_三腿一平台_组成的_基因打靶_评介2007年度诺贝尔医学奖
近几年诺贝尔生理学或医学奖获得者及其获奖理由
Байду номын сангаас 2007
美国科学家马里奥·卡佩奇和 奥利弗·史密西斯、英国科学 家马丁·埃文斯。这三位科学 家是因为“在涉及胚胎干细胞 和哺乳动物DNA重组方面的一系 列突破性发现”而获得这一殊 荣的。这些发现导致了一种通 常被人们称为“基因打靶”的 强大技术。这一国际小组通过 使用胚胎干细胞在老鼠身上实 现了基因变化。
2011 三位科学家分别是美国人布鲁斯·巴特 勒，卢森堡人朱尔斯·霍夫曼，以及加 拿大人拉尔夫·斯坦曼。获奖者发现了 免疫系统激活的关键原理，这使人们 对人体免疫系统的认识有了革命性的 改变。据介绍，无论是研发针对传染 病的“治疗性疫苗”，还是开发对抗癌 症的新方法，这三位科学家的研究成 果 有重要的意义。
们发现在细胞裂变中的重要控制物质，这可以使人们找到癌症治疗的 新方法。
2002 英国的约翰·劳尔斯顿和悉尼·布雷内、美国的罗伯特·霍维茨表
彰他们在研究基因如何控制器官发育和细胞死亡过程方面所作出的贡 献。
2003
美国科学家保罗·劳特 布尔和英国科学家彼 得·曼斯菲尔德表彰他们 在核磁共振成像技术领域 的突破性成就。这项技术 使人们可以详细了解大脑 和人体内部器官的状态。
2004
美国科学家理查德·阿 克塞尔和琳达·巴克表彰 两人在气味受体和嗅觉系 统组织方式研究中作出的 贡献。
2005 诺贝尔生理学或医学奖授 予澳大利亚科学家巴 里·马歇尔和罗宾·沃伦， 以表彰他们发现了导致胃 炎和胃溃疡的细菌——幽 门螺杆菌。
2006 美国科学家安德鲁·法尔 和克雷格·梅洛。他们发 现了核糖核酸(RNA)干扰 机制，这一机制已被广泛 用作研究基因功能的一种 手段并有望在未来帮助科 学家开发出治疗疾病的新 疗法。
历届诺贝尔生理学或医学奖
历年诺贝尔生理学医学奖获奖名单1901年------ E . A . V . 贝林（德国人）从事有关白喉血清疗法的研究1902年------ R.罗斯（英国人）从事有关疟疾的研究1903年------ N.R.芬森（丹麦人）发现利用光辐射治疗狼疮1904年------I.P.巴甫洛夫（俄国人）从事有关消化系统生理学方面的研究1905年------ R.柯赫（德国人）从事有关结核的研究1906年------C.戈尔季（意大利人）S.拉蒙-卡哈尔（西班牙人）从事有关神经系统精细结构的研究1907年------C.L.A.拉韦朗（法国人）发现并阐明了原生动物在引起疾病中的作用1908年------P.埃利希（德国人）、E.梅奇尼科夫（俄国人）从事有关免疫力方面的研究1909年------E.T.科歇尔（瑞士人）从事有关甲状腺的生理学、病理学以及外科学上的研究1910年------ A.科塞尔（德国人）从事有关蛋白质、核酸方面的研究1911年------A.古尔斯特兰德（瑞典人）从事有关眼睛屈光学方面的研究1912年------A.卡雷尔（法国人）从事有关血管缝合以及脏器移植方面的研究1913年------C.R.里谢（法国人）从事有关抗原过敏的研究1914年------ R.巴拉尼（奥地利人）从事有关内耳前庭装置生理学与病理学方面的研究1919年------J.博尔德特（比利时人）作出了有关免疫方面的一系列发现1920年------ S.A.S.克劳（丹麦人）发现了有关体液和神经因素对毛细血管运动机理的调节1922年------ A.V.希尔（英国人）从事有关肌肉能量代谢和物质代谢问题的研究迈尔霍夫（德 耍?nbsp;从事有关肌肉中氧消耗和乳酸代谢问题的研究1923年------F.G.班廷（加拿大）J.J.R.麦克劳德（加拿大人）发现胰岛素1924年------W.爱因托文（荷兰人）发现心电图机理1926年------J.A.G.菲比格（丹麦人）发现菲比格氏鼠癌（鼠实验性胃癌）1927年------J.瓦格纳-姚雷格（奥地利人）发现治疗麻痹的发热疗法1928年------ C.J.H.尼科尔（法国人）从事有关斑疹伤寒的研究1929年------C.艾克曼（荷兰人）发现可以抗神经炎的维生素F.G.霍普金斯（英国人）发现维生素B1缺乏病并从事关于抗神经炎药物的化学研究1930年------K.兰德斯坦纳（美籍奥地利人）发现血型1931年------O.H.瓦尔堡（德国人）发现呼吸酶的性质和作用方式 ...............1932年------C.S.谢林顿E.D.艾德里安（英国人）发现神经细胞活动的机制1933年------ T.H.摩尔根（美国人）发现染色体的遗传机制，创立染色体遗传理论1934年------G.R.迈诺特W.P.墨菲发现贫血病的肝脏疗法G.H.惠普尔（美国人）1935年------H.施佩曼（德国人）发现胚胎发育中背唇的诱导作用1936年------H.H.戴尔（英国人）O.勒韦（美籍德国人）发现神经冲动的化学传递1937年------A.森特-焦尔季（匈牙利人）发现肌肉收缩原理1938年------C.海曼斯（比利时人）发现呼吸调节中颈动脉窦和主动脉的机理1939年------ G.多马克（德国人）研究和发现磺胺药1943年------ C.P.H.达姆（丹麦人）发现维生素KE.A.多伊西（美国人）发现维生素K的化学性质1944年------J.厄兰格H.S.加塞（美国人）从事有关神经纤维机制的研究1945年------ A.弗莱明E.B.钱恩发现表霉素以及表霉素对传染病的治疗效果H.W.弗洛里（英国人）1946年------ H.J.马勒（美国人）发现用X射线可以使基因人工诱变1947年------C.F. 科里G.T.科里（美国人）发现糖代谢中的酶促反应B.A.何赛（阿根廷人）发现脑下垂体前叶激素对糖代谢的作用1948年------ P.H.米勒（瑞士人）发现并合成了高效有机杀虫剂DDT1949年------W.R.赫斯（瑞士人）发现动物间脑的下丘脑对内脏的调节功能1950年------E.C.肯德尔P.S.亨奇（美国人）发现肾上腺皮质激素及其结构和生物效应T.赖希施泰因（瑞士人）1951年------ M.蒂勒（南非人）发现黄热病疫苗1952年------ S.A.瓦克斯曼（美国人）发现链霉素 .......1953年------F.A.李普曼（英国人）发现高能磷酸结合在代谢中的重要性，发现辅酶AH.A.克雷布斯（英国人）发现克雷布斯循环（三羧酸循环）1954年------J.F.恩德斯T.H.韦勒研究脊髓灰质炎病毒的组织培养与组织技术的应用F.C.罗宾斯（美国人）1955年-- ---A.H.西奥雷尔（瑞典人）从事过氧化酶的研究1956年------ A.F.库南德D.W.理查兹（美国人）开发了心脏导管术W.福斯曼（德国人）1957年------D.博维特（意籍瑞士人）从事合成类箭毒化合物的研究1958年------G.W.比德乐E.L.塔特姆（美国人）发现一切生物体内的生化反应都是由基因逐步控制的J.莱德伯格（美国人）从事基因重组以及细菌遗传物质方面的研究1959年------ S.奥乔亚A.科恩伯格（美国人）从事合成RNA和DNA的研究1960年------ F.M.伯内特（澳大利亚人）P.B.梅达沃（英国人）证实了获得性免疫耐受性1961年------G.V.贝凯西（美国人）确立“行波学说”，发现耳蜗感音的物理机制1962年------ J.D.沃森（美国人）F.H.C.克里克发现核酸的分子结构及其对住处传递的重要性M.H.F.威尔金斯（英国人）1963年----- J.C.艾克尔斯（澳大利亚人）A.L.霍金奇发现与神经的兴奋和抑制有关的离子机构A.F.赫克斯利（英国人） .......1964年------ K.E.布洛赫（美国人）F.吕南（德国人）从事有关胆固醇和脂肪酸生物合成方面的研究1965年------ F.雅各布J.L.莫诺研究有关酶和细菌合成中的遗传调节机构A.M.雷沃夫（法国人）1966年------ F.P. 劳斯（美国人）发现肿瘤诱导病毒C.B.哈金斯（美国人）发现内分泌对于癌的干扰作用1967年------ R.A.格拉尼特（瑞典人）H.K.哈特兰发现眼睛的化学及重量视觉过程G.沃尔德（美国人）1968年------ R.W.霍利H.G.霍拉纳研究遗传信息的破译及其在蛋白质合成中的作用M.W.尼伦伯格（美国人）1969年------ M.德尔布吕克A.D.赫尔发现病毒的复制机制和遗传结构S.E.卢里亚（美国人）1970年------ B.卡茨（英国人）U.S.V.奥伊勒（瑞典人）发现神经末梢部位的传递物质以及该物质的贮藏、释放、受J.阿克塞尔罗行（美国人）抑制机理1971年------ E.W.萨瑟兰（美国人）发现激素的作用机理1972年------ G.M.埃德尔曼（美国人）R.R.波特（英国人）从事抗体的化学结构和机能的研究1973年------ K.V.弗里施K.洛伦滋（奥地利人）发现个体及社会性行为模式（比较行为动物学）N.廷伯根（英国人）1974年------ A.克劳德C.R.德·迪夫（比利时人）从事细胞结构和机能的研究1975年------ D.巴尔摩H.M.特明（美国人）从事肿瘤病毒的研究R.杜尔贝科（美国人）1976年------ B.S.丰卢姆伯格（美国人）发现澳大利亚抗原D.C.盖达塞克（美国人）从事慢性病毒感染症的研究1977年------ R.C.L.吉尔曼A.V.沙里（美国人）发现下丘脑激素R.S.雅洛（美国人）开发放射免疫分析法1978年------ W.阿尔伯（瑞士人）H.O.史密斯发现限制性内切酶以及在分子遗传学方面的应用D.内森斯（美国人）1979年------ A.M.科马克（美国人）G.N.蒙斯菲尔德（英国人）开始了用电子计算机操纵的X 射线断层扫描仪1980年------ B.贝纳塞拉夫G.D.斯内尔（美国人）从事细胞表面调节免疫反应的遗传结构的研究J.多塞（法国人）1981年------ R.W.斯佩里（美国人）从事大脑半球职能分工的研究D.H.休伯尔（美国人）T.N.威塞尔（瑞典人）从事视觉系统的信息加工研究1982年------ S.K.贝里斯德伦B.I.萨米埃尔松（瑞典人）J.R.范恩（英国人）发现前列腺素，并从事这方面的研究1983年------ B.麦克林托克（美国人）发现移动的基因1984年------ N.K.杰尼（丹麦人）G.J.F.克勒（德国人）确立有免疫抑制机理的理论，研制出了单克隆抗体C.米尔斯坦（英国人）1985年------ M.S.布朗J.L.戈德斯坦（美国人）从事胆固醇代谢及与此有关的疾病的研究1986年------R.L.蒙塔尔西尼（意大利人）S.科恩（美国人）发现神经生长因子以及上皮细胞生长因子1987年------ 利根川进（日本人）阐明与抗体生成有关的遗传性原理1988年------ J.W.布莱克（英国人）G.B.埃利昂对药物研究原理作出重要贡献G.H.希钦斯（美国人）1989年------J.M.毕晓普H.E.瓦慕斯（美国）发现了动物肿瘤病毒的致癌基因源出于细胞基因，即所谓原癌基因1990年------ J.E.默里E.D.托马斯（美国人）从事对人类器官移植、细胞移植技术和研究1991年------E.内尔B.萨克曼（德国人）发明了膜片钳技术1992年------E.H.费希尔E.G.克雷布斯（美国人）发现蛋白质可逆磷酸化作用1993年------ P.A.夏普R.J.罗伯茨（美国人）发现断裂基因1994年------ A.G.吉尔曼M.罗德贝尔（美国人）发现G 蛋白及其在细胞中转导信息的作用1995年------ E.B.刘易斯、E.F.维绍斯（美国人）C.N.福尔哈德（德国人）发现了控制早期胚胎发育的重要遗传机理，利用果蝇作为实验系统，发现了同样适用于高等增有体（包括人）的遗传机理1996年------ P.C.多尔蒂（澳大利亚人）R.M.青克纳格尔（瑞士人）发现细胞的中介免疫保护特征1997年------S.B.普鲁西纳（美国人）发现全新的蛋白致病因子——朊蛋白（PRION）1998年------芬奇戈特 (Dr. Robert Furchgott)伊格纳罗教授(Professor Louis Ignarro) 发现氧化氮可以传递信息穆拉博士(D r. Ferid Murad)（美国人）1999年------君特-布洛伯尔（美国人）发现蛋白质有内部信号决定蛋白质在细胞内的转移和定位2000年------瑞典人阿尔维德-卡尔森、美国人保罗-格林加德和美国人埃里克-坎德尔，以表彰他们三在人类“神经系统信号传送”领域做出的突出贡献。
2007年诺贝尔生理学或医学奖——基因敲除研究
美国科学家奥利弗·史密斯
※ 1925年7月23日出生于英格兰的哈利 法克斯，是英国出生的美国遗传学家。
※ 高中毕业后直接进入牛津大学的贝利 尔学院学习，并于1946年获得牛津大学 生理学学士学位。
※1951年获得牛津大学生物化学博士学 位，现任职于美国北卡罗莱纳大学医学 院病理学教授。
总的来说，原发性肝癌的病因至今未能 完全阐 明，但 已证明 与以下 因素密 切相关 ： 1、病毒性肝炎：流行病学统计表明，乙 肝流行 的地区 也是肝 癌的高 发地区 ，患过 乙肝的 人比没 有患过 乙肝的 人患肝 癌的机 会要高 10倍之 多。长 期的临 床观察 中发现 ，肝炎 、肝硬 化、肝 癌是不 断迁移 演变的 三部曲 。近来 研究表 明，与 肝癌有 关的病 毒性肝 炎主要 包括 乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（BCV），而 其中又 以乙型 肝炎最 为常见 。 2、酒精：俗话说“饮酒伤肝”，饮酒并 不是肝 癌的直 接病因 ，但它 的作用 类似于 催化剂 ，能够 促进肝 癌的发 生和进 展。有 长期酗 酒嗜好 者容易 诱发肝 癌。这 是因为 酒精进 入人体 后，主 要在肝 脏进行 分解代 谢，酒 精对肝 细胞的 毒性使 肝细胞 对脂肪 酸的分 解和代 谢发 生障碍，引起肝内脂肪沉积而造成脂 肪肝。 饮酒越 多，脂 肪肝也 就越严 重，进 而引起 肝纤维 化、肝 硬化、 肝癌的 发生。
奥利弗史密斯的研究
• 埃文斯应用基因打靶技术发展人类疾病的 小鼠模型。他还开发了多种其它的人类遗 传疾病囊肿性纤维化小鼠模型，并利用这 些模型来研究疾病机制和测试基因疗法的 效果。
2020/1/4
马丁埃文斯的研究：
1981年，英国科学家马丁·埃文 斯时任英国卡的夫大学哺乳动物基 因学教授的，首次从老鼠胚胎中提 取出胚胎干细胞（ＥＳＣ），这一 发现为“基因敲除”小鼠的出现奠 定了直接的基础。
2007年诺贝尔生理学或医学奖
基因敲除技术原理 基因敲除技术方法 基因敲除技术的意义和发展
5
“基因敲除”技术原理
基因靶向的细胞基础—胚胎干细胞
胚胎干细胞(embryoniestemeells,ESC)来源于胚胎 的囊胚阶段的内细胞团，具有自我复制和多能型，能 够分化成来源于内胚层、中胚层和外胚层的各种细胞 类型，具有全能型； ESC的另一特性是当将一定数目的ESC注人囊胚期小 鼠的囊胚腔后这些细胞可以参与包括生殖腺在内的各 种组织嵌合体的形成； ESC是进行基因靶向研究不可替代的材料。
3
什叫基因敲除？
基因敲除技术是在20世纪80年代后发展 起来的一种新型的分子生物学技术，通 常意义上的基因敲除又称为基因打靶 （gene targeting），是指通过DNA同源 重组定向地将外源基因插入宿主细胞染 色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生 物活体内失活的过程。
2015-6-28
“基因敲除”技术原理
筛选重组细胞策略的发明
Thomas和Capecchi曾指出同源重组的频率和随机整合频 率相比是 1/1000； Capecchi发明了一种用于鉴定胚胎干细胞是否包括完整 的插入靶基因的新方法——阳性-阴性选择策略；
基因敲除技术方法
合如 体图 小（ 鼠左 ） 由 嵌 合 体 得 到 基 因 敲 除 的 纯 .
source: /docs/authentication/
“基因敲除”技术原理
基因打靶的研究对象——小鼠
和人类基因组一样，小鼠基因组也编码约
个基因；
30000
据分析约99%的人类基因可以在小鼠基因组找到同 源基因，而这些基因的序列的整体同源性也在 90%以上；
2015-6-28
基因敲除技术的意义和发展
2007年诺贝尔生理医学奖
三、定义
• 所谓基因打靶技术， 简单的说就是人为的 操纵基因的表达，也 就是说在基因序列上 加入或减去基因的技 术。通过对基因片断 的加加减减，达到预 期的生物形状改变的 结果。
四、应用
• ①“基因靶向”技术可允许科学家利用胚胎干细 胞，灭活或修改小鼠的特定基因，使实验鼠体内 的一些“不活跃”基因失去作用，从而发现这些 基因的实际功能，研究这些基因对健康和疾病的 影响。利用该技术，科学家在小鼠的胚胎干细胞 中引入特定基因进行修饰，将这些细胞注入小鼠 的胚胎后，从该胚胎出生的小鼠和其它小鼠繁殖 的后代将产生基因变异。科学家希望借此发现人 类一些疑难杂症在分子水平上的发病原因，并最 终找到治疗途径。
④用来提供廉价的异种移植器官。
众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的 一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的 器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因 会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子， 如果能将产生这些异源分子的基因消除，那么动 物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者 带来巨大的福音。再就是用于定向改造生物，培 育新型生物提供了重要的技术支持。由此可见其 潜在的巨大应用价值。
2007年诺贝尔生理医学奖 ——“基因靶向”技术的坚定基
础
一、概述
• 2007年诺贝尔奖评审委员会将诺贝尔生理 学或医学奖分别授予两名美国人马里奥·卡 佩基、奥利弗·史密斯和一名英国人马丁·埃 文斯，以表彰他们在“基因靶向”技术方 面的突出贡献。
马丁-埃文斯
• ②全世界的科学家已经利用该技术先后对 小鼠的上万个基因进行了精确研究。根据 导致人类疾病的各种基因缺陷，科学家培 育了超过500种存在不同基因变异的小鼠， 这些变异小鼠对应的人类疾病包括心血管 疾病、神经病变，糖尿病和癌症等。
历届诺贝尔生理医学奖获得者名单及贡献
1、1901年，埃米尔•阿道夫•冯•贝林（德国）。
利用血清疗法治疗白喉。
2、1902年，Ronald Ross（英国）。
关于疟疾的研究。
3、1903年，Niels Ryberg Finsen（丹麦）。
利用光辐射治疗狼疮。
4、1904年，巴甫洛夫（俄国）。
在神经生理学方面，提出了著名的条件反射和信号学说。
5、1905年，R.柯赫（德国）。
关于结核方面的研究和发现。
6、1906年，C.高尔基（意大利），桑地牙哥•拉蒙卡哈（Santiago Ramón y Cajal，西班牙）。
关于神经系统结构的研究。
7、1907年，Charles Louis Alphonse Laveran（法国），发现原生动物在引起疾病中的作用。
8、1908年，Ilya Ilyich Mechnikov（俄国），Paul Ehrlich（德国）。
关于免疫方面的研究。
9、1909年，Emil Theodor Kocher（瑞士）。
关于甲状腺生理学，病理学和外科学方面的研究10、1910年，艾布瑞契•科塞尔（Albrecht Kossel，德国）。
关于细胞化学尤其是蛋白质和核酸方面的研究11、1911年，Allvar Gullstrand（瑞典）。
关于眼睛屈光学方面的研究。
12、1912年，Alexis Carrel（法国。
关于血管缝合以及血管和器官移植方面的研究。
13、1913年，Charles Robert Richet（法国）。
关于过敏反应的研究。
14、1914年，Robert Bárány（奥地利。
关于内耳前庭装置生理学及病理学方面的研究。
15、1915年-1918年，未颁奖，奖金划拨到生理医学奖专门的基金上。
16、1919年，Jules Bordet（比利时）。
关于免疫方面的研究。
17、1920年，Schack August Steenberg Krogh（丹麦）。
发现毛细血管运动的调节机制。
“三腿一平台”组成的“基因打靶”——评介2007年度诺贝尔医学奖
维普资讯
堂墨
塞
医学与哲学（ 人文社会医学版）０８年 ５ ２０ 月第 ２ 卷第 ５ ９ 期总第 ３６期 ５
“ 腿 一 平 台 ” 成 的 “ 因打 靶 ” 三 组 基
评介 ２０ ０ ７年 度 诺 贝 尔 医学 奖
熊耀 斌 ① 傅 缨② 洪道 显③ 傅 杰 青③
摘 要 ：０ ７ 度诺 贝 尔 医学 奖 项 目— — 基 因打 靶 ， ２０ 年 由三 腿 和 一 个 平 台所 构 成 。三 条 腿 分 别 是 转 基 因 学 、 源 重 组 和 胚 胎 同 干 细 胞 ， 个 平 台 指 的 是 基 因敲 除 。除 了评 价 这 些 组成 部 分 以外 ， 对推 迟 评 奖 进 行 了质 疑 。 一 还
ＸＩ ＯＮＧ ａ —ｉ Ｆ“Ｙｉ ｇ，Ｈｕ ｇＤａ — ａ ｅ １ Ｊｉｎ ｘ ｎ ｔ ｕｅｏ ｄｉａ ｃｅ ｃ ｓ Ｎａ ｃ ａ ｇ ３ ０ ０ ， ｈ ｎ Ｙ ｏｂｎ， ｎ ｎ ｏｘｉ ｎ，ｔ ． ａ ｇ ｉＩ ｓｉ ｔ ｆ Ｍｅ ｃ ｌＳ ｉｎ ｅ ， ｎ ｈ ｎ ３ ０ ６ Ｃ ｉａ ａ ｔ
ｎａ ｉ ｔｏｎ， ｍ ｂｒ ｏｎｉ ｔ ｍ ｅ ｌ ｎ ｅ ｎｏｃ ｅ ｙ ｃ ｓ ｅ ｃ ｌｓ ａ ｄ ｇ ｎｅ ｋ ｋｏｕ ．Ｂｅ ｉ ｓｄｉｃ ｓｎ ｈｅ ｅ ｐａ ｔ ｆｔ ｉｃ ｅ ｙ ａ ｄ ｑ ｓ ｉｎｓ，ｔａ ｓ ｔ ｓｄｅ ｓ ｕｓ ｉ ｇ ｔ ｓ ｒｓ ｏ ｈｅ ｄ ｓ ｏｖ ｒ ｎ ｕｅ ｔｏ ｉ ｌｏ ｄｏｕ ｂ— ｔ ｄ ｔ ｔｔ ｒｚ ｉ ｔｂｅ ｐｏ ｔ ｏｎｅ ｅ ｈａ ｈｅ ｐ ｉｅ ｍ ｇｈ ｓ ｐ ｄ． Ｋ ｅ ｏ ｄ Ｎ ｏ ｌ ｒｚ ｏｒｍ ｅ ｃｎｅ， ｎ ａ ｇｅ ｉ ｇ， ｔ ａ ｇｅ ｃ ｈｏ ｏｌ ｏｕ ｒ ｃ ｍ ｂｉ ｔｏｎ。 ｍ ｂｒ ｎｉ ｓｅ ｅｌ 。 ｎ ｙ Ｗ ｒ ｓ： ｂｅ ｐ ｉｅ ｆ ｄｉｉ ｇｅ ｅ ｔ ｒ ｔｎ ｒ ｎｓ ｎｉｓ。 ｍ ｏｇ ｓ ｅ ｏ ｎａ ｉ ｅ ｙｏ ｃ ｔ ｍ ｃ ｌ ｇｅ ｅ ｋｎｏ ｋｏｉ ｃ ｔｔ
基因打靶技术
三、打靶载体的构建
• 基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中 同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶 载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基 因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型 载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位 点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复， 从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线 性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线 性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体 序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载 体进行基因打靶。
常用的选择标记基因
• 正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶 （neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄 嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤 磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk） 及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。
• 负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、 tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB 等。
• 负选择基因在靶基因同源区之外，位于载 体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重 组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机 整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸 苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷 （GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细
胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合
的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC 都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但 对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将 被G418杀死。
• ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持 未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞 类型的细胞。自从1981年美国的Gail和英国 的Evans等 分别成功地从发育中的小鼠囊胚 的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎 干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种 最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
诺贝尔奖研究医学与哲学(人文社会医学版)2008年5月第29卷第5期总第356期“三腿一平台”组成的“基因打靶”———评介2007年度诺贝尔医学奖熊耀斌① 傅 缨② 洪道显③ 傅杰青③摘要:2007年度诺贝尔医学奖项目———基因打靶,由三腿和一个平台所构成。
三条腿分别是转基因学、同源重组和胚胎干细胞,一个平台指的是基因敲除。
除了评价这些组成部分以外,还对推迟评奖进行了质疑。
关键词:诺贝尔医学奖,转基因学,同源重组,胚胎干细胞,基因敲除,基因打靶中图分类号:R-05 文献标识码:A 文章编号:1002-0772(2008)5-0073-03Three Legs and One Platform Make up a Stool“G ene T argeting”:R eview of2007N obel Prize for Physiology or Medicine X ION G Yao2bin,Fu Ying,Hong Dao2x ian,et al.J iang x i I nstitute of Medical Sciences,N anchang330006,China Abstract:The discovery of2007Nobel Price for Medicine,gene targeting is made up by transgenics,homologous recombi2 nation,embryonic stem cells and gene knockout.Besides discussing these parts of the discovery and questions,it also doub2ted that the prize might be postponed.K ey Words:Nobel prize for medicine,gene targeting,transgenics,homologous recombination,embryonic stem cell,gene knockout 负责评审诺贝尔生理学或医学奖的瑞典卡洛林斯卡医学院诺贝尔全体大会于8日宣布,2007年度的该奖授予美国科学家奥利弗・史密瑟斯(Oliver Smithies),马里奥・卡佩基(Mario R.Capecchi)和英国科学家马丁・埃文思(Sir Martin J.Ev2 ans),以表彰他们发现“利用胚胎干细胞在小鼠体内形成特定基因修饰的原理”。
在《新闻公报》中,这些成就被评价为“关于哺乳动物胚胎干细胞和DNA重组的系列性突破性发现”,并且展开地描述称:“有了这些发现,就出现了小鼠基因打靶这一强大有力的技术,这一技术现在正试用于生物医学中几乎所有的领域之中———从基础研究到新疗法的开发”[1]。
诺贝尔全体大会为了详细介绍他们评审这一奖项的科学意义,不惜以三倍于《新闻公报》的篇幅发表了一份《详细信息》,作者为医学诺贝尔委员会成员,卡洛林斯卡医学院心血管研究教授G.K.亨生(G ran K.Hansson)[2]。
但是通俗而形象地叙述该奖项的科学内容倒不如使用“三腿一平台”的说法。
这种说法把该奖项譬喻为有三条腿和一个平台的凳子,三条腿分别是:转基因学(transgenics)、同源重组(homologous recombination)和胚胎干细胞;一个平台就是基因敲除;而整个凳子则是“基因打靶”[3]。
这个奖项属于哺乳动物遗传学的领域,开始作出重大成就的这三位获奖者都完成于20世纪80年代,而且都是在使用小鼠作为模型才导致成功的。
在20世纪80年代选择小鼠作为模型研究哺乳动物的遗传学是需要冒一定的风险,因为在那时如果用细菌、酵母或果蝇作模型,那么遗传学的发现是比较容易作①江西省医学科学研究所 江西南昌 330006②南昌大学第二附属医院 江西南昌 330006③江西省肿瘤医院 江西南昌 330029出的;例如一只形态畸形的果蝇,就是不难找到的;在此基础上再寻找突变和基因之间的连系,便容易成功。
何况果蝇还有一个优势,它有一个巨大的唾液腺染色体,而这些染色体里基因的改变是可以在显微镜下观察得到的。
但是一旦选择了小鼠作为模型,研究进度就会成倍地放慢下来。
但是到了1989年,这些令人羡慕的小鼠遗传学家的美梦竟出乎意料地圆了。
这三位诺贝尔获奖者找到了一条途径,在小鼠身上做到了果蝇身上才能做到的事。
令人注意的方法论上的启示是:他们反其道而行之———本来应该从突变开始,然后再集中到改变了的基因;但是他们恰恰相反,从改变了的基因开始,然后注意观察对小鼠的反应。
和细胞培养作模型相比较,小鼠则具有动物整体性的优势。
固然细胞培养的研究技术有助于理解包括多细胞的反应在内的功能,但是对于器官系统的印象毕竟是破碎的。
正如H.Ehmke 说过的那样:“细胞是没有血压的。
”从遗传学的角度说来,人类和小鼠都各自含有22400个左右的基因;其中99%以上不仅在数量上是相同的,而且功能上也是近似的。
这就是说,如果能够在小鼠体内找到哪个基因是管什么功能的,那么就有很大可能告诉我们,这些基因在人类也是管理这些功能的。
现在我们转而叙述这“三腿一平台”。
(1)转基因学。
所谓“转基因”就是指的“被引入的基因”,又称“基因敲入”。
早在20世纪70年代中期,小鼠遗传学家就十分羡慕果蝇遗传学家能够随心所欲地修补基因。
当时有的小鼠遗传学家利用病毒作为基因修补工具,他们引入病毒进入小鼠各种组织的细胞里,落户在它们的染色体中。
在碰巧的场合,这种转基因落户到了生殖细胞,即精子或卵子里,这样它们就发育成未来子代的遗传混合体。
在此基础上,他们开始生产出“转基因”的牲口,例如长膘很快的猪、牛奶中含有药用激素的奶牛。
这样一来,用病毒插入染色体的转基因突破了修补哺乳动物细“三腿一平台”组成的“基因打靶”———熊耀斌等医学与哲学(人文社会医学版)2008年5月第29卷第5期总第356期胞基因的障碍。
但是基因在染色体上的排列是有序的,如果插进来的基因是随机的,就可能造成灾难。
所以研究工作者就必须寻找一种精确的方法在选定的部位插进基因,这样才能达到有意识地改变功能的目标。
后来小鼠遗传学家找到了这一机制,那就是同源重组。
(2)同源重组。
我们的DNA是位于染色体中,染色体都是成双的,一条来自父亲,另一条来自母亲。
在这样染色体对之中DNA顺序的交换,提高了群体内基因变异的频率,它之所以能够发生是基于一种称作为同源重组的过程。
所谓“同源”,指的是插入的DNA片段和它在染色体上孪生的靶向片段是重复的;所谓“重组”,指的是插入的与靶向的分子是彼此联接的(即分离端可彼此连接),这一过程能将一个版本的基因取代另一个版本的基因,或者将另一个基因拷贝一前一后地加进去。
2007年诺贝尔医学奖获奖者之一的卡佩基早在20世纪70年代末用极细小的玻璃管将DNA直接注入哺乳动物细胞核内。
该玻璃细管由液压显微操作器操控,在高倍显微镜观察下注入细胞核。
这样的细胞仍然能够进行有丝分裂,并且稳定地将该DNA传递给子代细胞。
这时他发现了一种令人惊奇的现象:虽然新注入的DNA分子是随机地注入受体细胞的染色体之中,但是一个以上的分子可能在同一部位进入,而且全部分子都是统一朝向。
这时候卡氏意识到,他能够驾驭这个机制以实施同源重组,也就是一种在新引入的自选的DNA分子与细胞的染色体中相同DNA顺序之间的同源重组。
卡氏遂于1982年向美国国立卫生研究院(N IH)提出课题申请。
令人失望的是,负责审查课题的科学家否定了它。
在他们看来,新引入的DNA在数量浩繁的基因片段中找到配对的DNA顺序的机率是极小的。
卡氏没有灰心,他利用别的课题申请到的经费继续做他的实验设计。
这对他说来实在是一场赌博,因为一旦试验失败他就将提不出任何有价值的数据来支持他申请课题了。
幸运的是,到了1984年,当卡氏再次申请课题时,他已经获得了成功。
当年审查并拒绝批准的那些科学家自嘲地对他说:“我们因为你没有接受我们的劝告而感到高兴”[2]。
无独有偶,另一位获奖人史密瑟斯也独立地完成了同源重组。
早在1962年,通过重组方法他就获得了一种亲血色球蛋白的等位基因变种。
到了1980年他克隆了人类胚胎球蛋白基因,并且导致了如下的结论:通过一个包括同源重组在内的过程,已可获得选定的GY和A Y基因。
接着他设计了一个逐步的选择操作,用来恢复一种带有修饰过的基因的靶向细胞。
这一策略终于成功了,在1985年9月19日出版的《自然》上发表了一篇有里程碑意义的论文,该论文报告了他成功地进行了这一整合[2]。
卡氏和史氏都证实了同源重组可能发生在小鼠的细胞里,虽然频率不高,仅为千分之一。
但是这毕竟是一种很有用的用来交换基因的技术。
研究人员虽然认可这种技术,但都抱怨需要试验的时间太长,他们都急需提高其频率,于是应运而生地出现了胚胎干细胞。
(3)胚胎干细胞(ES细胞)。
小鼠的ES细胞组成了第三条凳腿。
掌握ES细胞秘密的是2007年诺贝尔医学奖得主埃文思。
所谓干细胞,指的是能够大量增殖,并产生更多干细胞和更多的分化子代细胞的细胞。
对于成年机体的组织之更新来说,体干细胞是必需的。
例如骨髓中的造血干细胞就可以分化成各种血细胞,即红细胞、巨核细胞/血小板、各型白细胞。
如果说成年机体的每一个体干细胞是投入特定的分化系,那么早期胚胎(如囊胚)则含有全能的干细胞;所谓全能,指的是它们在发育中的机体里可以生成各型细胞。
所以从胚胎细胞中产生ES细胞以产生活的哺乳动物个体的实现,是科学家多年以来梦寐以求的。
一百年前就有人假设,可以从未分化的干细胞中提取分化的细胞和组织。
过了大概半个世纪,对睾丸畸胎瘤的研究表明,这些肿瘤含有全能细胞。
20世纪50年代,Stevens发现,129Sv 品系的小鼠高频率地含有这些细胞。
他还证实了,这些细胞能够发育成胚胎样体,它们移植以后又能够诱导出具有各型细胞的固体肿瘤。
几年以后,另外两名学者又证实了,这类肿瘤可取自未分化的ES细胞。
细胞培养技术的开发成功,使科研工作者得以从小鼠睾丸畸胎瘤细胞中成功获得胚胎癌细胞的培养物。
包括剑桥大学的埃文思在内的若干科学家在20世纪70年代初就报告了这样的培养物。
埃文思从Stevens那里获得了129Sv品系小鼠,并为取自培养物中畸胎癌细胞进行了鉴定。
埃文思利用这种胚胎癌细胞,还可以生成嵌合性小鼠。
而且这种嵌合性小鼠还可以生成多种肿瘤。
1980年埃文思和一位胚胎学家合作,将细胞培养和胚胎操作结合起来,将研究工作扩及单倍体胚胎用于细胞培养。
这些细胞就是为今后保证基因打靶成功具有关键意义的ES细胞。
1981年7月埃文思和这位胚胎学家在《自然》杂志上发表论文中指出了使用ES细胞于基因修饰的可能性[2]。