大鼠促黄体生成素(LH)酶联免疫分析
大鼠胃促黄体生成素及其受体的免疫组化及原位杂交研究(1)(精)
大鼠胃促黄体生成素及其受体的免疫组化及原位杂交研究(1)【摘要】目的：探讨大鼠胃组织中是否表达促黄体生成素（LH）及其受体(LHR), 为进一步研究LH对胃的功能调节提供理论依据. 方法：采用免疫组织化学SABC和原位杂交的方法进行研究. 结果：在大鼠胃底腺的壁细胞和主细胞呈LH和LHR免疫反应阳性. 阳性物质分布于细胞质和细胞膜上，细胞核呈阴性反应. 上述细胞同样含有LH和LHR mRNA杂交信号，信号物质亦分布于细胞质内，细胞核呈阴性反应. 结论：大鼠胃壁细胞和胃主细胞既能产生LH，又能表达LHR，说明LH对胃壁细胞和胃主细胞功能作用可能是通过旁分泌或自分泌的作用来实现的. 【关键词】黄体生成素免疫组织化学原位杂交胃底腺0引言LH(luteinizing hormone, LH)及其受体(luteinizing hormone receptor, LHR)可以在下丘脑－垂体－性腺轴之外表达已经被公认. 我们先前的实验已经证明，大鼠颌下腺的浆液性腺泡上皮细胞能够表达LH及其受体［1-2］，但作为消化系统最重要器官之一的胃组织是否表达LH及其受体，目前尚未阐明，本实验采用免疫组织化学和原位杂交等技术对该问题进行了研究. 1材料和方法 1.1材料正常雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自第四军医大学试验动物中心；LH mAb购自美国ZYMED公司；LHR多克隆抗体、SABC试剂盒与敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ型为武汉BOSTER公司产品；购自TaKaRa公司；地高辛标记随机引物标记试剂盒购自Roche; Hind Ⅲ，EcoRⅠ内切酶购自New England Biolabs公司；胶回收试剂盒购自Promega公司；DAB显色试剂盒购自北京中山试剂公司. 1.2方法 1.2.1LH及其受体的免疫组织化学SABC法SD大鼠术前晚禁食不禁水，经腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，取出胃组织立即放入Bouins液中固定，用石蜡包埋后将组织蜡块切成4 mm的切片，并将切片贴附于APES处理过的载玻片上，烘干备用. 将切片进行二甲苯脱蜡，先后各10 min，无水乙醇5 min，加入30 g/L甲醇中20 min以去除内源性过氧化物酶，然后按SABC法进行LH及其受体的免疫组织化学染色，第一抗体：LH抗体（1∶500稀释）和LHR抗体（1∶300稀释），在4℃冰箱孵育过夜，第二抗体: LH和LHR分别为生物素标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(1∶200稀释)，室温孵育2 h. SABC复合物（1∶200稀释）室温孵育30 min. DAB显色10~15 min，蒸馏水终止反应，剃度乙醇脱水，透明二甲苯两次，各10 min，中性树胶封片. 用正常兔血清取代第一抗体进行孵育作阴性对照. 1.2.2LH及其受体的标记探针根据文献产生的克隆制备探针，分别从LH及其受体的上切下最初的DNA片段，长度分别为150，650 bp，并进行回收，采用随即引物标记法进行标记，具体方法按Roche公司的地高辛标记试剂盒进行：用灭菌去离子蒸馏水稀释1 μg DNA至总体积16 μL；把DNA瓶置于沸水中，水浴10 min. 然后，迅速冰浴3 min以上，使DNA热变性；加4 μL DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再1000 g离心5 min，置37℃水浴反应过夜，时间越长，产量越高. 延长反应时间至20 h可明显增加地高辛标记DNA的产量，并加入0.2 mmol/L EDTA 2 μL以终止反应，置-20℃保存备用. 1.2.3LH及LHR mRNA原位杂交程序用上述方法麻醉动物后，取出胃组织立即放入用Bouins液（内含1g/L DEPC）中固定，整个制片过程均防RNA酶污染，切片厚度为4μm，将切片进行二甲苯脱蜡，先后各15 min,剃度乙醇水化，加入30 g/L甲醇中20 min以去除内源性过氧化物酶；胃蛋白酶活性37℃消化30 s，以增加探针的穿透力；4 g/L多聚甲醛终止反应5 min，以终止蛋白酶K的作用；每张切片滴加含2.0 mg/L地高辛标记探针的原位杂交液30 μl，置湿盒中42℃杂交20 h；分别用37℃预热的2×SSC，0.1×SSC洗涤5 min×3，10 min×2；滴加小鼠抗地高辛抗体37℃，2 h，0.5 mol/L TBS洗涤5 min×3；滴加生物素化羊抗小鼠IgG 37℃ 1 h，0.5 mol/L TBS洗涤5 min×3；滴加ABC 37℃ 30 min. 最后用 DAB显色液显色，室温10~15 min，镜下观察其显色情况，水洗终止反应. 梯度乙醇脱水，中性树胶封片. 阴性对照分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液，及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗体IgG进行孵育. 1。
小鼠黄体生成素LH酶联免疫分析
小鼠黄体生成素(LH)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 96T70pg/ml-2400pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中黄体生成素(LH)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠黄体生成素(LH)水平。
用纯化的小鼠黄体生成素(LH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入黄体生成素(LH)，再与HRP标记的黄体生成素(LH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的黄体生成素(LH)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠黄体生成素(LH)浓度。
标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
小鼠促黄体激素LH酶联免疫分析
小鼠促黄体激素(LH)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T70pg/ml-2400pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中促黄体激素(LH)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠促黄体激素(LH)水平。
用纯化的小鼠促黄体激素(LH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促黄体激素(LH)，再与HRP 标记的促黄体激素(LH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的促黄体激素(LH)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠促黄体激素(LH)浓度。
试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶6ml×1瓶12孔×8条6ml×1瓶6ml×1瓶6ml×1/瓶789终止液6ml×1瓶2 酶标试剂标准品（4800pg/ml）0.5ml×1瓶3 酶标包被板4 样品稀释液5 显色剂A液6 显色剂B液标准品稀释液 1.5ml×1瓶1份10 说明书11 封板膜12 密封袋2张1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2400pg/ml 1200pg/ml 600pg/ml 300pg/ml 150pg/ml 5号标准品4号标准品3号标准品2号标准品1号标准品150µl的原倍标准品加入150µl标准品稀释液150µl的5号标准品加入150µl标准品稀释液150µl的4号标准品加入150µl标准品稀释液150µl的3号标准品加入150µl标准品稀释液150µl的2号标准品加入150µl标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
大鼠促黄体激素(LH)elisa试剂盒使用说明书
大鼠促黄体激素(LH)elisa试剂盒使用说明书检测范围：48T1.5 ng/L - 40 ng/L使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中促黄体激素(LH)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠促黄体激素(LH)水平。
用纯化的大鼠促黄体激素(LH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促黄体激素(LH)，再与HRP标记的促黄体激素(LH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的促黄体激素(LH)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠促黄体激素(LH)浓度。
试剂盒组成1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
促黄体生成素(LH)测定试剂(荧光免疫层析法)产品技术要求万孚
1.性能指标
1.1外观检查
外观应平整，标识清晰，各组分齐全，液体无渗漏。
1.2物理检查
膜条宽为 4.0±0.5mm；液体移行速度应不低于10mm/min。
1.3准确度
用参考品作为样本进行测定，其测定结果的相对偏差（B ias）不应超过±10%。
1.4最低检出限
应不大于1mIU/mL。
1.5线性
在1mIU/mL～100mIU/mL 的范围内，线性相关系数r≥0.9900。
1.6精密度
1.6.1批内精密度
用同一批号的试剂分别测定 2 个不同浓度的样本，其测定结果的变异系数（CV）应不大于15%。
2.6.2 批间精密度
用三个不同批号的试剂分别测定2 个不同浓度的样本，其测定结果的变异系数（CV）应不大于15%。
1.7特异性
1.7.1与促卵泡生成素（FSH）
浓度不低于200IU/L 的FSH，测定结果应不大于1mIU/mL。
1.7.2与促甲激素（TSH）
浓度不低于200mIU/L 的TSH，测定结果应不大于1mIU/mL。
1.7.3与人绒毛膜促性腺激素（HCG）
浓度不低于1000IU/L 的HCG，测定结果应不大于1mIU/mL。
人黄体生成素释放激素(LHRH)酶联免疫分析
人黄体生成素释放激素（LHRH）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人LHRH，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6个月预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中LHRH 含量。
说明1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
概述黄体生成素释放激素（LHRH）也称为促性腺激素释放激素GnRH，是下丘脑分泌的一种肽类物质，由腺垂体嗜碱细胞分泌的两种促性腺激素之一，是主要作用于黄体生成（女性）及睾丸间隙细胞的一种糖蛋白激素，作用于垂体产生LH。
LHRH是由9种不同氨基酸残基组成的10肽，序列为Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly。
其α-亚单位为89个氨基酸组成的肽链，与滤泡刺激素的相同；β-亚单位也是由115个氨基酸组成，但是氨基酸序列与滤泡生成素不同，分子量为26000；糖基结合在β-亚单位的第13和第30位氨基酸上，是其生物活性所必需。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗LHRH抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗LHRH抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的LHRH呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1.酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。
2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。
3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
促黄体生成素(LH)测定试剂盒(酶联免疫法)产品技术要求beifang
促黄体生成素（LH）测定试剂盒(酶联免疫法)适用范围：用于体外定量测定人血清中黄体生成素（LH）的含量。
1产品型号/规格及其划分说明1.1产品型号试剂盒包装规格为48人份/盒、96人份/盒，具体组成见表1：表1 试剂盒主要组成成分2.1外观和物理检查试剂盒应组分齐全，内外包装均应完整，标签清晰，液体试剂无渗漏。
各组分装量不少于表1中要求。
2.2准确性试剂盒内校准品与相应浓度的国家标准品同时进行分析测定，用双对数（Log-Log）数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行；以LH国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测值与标示值的效价比应在0.900～1.100之间。
2.3剂量-反应曲线的线性在2.0~100 IU/L范围内，用Log-log数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数（r）应不小于0.9900。
2.4 精密度2.4.1分析内精密度（CV%）应不大于15.0%。
2.4.2分析间精密度（CV%）应不大于20.0%。
2.4.3批间精密度（CV%）应不大于20.0%。
2.5 最低检出限应不高于1.0 IU/L2.6 质控品测定值每次检测结果均应在允许范围之内。
2.7 特异性检测浓度为500 mIU/L的促甲状腺素（TSH），在本试剂盒上的测定结果应不高于1.0 IU/L。
检测浓度为1000 IU/L的促卵泡生成素（FSH），在本试剂盒上的测定结果应不高于1.0 IU/L。
检测浓度为100000 IU/L的人绒毛膜促性腺激素（HCG），在本试剂盒上的测定结果应不高于1.0 IU/L。
2.8 稳定性2.8.1 效期末稳定性试剂盒在2~8℃放置12个月，测定结果应符合上述2.1、2.2、2.3、2.4.1、2.4.2、2.5、2.6要求。
2.8.2 热稳定性将试剂盒在37℃条件下放置7天，测定结果应符合上述2.1、2.2、2.3、2.4.1、2.4.2、2.5、2.6要求。
促黄体生成素(LH)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)产品技术要求北京北方
促黄体生成素（LH）测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)适用范围：本产品用于体外定量测定人血清中的促黄体生成素（LH）的含量。
1.1 包装规格：100测试/盒，200测试/盒1.2主要组成成分注：1.不同批号试剂盒中各组分不可以互换使用。
2. 校准品和质控品具有批特异性，具体浓度见瓶签。
2.1外观试剂盒各组分应齐全、完整，液体无渗漏；磁微粒试剂摇匀后为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集；其他液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；包装标签应清晰、易识别。
2.2装量各组分装量应不低于标示体积。
2.3溯源性根据GB/T21415-2008及有关规定，提供试剂盒内校准品的来源提供了试剂盒内校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容，溯源至中国食品药品检定研究院提供的国家标准品（编号：150531）。
2.4线性在[1.0，250.0]IU/L范围内，用双对数数学模型拟合，相关系数r应不低于0.9900。
2.5空白限应不高于0.5IU/L。
2.6准确性试剂盒内校准品与相应浓度的LH国家标准品（编号：150531）同时进行分析测定，用适当的数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行；以LH 国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测值与标示值的效价比在0.900~1.100之间。
2.7精密度2.7.1分析内精密度质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于8.0%。
2.7.2批间精密度在三个批次产品之间，质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%。
2.8质控品的测定值均应在规定的质控范围内。
2.9特异性浓度不低于200IU/L的卵泡生成素（FSH）、浓度不低于200mIU/L的促甲状腺素（TSH）、浓度不低于1000IU/L的人绒毛膜促性腺激素（HCG），分别在本试剂盒上的测定结果均应不高于0.5IU/L。
2.10稳定性试剂盒在2~8℃保存，有效期为12个月，在有效期满前后两个月内，检测试剂盒的外观、装量、线性、空白限、准确性、分析内精密度、质控品的测定值，应符合2.1、2.2、2.4、2.5、2.6、2.7.1、2.8的规定。
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大鼠促黄体生成素(LH)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T
80pg/ml-2400pg/ml
使用目的：
本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中促黄体生成素(LH)含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠促黄体生成素(LH)水平。
用纯化的大鼠促黄体生成素(LH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促黄体生成素(LH)，再与HRP标记的促黄体生成素(LH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的促黄体生成素(LH)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠促黄体生成素(LH)浓度。
试剂盒组成
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，
然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，
即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。