1.5ml 无菌离心管内,以CT AB ΠNaCl 法抽提细菌染色体DNA ,测定基因组DNA 浓度3。
1.5 抑制性消减杂交4 以WH O -A 参考标准菌株基因组DNA 为参照(driver ),RS M292C4菌株基因组DNA 为样本(tester )。
(1)基因组DNA 经RsaI 酶切后与两种接头连接:将样本与参照基因组DNA 2μg 与30单位Rsa I 及酶切缓冲液组成总体积40μl 反应体系,37℃8小时后,用M inE lute K it 提纯,并溶于5μl 水中。
以1.8μl 水稀释1.2μl 样本基因组DNA 后,分为两组,分别444China J Lepr Skin Dis.Oct 2003,V ol.19,N o.5图1 细菌基因组DNA 质量分析 A 、特异性扩增NspA 基因:2%琼脂糖凝胶电泳可见分子量为380bp 的特异性条带。
Lane 1:Marker XI V (R oche );Lane 2:RS M292C4;Lane 3:WH O -A 。
B 、纯化基因组DNA (1%琼脂糖凝胶电泳)Lane 1:Marker II ;Lane 2:RS M292C4;Lane 3:WH O -A 。
图2 S outhen blot 分析消减的有效性 A 、以非消减杂交T esterPCR 产物(T -U )为探针;B 、以消减杂交T ester PCR 产物为探针(T -S )。
Lane1为Rsa I 酶切Driver DNA ;Lane2为Rsa I 酶切Driver DNA 。
与接头adaptor1或adaptor2R 连接,16℃反应过夜后进行连接效率检测。
(Adaptor1:5’CT AA T ACG ACT C AC 2T A T AGGG CT CG AG CGG CCG CCCGGG C AGG T 3’,3’GG C 2CCG T CC A5’;Adaptor2R :5’CT AA T ACG ACT C AC 2T A T AGGG C AG CCTGG T CG CGG CCG ACCT 3’,3’G CCG 2G CT CC A5’);(2)两次消减杂交:在鉴定连接效率满意后,将连接有接头1和接头2R 的RS M292C4基因组DNA 1μl 分别与2μl RsaI 酶切WH O -A 参照基因组DNA 在63℃杂交6小时后,立即将两组经过第一次消减杂交的体系混合,另加变性的参照基因组DNA 2μl 63℃杂交过夜。
加100μl 稀释缓冲液,置68℃7min 后,-20℃贮存;(3)两次抑制PCR (巢式PCR )及抑制效率检测:取1μl 稀释后的第2次杂交产物,在50advantage cDNA 聚合酶作用下,以adaptor1、adaptor2R 的外侧序列为5’和3’引物(PCR Primer 1:5’CT AA T ACG ACT C AC 2T A T AGGG C 3’,进行第一次PCR 扩增。
取1μl 第一次PCR 产物经1:40稀释后取1μl ,在50advantage cDNA 聚合酶作用下,以adaptor1、adaptor2R 的内侧序列Nested Primer1、Nested Primer2R 分别为5’和3’引物(Nested Primer1:5’T CG AG CGG CCG CCCGGG C AGG T 3’;Nested Primer2R :5’AG CG TGG T CG CGG CCG AGG T 3’;)进行第二次PCR 扩增,并进行PCR 产物消减效率检测。
1.6 DNA 消减文库的构建、扩增 取2μl PCR 产物及1μl p GE M -T easy 线性化质粒载体,在4单位T 4连接酶的作用下,按1:1摩尔比例建立10μl 反应体系,4℃反应过夜后,进行消减文库消减效率的鉴定。
采用Megaprimer DNA labelling systems (Amersham ),按说明书操作,以dCTP -32P (Amersham )分别标记经参照DNA 消减杂交和非消减杂交的driver 第2次抑制PCR 产物,制成探针,对RsaI 酶切的tester 和driver DNA 进行S outhen blot 分析,具体方法参照文献。
取2μl 上述连接反应产物加入含β-巯基乙醇的50μl 感受态大肠杆菌T OP10F ’中,经水浴、热休克,另加250μl S OC 液,37℃300rpm 摇菌1小时,取200μl 菌液涂布于含50ng Πml 氨苄青霉素的LB ΠX -gal ΠIPTG 培养板上,37℃培养18小时。
1.7 细菌基因组DNA 消减文库的初步筛选、克隆鉴定 记数培养板中直径大于1mm 的白色及蓝色菌落数,随机挑取白色菌落,加入含氨苄青霉素LB 培养基的96培养板孔中,37℃振摇培养过夜,提取质粒,以nested primer 1和nested primer 2R 为引物进行PCR 扩增,分析插入片段。