显微制片技术

显微制片技术一、粉末制片法1．粉末的制备选取有代表性的样品适量，剪成长约0.1cm的小段，置50~60℃的烘箱中干燥（含挥发油的药材温度应更低，控制在30~40℃），然后用粉碎器粉碎，常用的粉碎器有冲窝、铁碾、微型粉碎机等。

粉碎后的粉末过50~60目筛，成药则应过100目筛，置干净的瓶中备用。

制备粉末时应注意不得有其它的杂物混入，样品应全部过筛，不得留有残渣弃取，过筛后的粉末需充分混匀方可装片。

2．制片方法根据需要不同，可作成临时或永久制片。

∙（1）临时制片：作临时观察用，随用随作，通常仅能保存1~2周。

直接封片法不经任何处理，直接用于封藏液装片后即可观察。

常用的封藏液有如下几种：∙a．水：常用蒸馏水。

用于观察淀粉粒等多糖类物质，但易引起淀粉粒膨胀变形，欲测定粉粒大小时不宜用水作封藏剂。

∙b．稀甘油：用于观察糊粉粒、淀粉粒及其它多糖类物质，为显微制片中最常用的封藏剂。

经水合氯醛透化的片子多加稀甘油一滴，还可防止水合氯醛结晶的析出。

配制时应注意冬天气温低，粘度小，装片时易产生气泡，可适当配浓一点，而夏天则相反，可配稀一点。

∙c． 50%甘油酒精：适用范围同上，透明度较上者强。

∙d．甘油醋酸液：专用于观察淀粉粒的形态，是目前观察淀粉粒最理想的封藏剂，可使淀粉粒保持原来的状态而不膨胀变形，便于测定其大小。

∙e．乙醇：主要用于观察菊糖及橙皮柑结晶。

因乙醇易挥发，故装片后应立即观察，放置稍久则乙醇挥发产生大量汽泡。

∙f．水合氯醛：一般作为透明剂，在观察菊糖时，用其作为封藏液，不加热，装片后立即观察，往往能得到比乙醇装片更为理想的效果。

方法：取清洁载玻片，滴加封藏剂1～2滴，用解剖针或火柴杆挑取粉末少许与封藏剂混匀，然后用镊子夹住盖玻片的边缘中部或用食指及拇指拿住盖玻片的边缘，将其一侧边沿压在封藏液旁的载玻片上，慢慢放下至水平位置，用滤纸屑清洁载片即可。

装片过程中应注意封藏液要适量，若不足则封藏液不能充满盖片；过多则溢出盖片，使盖玻片浮动，并易将封藏液溢到盖玻片上面。

盖玻片上面应干燥，不得将封藏液溢到上面，否则会污染物镜，并降低盖玻片的透明度，若已弄到盖片上面，则只能洗后重新装片，不得擦后勉强观察。

若封藏液不足未充满盖片，可在盖片一侧边缘的载片上滴加少量的封藏液；若封藏液过多溢出盖片或引起盖片浮动，则用小滤纸条从一侧面吸取过多的封藏液，使盖片紧贴载片，不再浮动。

在盖片过程中，常因不熟练或不注意而在片子中留下气泡，可用解剖针将盖玻片一侧挑起，再轻轻放下，以除去气泡。

另外，有的封藏液黏度较大（如甘油），不易渗透到细胞组织中，常在厚壁细胞腔中留下气泡，若先用少量乙醇润湿粉末，再滴加封藏剂装片，则可消除气泡。

水合氯醛透化装片用水合氯醛加热处理除去粉末中所含的淀粉粒、叶绿素、树脂、蛋白质、油脂、色素、挥发油等物质，并使细胞膨胀、透明，以利于细胞及组织的观察。

方法如下：取水合氯醛溶液1～2滴于载玻片上，挑取粉末少许，混匀，于酒精灯上微热透化，并以解剖针搅拌，补充2～3次水合氯醛溶液（勿使溶液蒸干）透化好后加稀甘油1～2滴混合，盖片，清除盖玻片周围多余的药液。

（2）特殊处理制片a．漂白：若粉末中色素太多，色泽太暗，不便观察时，可预先用漂白剂浸渍处理，再以沸水及冷水洗涤，离心分离，然后挑取粉末适量，按前述方法制片。

常用的漂白剂有过氧化氢、氯化碱液（碳酸钠与漂白粉混合而成）等。

b．脱脂：一些含脂肪较多的中药（如种子类中药），即使用水合氯醛透化也不便观察，可预先进行脱脂，然后再按一般方法制片观察。

脱脂方法有两种，一种是将粉末放于两层滤纸间挤压以去油脂，另一种是将粉末用某些溶剂（氯仿、乙醇－乙醚混合液等）浸渍处理。

c．解离：若粉末木化组织较多，细胞彼此不易分离时，可用5％氢氧化钾浸泡几小时或在水浴中加热浸渍，使组织崩解后在制片观察。

（2）永久制片：粉末永久制片方法较多，这里仅简单介绍离心管操作法制片。

脱水取粉末0.3～0.5g，置离心管中，分步加入各级浓度的酒精进行脱水，每步三分钟，用细玻璃搅拌，每次均用离心机沉淀，倾去酒精，各级酒精浓度依次为30％、50％、70％。

染色于70％酒精脱水后的粉末中加入番红染液剂，搅匀，染色30min，花类、叶类及单子叶植物药材可将染色时间缩短为10～15min。

离心分离，去上层染液，沉淀用70％酒精洗涤。

染好的粉末逐步用80％、95％、100％的酒精脱水，每步5min。

透明与封片粉末逐步用25％、50％、75％、100％的二甲苯透明，每步3min，搅拌，离心分离。

去上层二甲苯液，速加入加拿大树胶（预先用二乙苯溶化好）约0.5～1ml，用玻棒搅拌均匀。

用吸管吸取一滴于载玻片上，加盖玻片封藏，并贴上标签，低温防尘干燥即可。

中药显微化学鉴别法显微化学是一种极灵敏的定性化学鉴别方法，由于使用了显微镜，故能够观察到在肉眼看来几乎是完全隐蔽的反应，从而大大增加了反应的灵敏度，准确地检查出显微组织切片中一系列不同地物质，这是一般化学鉴定方法所不能做到的。

通常显微化学的方法都是极其简单、精练，同时又是确切可信的。

中药显微化学鉴别即是利用显微化学的方法来决定细胞壁及其内含物的化学物质，或分辨组织结构，从而达到鉴别中药的目的。

一、实验方法1．药材切片或粉末试验法将药材切片或粉末置于载玻片上，滴加适当试液，加盖玻片，在显微镜下观察产生的结晶或沉淀，以及特殊的颜色反应等。

若为切片，还需要观察反应的部位，用确认参加反应的成分在组织中的分布。

供作试验的切片一般是用徒手切片。

切片应稍厚，约在20～40um之间，若太薄则可能因所要观察的内容物含量太少，而不易显示出明晰的结果。

对于干药材，切片前常需经过各种软化处理，但应注意，所进行的处理应对要检查的成分无影响，如检查菊糖或粘液质时不能用水处理，检查挥发油时不能用高浓度的乙醇或蒸煮法处理，检查钟乳体不能用醋酸处理。

2．浸出液试验法（显微结晶法）取药材粗粉加适当溶剂浸渍，用吸管吸取浸出液，滴加一滴于干净的载玻片上，在其旁边再滴加反应剂一滴，用玻棒尖端沟通此两滴溶液，注意勿搅和此溶液（若直接将试剂加到浸出液上，则可能因反应过快而析出极细小的结晶），放置片刻，加盖玻片，于显微镜下观察两滴溶液接触处形成的结晶，注意结晶的形状及颜色。

3．微量升华法利用中药中所含的某些化学成分在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察升华物得形状、颜色等。

必要时可用显微熔点测定仪测定结晶得熔点。

此外，还可以进行一些化学反应，作为鉴别特征。

方法：取一与载玻片大小相同的金属片，放在有圆孔的石棉板上，金属片上放一高约0.8cm，直径约1.5cm的小金属圈，对准石棉板的圆孔。

圈内放药材粉末适量，铺成一均匀薄层，圈上放一载玻片。

在石棉板圆孔下用酒精灯缓缓加热，至粉末开始变焦，载玻片上有升华物凝结时，去火冷却。

取下载玻片，反转后放于显微镜下观察或加适当化学试剂，观察其变化。

对于含水分较多的药材。

则应为稍加热，待水分挥发后再盖上载玻片，获取升华物。

若没有以上设备，可改用一简化方法：即在一载玻片上放上药材粉末，铺成一薄层，在载玻片两端各方一段小玻棒或火柴杆，再盖上一载玻片，下面用酒精灯加热升华。

1．细胞壁植物细胞壁主要组成是纤维素，它形成了细胞壁的框架。

由于环境的影响及细胞生理机能的不同，在纤维素框架中常常存积有其他物质，使细胞壁发生各种不同的特化，如木质化、木栓化、角质化、粘液化、硅质化、几丁质化等。

（1）纤维素细胞壁：在纤维素细胞壁中，纤维素常与半纤维素同时存在。

纤维素是一种化学性质比较稳定，能耐酸、碱及其他多种溶剂的多糖类物质，由链状系列的葡萄糖基通过氧原子的相互结合而成。

从构型上来看，纤维素很像直链淀粉，但纤维素的单糖单位为β-葡萄糖，且分子量较淀粉大。

细胞壁纤维素框架的基本组成单位是一些长短不等的链状纤维素分子，这些分子有规则地平行排列，聚集在一起，称微团。

由微团组成一种丝状的微团系统，称微纤丝，这种结构可在电子显微镜中看到。

微纤丝又聚集成较粗的纤丝，称为大纤丝，大纤丝在光学显微镜中即能看到。

由于纤维素分子有规则的排列成晶格状，使纤维素细胞壁具有类似晶体的性质，在偏光显微镜下可显出强烈的各向异性。

纤维素细胞壁常见的显微化学反应有如下几种。

铜氨溶液反应于材料中加新配制的铜氨溶液，纤维素细胞壁逐渐膨胀而后溶解。

纤维素在一般溶剂中都不溶解，但可溶于铜氨溶液。

碘－硫酸反应滴加一滴1％碘液于材料中，再加一滴66.5％硫酸，纤维素细胞壁呈蓝色，细胞壁中纤维素越多，其他成分愈少，则反应愈明显，对于木质化强烈的细胞壁，反应被掩盖不能看出。

氯化锌碘液反应材料加氯化锌碘液一滴，纤维素细胞壁被染成紫色（木化或栓化细胞壁被染成黄色或棕色）。

此为目前检查纤维素细胞壁最常用的反应，在大多数情况下，氯化锌碘液较碘－硫酸更为有效。

（2）木质化细胞壁：木质化细胞壁是由于细胞壁纤维素框架中沉积了大量木质素所致。

木质素是丙酸苯脂类的一种聚合物，由于它的沉积，可使细胞坚硬牢固，增加植物支持重力的能力。

木质化细胞壁常用的显微化学反应有如下几种：硫酸苯胺反应加硫酸苯胺试液一滴，木质化细胞壁被染成鲜艳姜黄色。

为了避免细胞中含的草酸钙结晶被溶解，可改用醋酸苯胺试液，亦显黄色。

这种颜色较为稳定，可制成永久制片。

间苯三酚反应加间苯三酚1～2滴使材料湿润，稍放置或微热后，加浓盐酸一滴，木质化细胞壁被染成红色或紫红色。

颜色的深浅视木化程度而定。

此为检查木质化细胞壁最常用的反应。

有时但用盐酸即可使细胞壁产生红色或紫红色，这表明细胞壁本身就含有间苯三酚类化合物。

高锰酸盐反应将切片放入盛有1％高锰酸盐的小杯中放置5分钟，切片被染成棕色。

倒出溶液，换水洗涤切片，将切片移至稀盐酸中至几乎完全褪色为止。

取出用清水洗涤，置于载玻片上，滴加一滴氨液，木质化细胞壁呈鲜红色。

这种反应对双子叶植物十分明显，对裸子植物的组织不起反应，单子叶植物往往只能产生黑褐色。

（3）木栓化和角质化细胞壁：木栓化喝角质化分别是在细胞壁中渗入了木栓质或角质的结果，通常是植物保护组织细胞壁所具有的特化形式。

木栓质和角质均为高分子脂肪酸的聚合物，二者性质相似，其显微化学反应亦基本一致。

氯化锌碘液反应木栓化及角质化细胞壁被染成黄色或棕色。

木质化细胞亦能显同样的颜色，但切片若预先用次氯酸钠消毒液处理1～2小时，则木栓化及角质化细胞壁染成黄色，木质化细胞壁染成紫色。

苏丹红Ⅲ染色切片加苏丹红Ⅲ试液，稍放置或微热，木栓化及角质化细胞壁均显桔红色、红色或紫红色。

再加20％氢氧化钠，呈，加热则木栓质溶解呈黄色滴状，而角质化细胞壁不改变形状。

（4）粘液化细胞：为细胞壁中纤维素等成分发生变化而成为粘液，此粘液在细胞表面常呈固态，吸水膨胀后则成粘滞状态。

粘液化细胞壁遇玫红酸钠醇溶液呈玫瑰红色，遇钌红试液呈红色。