原位杂交步骤-自己整理的1
昆虫原位杂交
昆虫原位杂交一、昆虫原位杂交是什么呢？哎呀，小伙伴们，昆虫原位杂交可有趣啦！简单来说呢，就是一种在昆虫身体里直接做的杂交技术。
你想啊，昆虫那么小一只，要在它身体里搞这么复杂的事情，就像在一个小小的城堡里进行一场神秘的魔法实验一样。
这个技术啊，就像是给昆虫细胞里的基因们安排了一场相亲大会。
科学家们呢，要找到那些来自不同地方的基因“小帅哥”和“小美女”，然后让它们在昆虫细胞这个特殊的“相亲场地”里见面，看看能不能擦出爱的火花，组合成新的基因组合。
二、昆虫原位杂交的步骤有哪些呢？1. 准备工作首先得抓昆虫啦，不过这可不能乱抓哦。
要根据研究的目的，选择合适的昆虫种类。
比如说，如果是研究某种蝴蝶翅膀颜色的基因，那就得专门去找那种蝴蝶。
然后呢，要把昆虫处理一下，让它的细胞能够乖乖听话，就像要把调皮的小孩子哄好，才能让他们配合做游戏一样。
还得准备各种试剂呢。
这些试剂就像是做菜的调料，少了哪一种都不行。
像有一些可以让细胞的结构更清晰的试剂，还有能标记基因的特殊试剂。
2. 杂交过程要把昆虫的细胞或者组织小心翼翼地放在一个特制的环境里。
这个环境的温度、湿度什么的都得控制得很好，就像给小婴儿营造一个舒适的小床一样。
然后把那些带有标记的基因片段放进去，让它们去找自己的“另一半”。
这个过程有点像在大海里捞针，但是科学家们有自己的小窍门，能让这个过程更顺利。
在杂交的时候，还要时刻盯着，就像守着一个小火炉，火候不对就不行。
要保证基因们能够准确地结合，不能让它们乱搭伙。
3. 检测环节杂交完了之后，要看看有没有成功呀。
这时候就需要用到一些特殊的仪器了，这些仪器就像超级侦探一样，能够发现那些成功结合的基因组合。
如果没有检测到，那可能就得重新来一遍，就像做饭没做好，得重新下锅一样。
三、昆虫原位杂交有啥用呢？1. 研究昆虫的进化你知道吗？通过昆虫原位杂交，我们可以了解昆虫的基因是怎么变化的。
就像看一部昆虫家族的历史纪录片一样，能知道它们是怎么从古老的祖先慢慢变成现在各种各样的模样的。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2×SSC清洗10分钟；21）37℃，1×SSC清洗10分钟；22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2×SSC清洗10分钟；18）37℃，1×SSC清洗10分钟；19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
荧光原位杂交技术流程
荧光原位杂交技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!荧光原位杂交（FISH）技术流程。
1. 细胞制备。
收取培养细胞或组织切片。
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤(一)原位杂交1、溶液配置：（1）Hybridization buffer（20ml）：Formamide 10ml；20x SSC 5ml；Denhand’s2ml；100mg/ml yeast tRNA 50μL；10mg/ml salmon sperm DNA 1ml；Blocking regent 0.4g；DEPC-water 1.95ml。
（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。
（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。
（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。
（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。
（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。
（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。
（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；N BT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。
2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。
（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。
（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。
原位杂交操作流程3
原位杂交操作流程：步骤备注材料的固定和包埋1、固定：将花芽浸入20倍于材料的FAA固定液中，抽气除去材料表面附着的气泡直至材料沉于容器底部，4 °C过夜（24h-72h），然后保存于70%乙醇中。
100mlFAA固定液包含：乙醇50 ml 冰醋酸 5 ml 37% 甲醛溶液10 ml DEPC-H2O 35 ml2、脱水：材料经70%，80%，90%，100%，100%，100%乙醇脱水，每步60分钟。
3、透明：依次经25%二甲苯-75%乙醇，50%二甲苯-50%乙醇，75%二甲苯-25%乙醇，100%二甲苯，100%二甲苯，100%二甲苯，每步45分钟。
4、浸蜡：50%石蜡-50%二甲苯，42°C处理24h，重复此操作一次，移入60°C温箱，换入纯石蜡，60°C保温四天，每天换两次纯石蜡60°C石蜡过滤，超过62°C可能会破坏石蜡结构5、包埋：包埋时注意除气泡石蜡包埋块4°C可以保存1年以上切片1、载玻片：使用进口的处理好的载玻片。
2、切片展片：42°C粘片四天。
探针标记1、转绿反应（10µl）：线性化模板200-300ng（2µl）5x Transcription Buffer 2µl5x Labeling Mix 2µlRNApolymerase 1µlDEPC-H2O 2.5µlRnase Inhibitor 1µl37 °C or 42°C反应2小时2、收集探针：1µl 10mg/ml tRNA2.5µl 4M Licl75µl 100%乙醇，-20°C放置2小时，4°C，1,2000，30分钟70%乙醇洗涤沉淀，风干，溶于50µl DEPC-H2O中。
为使探针彻底溶解，可以在60°C 保温15分钟3、探针半定量：不同稀释倍数的探针和标准品点同样体积于尼龙膜，按照说明书进行显色。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交技术的具体步骤原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要方法。
它可以帮助我们了解基因在细胞中的定位和表达情况，进而揭示基因调控的机制。
本文将详细介绍原位杂交技术的具体步骤。
一、制备探针在进行原位杂交实验之前，首先需要制备合适的DNA或RNA探针。
探针是一段标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA序列，用于与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
制备探针的方法有多种，常见的包括随机引物标记法、PCR标记法和转录标记法等。
二、取样和固定在进行原位杂交实验时，需要采集待检测样品，并将其固定在载玻片上。
固定的目的是保持样品的形态结构和细胞核的完整性，以便后续的杂交反应能够准确地进行。
常用的固定方法有冷冻固定、乙醛固定和细胞固定等。
三、脱水和处理在固定完样品后，需要对其进行脱水处理。
脱水的目的是去除样品中的水分，使探针能够更好地与靶标DNA或RNA结合。
脱水处理通常采用浓度递增的乙醇溶液进行，如70%、85%和95%乙醇溶液。
四、杂交反应杂交反应是原位杂交技术的核心步骤。
在杂交反应中，将制备好的探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液的选择等。
一般来说，杂交温度较高可以提高探针与靶标的互补配对效率，但也可能导致非特异性杂交的发生。
五、洗涤和检测在杂交反应完成后，需要对样品进行洗涤，以去除非特异性杂交的探针。
洗涤的条件通常是选择适当的盐溶液和洗涤时间，以确保只有与靶标DNA或RNA互补配对的探针能够保留在样品中。
洗涤完成后，可以使用适当的检测方法来检测样品中的探针信号，如荧光显微镜、放射自显影等。
六、结果分析根据样品中的探针信号，可以进行结果的分析和解读。
通过观察探针的分布和强度，可以确定靶标DNA或RNA在细胞中的定位和表达情况。
此外，还可以通过对多个样品的比较分析，揭示基因的差异表达和调控机制。
原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以帮助我们研究基因组的结构和功能。
荧光原位杂交技术流程
荧光原位杂交技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在开展荧光原位杂交实验之前，需要做好充分的准备工作。
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荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
封闭缓冲液（blocking buffer）：10%羊血清、2%阻断剂（终浓度），两者溶于MABT；三者MABT:羊血清：10%阻断剂=7:1:2；也有用：1×PBT，2% sheep serum (vol/vol)，2 mg／ml BSA）1×Blocking reagent：用马来酸缓冲液将10×Blocking reagent稀释1×Blocking reagent。
此溶液需要随配随用，不可久放。
标准杂交缓冲液（standard hybridization）：5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)，0.02％SDS（w/v），1％Blocking reagent(取1/10体积的10×Blocking reagent)标准杂交缓冲液（含甲酰胺）：50%去离子甲酰胺，5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)，0.02％SDS（w/v），2％Blocking reagent(取1/5体积的10×Blocking reagent)蛋白酶K储液：10mg／ml；将蛋白酶K按10mg／ml溶于PBT中，分装成100ul的小包装，保存于－20℃。
使用浓度为10ug／ml。
（注：PBS不需要除酶，因为蛋白酶K可以降解RNase）抗地高辛荧光素偶联的抗体（Anti-digoxigenin-fluorescein，Fab fragments）保存及使用方法：1、激发最大波长（Excitation max）:494nm；发射最大波长（Emission）：523nmmax抗体冷冻干粉末，用1ml双蒸水进行溶解，其终浓度为200ug／ml，即200ng／ul。
注意事项：此保存液应该在使用前不久进行稀释，（Note: The stock solution should be diluted shortly before use）；2、以上保存液在2－8℃避光条件下，可以保存2个月。
保存液应避免反复冻融，分装后，保存于－20℃3、推荐使用含0.5%BSA（w／v）的PBS（pH7.4）对以上抗体保存液进行稀释；4、此抗体可以用来对地高辛标记的复合物进行检测，注意事项：在使用抗体之前，10000rpm离心5min，且在液面吸取需要的体积。
探针的制备过程：1、设计上下游引物，加酶切位点（HindⅢ、EcoRⅠ）和保护性碱基（3个保护性碱基），用来扩增目的基因片段，回收目的基因片段，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。
2、用限制性内切酶（HindⅢ、EcoRⅠ）对载体pSPT18（约1ug的量）进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的片段，溶于适量无菌水中。
设计上下游引物，扩目的片段为700～800bp长度的片度，回收连接T-载体，连接过夜，3、将pSPT18酶切回收后的片段与相应酶切的基因片段，按摩尔比例1:10左右进行混合，加入连接酶，16℃，连接过夜。
4、将以上的重组载体进行转化，选择具有氨苄青霉素抗性的培养基，37℃，培养13-15h，保存于4℃冰箱，再进行挑菌，接种于含1‰氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min条件下，摇菌过夜。
5、次日，用特异性引物做菌落PCR，确定插入目的基因片段重组成功的克隆，保存菌种，其余进行测序验证。
测序成功6、选择测序验证成功的相应菌液，进行扩大培养，回收重组质粒。
7、对重组质粒分别进行单酶切（HindⅢ、EcoRⅠ），使其线性化，并回收线性化的质粒DNA，以用于体外转录。
（如何回收较好？1、Purification of linear DNA can be achievedbyphenol/chloroform extraction followed by ethanolprecipitation.2、）8、选择插入片段5＇端酶切位点的酶(合成反义RNA)或3＇端酶切点的酶(合成正义RNA)。
对于本实验来说，用RNA聚合酶T7，对HindⅢ酶切的模板DNA进行体外转录，以产生可以检测CXCR7基因mRNA的反义RNA探针；用RNA聚合酶SP6，对EcoRⅠ酶切的模板DNA进行体外转录，产生用于阴性对照的正义RNA探针。
反应体系为20ul,所加模板DNA为1ug左右，10× NTPlabeling mixture 2ul、10×Transcription buffer 2ul、Protector RNase inhibitor 1ul、 RNA Polymerase SP6 orRNA Polymerase T7 2ul，将以上各个成分轻轻混合后，简单离心，在37℃下孵育2h(延长孵育时间并不能增加标记的RNA的产量；按每1ug模板，可以产生10ug探针RNA)。
9、向上述反应体系中，加入RNase-free的2ul DNaseⅠ，37℃保温15min,以消除模板DNA。
10、向上述反应液中，加入2ul 0.2M的EDTA (pH 8.0)以终止反应，RNA转录子可以通过琼脂糖凝胶电泳EB染色来进行分析。
11、标记好的探针，不能用苯酚\氯仿进行抽提，这样会导致探针分解。
标记好的探针可以在－15-－25℃，稳定保存至少一年；要避免反复冻融标记好的探针，可以对其进行小管分装，方便使用。
12、需要的试剂：RNA Dilution Buffer:DMPC处理的RNase-free的双蒸水:20×SSC:formaldehyde=5：3:2（需要配置新鲜的）；大飞传给我的：4）反应结束后加入30µLRNase free 水和30µL LiCl，离心混匀，-20℃1hr5）14000rpm，4℃离心5min，加入1mL 70% 乙醇；6）14000rpm，4℃离心15min，尽量弃上清；7）室温晾置5-6min：8）加入30µL DEPC H20，RNA sein 1µL，-80℃保存。
12、吸取少量标记好的探针，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测其质量。
好的探针应该会出现一个或两个分离的条带，而不是拖尾，如是拖尾意味着探针有所降解了。
探针标记：1、用地高辛标记的UTP在体外进行转录（载体pPST18），以获得正义和反义RNA探针，将其溶入无RNase的去离子水中。
探针转录体系如下：整体原位杂交步骤：胚胎的准备、固定与保存1、收集西伯利亚鲟的一定数量未受精卵和受精后各个发育时期的胚胎，用蛋白酶（浓度：）或手动医用镊子以去除其卵壳。
2、将未受精卵和各期胚胎加入10倍体积的4%多聚甲醛中，4℃过夜。
3、在PBS缓冲液中漂洗胚胎若干次，然后分别依次以不同比例(25%:75%、50%：50%、75%：25%)的甲醇∕PBS T，对胚胎进行梯度脱水，每次5min;再用100%甲醇洗一次，时间为5min，最后转至100%甲醇中，-20℃保存备用。
整体原位杂交步骤：原位杂交第一天：1、胚胎的复水在室温下进行以下实验操作，分别依次以75% MeOH / 25% PBS T、50% MeOH / 50% PBST、25% MeOH / 75% PBST洗胚胎，以上三操作每次清洗时间为5min；最后用100%PBST漂洗4次，每次5min。
2、用蛋白酶K消化处理及再固定室温下，以一定浓度（浓度:10µg/ml）蛋白酶K（用PBST稀释），处理各时期胚胎：最佳处理时间需根据胚胎发育时期而定（也有言24h以前的不用处理；而其他时期可以聊做参考其他鱼类的：如周励的鲫鱼小于5体节期可以不用处理、10体节期处理5min；24体节处理10min；对于斑马鱼：小于5体节期不用处理，10体节期处理1min、24h处理5min、48h处理15min；）。