粗糙型布鲁菌激活四型分泌系统诱导巨噬细胞死亡的分子机制研究
布鲁氏菌的致病机制与细胞免疫机制研究进展
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｐ ｏ ｒ ｓ ｎ ｐ ｔ ｇ ｎｉ ｅ ｈａ ｓ ａ ｄ ｃ ｌｕ ａ ｍｍ ｕ ｔ ｆＢｒ ｃ ｌａ ｓ ａ ｃ ｒ ｇ ｅ ｓ ｏ ａ ｈｏ ｅ ｃ ｍ ｃ ｎｉｍ ｎ ｅ ｌ ｌ ｒ ｉ ｎｉｙ ｏ ｕ ｅ ｌ
董 炳 梅 ， 金 良。 唐 娜 ， 立 中 ， 志 强 王 ， 苗 沈 ，
摘 要 ： 目的 布 鲁 氏菌 病 是 由布 鲁 氏菌 （ ｒｃｌ ｐ ｃ ｓＢｒ ） 染 引 起 的 一 种 严 重 的 人 兽 共 患 性 传 染 病 ， 在 接 触 患 ｂｕ ｅａｓｅｉ ， ｕ 感 ｌ ｅ 人 病 动 物 或 被 污 染 的 动 物产 品 后 即 可 发 病 。Ｂｒ ｕ是 一 种 兼 性 细 胞 内感 染 细 菌 ， 体 表 面 最 主 要 的 抗 原 包 括 脂 多糖 （ Ｐ ） 外 膜 菌 Ｌ Ｓ和 蛋 白 等 ， 感 染 的靶 细 胞 主 要 是 巨 噬细 胞 与 胎 盘 滋养 层 细 胞 ， 也 可 在 树 突 状 细 胞 （ｅ ｄｉｃｃｌ Ｃ ） 其 但 ｄｎ ｒ ｉ ｅｌ ｔ ，Ｄ ｓ 中生 长 繁 殖 。 该 病 主 要 以 Ｔ ｌ型 细 胞 免 疫 应 答 为 主 ， Ｄ ｓ 导 的 细胞 免 疫 应 答 在 机 体 抗 Ｂ ｕ感 染 中发 挥 着 重 要 作 用 。本 文 在 分 析 Ｂ 主 要 抗 ｈ 由 Ｃ 诱 ｒ 原 分 子 生物 学特 性 的基 础上 ， Ｂ ｕ的致 病 机 制及 巨噬 细 胞 与 Ｄ ｓ 与 的机 体 抗 Ｂｒ 就 ｒ Ｃ 参 过 程 的 研 究 进 展 作 一 综 述 。
布鲁氏菌病的研究与防控进展
布鲁氏菌病的研究与防控进展布鲁氏菌病（Brucellosis）又称波状热，是由布鲁氏菌所引起的动物源性传染病，是一种人畜共患的传染-变态反应性疾病，但是仅于动物之间传播，人与人之间的传播很罕见。
人类感染布鲁氏菌后临床症状表现为长期的发热、多汗，可有关节肿痛，肝脏以及淋巴结肿大的症状的出现，对于男性患者还可以威胁到患者的生殖系统，出现睾丸肿痛，多是由睾丸炎及附睾炎所致。
布鲁氏菌病严重影响人类的生命健康。
近年来由于布鲁氏菌病的流行趋势在逐年的增长，该文就布鲁氏菌病的相关研究与防控做出系统的总结与相应的分析思考。
标签：布鲁氏菌病；布鲁氏菌；防控；研究随着经济新时代的到来，布鲁氏菌却出现了反弹的趋势，很多报道称布鲁氏菌病的患病人数在逐渐呈递增趋势，这与所期望的恰恰相反。
从布鲁氏菌病的预防与控制的角度出发，对于布鲁氏菌病的流行特点与致病因素分析以及如何更有效地预防疾病发生等相关问题已经迫在眉睫[1]。
1 布鲁氏菌的病原学特点布鲁氏菌所属为革兰阴性杆菌，没有外毒素，主要的治病毒素为其所产生的内毒素。
目前研究的对人类有致病性的布鲁氏菌属有4种，分别为牛种（流产布鲁氏菌，B.abortus）、猪种（B.suis）、羊种（马尔他布鲁氏菌，B.melitensis）、犬种（B.canis），这四种菌属对人类的致病性也是有相应的差异性的。
除了这4种外，还有绵羊附睾种（B.ovis）和沙林鼠种（B.neotomae）[2]。
前面所讲述的布鲁氏菌的分种是根据其储存宿主、生化、代谢以及免疫学的差异进行分类的。
近些年来对于布鲁氏菌的新种属的发现也有很多，比如田鼠型（B.micron）、鳍型（B.pinnipediae）、鲸型（B.ceti）等布鲁氏菌都是近些年来新发新的，这些新型布鲁氏菌属的发现，使人们对布鲁氏菌有了更深的认识。
2 布鲁氏菌病的流行特点2.1 传染源布鲁氏菌的宿主目前已知有60多种，如家禽、家畜以及野生动物等都可以是布鲁氏菌的宿主，动物感染布鲁氏菌后会在动物与动物之间传播，造成广泛性的发病状态或者带菌状态，人类感染的布鲁氏菌一般来源于已经被感染的动物，人类之间的感染一般是很罕见的。
布鲁菌与巨噬细胞相互作用的研究进展
E2mail: xywu2003@ hotmail. com
菌株的不同而不同 。但布鲁菌无论与何种细胞结 合 ,其侵入细胞的效率都接近 100%。巨噬细胞由 于其本身的特性 ,更容易被布鲁菌所结合 。
开始 ,细菌结合到脂质筏和巨噬细胞不同的细 胞膜受体上 ,在这些细胞里 , cAM P / PKA 信号转导通 路被转录因子的磷酸化所激活 。在上皮细胞 ,细菌 活化 Rho家族的小 GTP酶 ,募集适量的细胞骨架肌 动蛋白 。在巨噬细胞内 ,多数摄入的布鲁菌被定向 到巨噬细胞溶酶体 ,只有很少一部分细胞能到达内 质网 ,这里是布鲁菌复制的区域 。相反 ,在上皮细 胞 ,大多数的细菌被直接送到内质网而不是溶酶体 。 布鲁菌在复制阶段仍需要稳定的基因表达 ,在这个 阶段 ,布鲁菌能够阻止凋亡 。在宿主细胞中复制的 细菌释放出大量的 LPS, LPS重新循环到细胞膜上 与 MHCⅡ分子形成稳定的复合物而构成脂质巨筏 , 这些表面脂质 2LPS蛋白大结构域阻止了细胞向 T 细胞递呈抗原 。同时 ,布鲁菌的 LPS使调节性 T细 胞能够识别抗原提呈细胞表面的 MHCⅡ2LPS大结 构域 。 2 宿主细胞膜上的脂质筏在布鲁菌感染过程中的 作用
每一种细胞内的致病原各自均有一套毒力机 制 ,每一种致病原在毒力策略上也都有自己深奥的
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微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 1期 Prog in M icrobiol Immunol Nov. 2008, Vol. 36 No. 1
粗糙脉孢霉四分子遗传分析
真菌类的遗传分析————四分子分析与作图一粗糙脉孢霉的性质与生活史（一）粗糙脉孢霉的性质粗糙脉孢霉( Neurosporocrassa ) 属于真菌中的子囊菌纲，是低等的真核生物。
每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
是遗传分析好材料:1子囊孢子是单倍体，其表型直接反应其基因型。
2 一次只分析一个减数分裂的产物。
3体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。
4能进行有性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物。
5 更加重要的是，子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，这就是粗糙脉孢霉成为了遗传分析的好材料。
（二）粗糙链孢霉的生活史粗糙链孢霉有有性生殖和无性生殖。
二 顺序四分子与遗传分析 （一）顺序四分子 (ordedtetrad)粗糙脉霉菌减数分裂的四个产物保留在一起，称为四分子。
但是，在分裂的过程中子囊的外形比较狭窄，以至分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴中，这样所有分裂后的核――８个子囊孢子都是从上到下排列成行，所以，脉孢菌减数 分裂所产生的四分子是属于顺序四分子(ordedtetrad)。
可推知：第一对子囊孢子来自一条染色单体，第二对孢子则是来自这条染色单体的姊妹染色单体; 第三和第四对子囊孢子是来自前一条染色体同源染色体的姊妹染色单体。
无性世代（单倍体世代）：菌丝体 →分生孢子→ 菌丝体。
粗糙脉孢菌（ NeurosporaCra ssa ）的生殖方式有性世代（双倍体世代）：一个交配型的分生孢子落在另一交配型原子囊壳受精丝上，从而进入原子囊（子实体），进行多次有丝分裂，形成多个单倍体核，这些单倍体核与子实体中的单倍体核融合，形成多个二倍体核，然后进入减数分裂，每个二倍体核形成4个单倍体核，再进行一次有丝分裂，形成8个核，最后形成为一个子囊中的8个子囊孢子。
无性孢子——分生孢子 有性孢子——子囊孢子这种顺序四分子在遗传分析上有很多优越性:(1). 可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算基因与着丝粒的重组率，即着丝粒作图。
布鲁氏菌胞内生存机制研究进展
布鲁氏菌胞内生存机制研究进展3王玉飞 陈泽良 黄留玉33(中国人民解放军军事医学科学院疾病预防控制研究所 北京 100071)摘要:布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,可以在专业和非专业吞噬细胞内生存和复制。
当布鲁氏菌与细胞接触时,细菌可以通过受体分子进入细胞。
布鲁氏菌在细胞内首先定位于早期吞噬体,然后,在胞内改变其运输方向,最终抵达其胞内复制部位内质网,开始大量复制。
这种复制既不影响细胞的基本功能,也不诱导细胞的损伤。
主要综述了布鲁氏菌对细胞的侵袭、胞内运输和复制的相关研究进展。
关键词:布鲁氏菌,细菌侵袭,胞内运输,胞内复制中图分类号文献标识码:A 文章编号:025322654(2007)0621218204AdvancesintheResearchonthe Brucella IntracellularLife3WANGYu 2Fei CHENZe 2Liang HUANGLiu 2Yu 33(Institute of DiseaseControl and Prevention ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100071)Abstract :Brucella organismsarefacultativeintracellularbacteriacapableofsurvivinginsideprofessionalandnon 2professionalphagocytes.Uponcell contactthebacteriaisinternalizedviareceptormolecules.Onceinsidecells,Brucella localizesinearlyphagosomes,whereitavoidsfusionwithlateendosomesandlysosomes.Then,thebacteriumredirectsitstraffickingtoautophagosomesandfinallyreachestheendoplasmicreticulum,the replicatingniche.Onceinsidetheendoplasmicreticulum,Brucella extensivelyreplicateswithoutrestrictingbasiccellularfunctionsorinducingdamagetocells.Invasion,intracellulartraffickingandreplicationofBrucella organismsinprofessionalandnon 2professionalphagocytesandthemoleculardeterminantsinvolving Brucella intracellularlifearereviewedinthisarticle.Keywords :Brucella ,Bacterialinvasion,Intracellulartrafficking,Intracellularreplication 3国家自然科学基金资助项目(No.30600024) 33通讯作者 Tel:010*********,E 2mail:huangly@ 收稿日期:2007203214,修回日期:2007206205 布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,可以在专业和非专业吞噬细胞内生存和复制。
布鲁氏菌病研究进展
布鲁氏菌病研究进展
【关键词】布鲁氏菌病，研究进展综述
布鲁氏菌病（Brucellosis，以下简称布病）是由布氏杆菌引起的一种
人畜共患传染病，布氏杆菌侵入人体后可引起以长期发热、关节疼痛、肝脾肿大和慢性化为主要特征的机体变态反应性疾病。
由于布病对人群健康、经济发展和国家安全都构成了严重的威胁，因此世界动物卫生组织将其列为B类法定传染病[1]中华人民共和国传染病防治法将其归为一类传染病[2]。
尽管在许多发展中国家是一种地方病[3.4]，但是布病仍存在漏诊和漏报[5]。
此外，由于布病是兽医发病率和死亡率的重
要因素，这种疾病在发展中国家也可以引起经济损失[6]。
随着分子生物学及免疫学技术的不断创新，使得人们对于布病及布鲁氏菌有了进
一步的认识，并且在布鲁氏杆菌致病机制、诊断技术、治疗药物和疫
苗的研究及流行病学的调查研究等方面进行了一些有意义的尝试和
探索。
现将布鲁氏菌病的研究现况综述如下。
b5E2RGbCAP
1.布鲁氏菌病的病原生物学研究
布鲁氏杆菌是革兰氏阴性、无芽孢、不运动、不形成荚膜的球杆菌。
微生物分类学家将布氏菌归为布鲁氏菌属，根据布鲁氏菌的致病性和宿主嗜性, 布鲁氏菌属分成8 个种: 羊种、牛种、猪种、犬种、海豚种、海豹种、沙林鼠种和绵羊种布鲁氏菌[7]。
人类能被羊种、牛种、猪种布鲁氏菌感染, 偶尔被犬种、海豚种、海豹种布鲁氏菌感染. 在
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肺表面活性物质SP-A和SP-D免疫调节机制研究进展
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202005020肺表面活性物质SP-A 和SP-D 免疫调节机制研究进展周益民1，杜晓敏2*（1.邢台医学高等专科学校第二附属医院，河北邢台054000；2.邢台医学高等专科学校基础医学部，河北邢台054000）中图分类号：S852.4文献标识码：B 文章编号：1008-0589（2020）12-1296-06肺表面活性物质（Pulmonary surfactant ，PS ）是由肺泡Ⅱ型细胞产生和分泌的一种复杂的脂质和蛋白质混合物，它们可以在呼气结束时保持肺泡不塌陷，其中亲水性表面活性蛋白（Surface active protein,SP ）A （SP-A ）和D （SP-D ）在天然免疫机制中也发挥着重要作用。
SP-A 和SP-D 能与各种微生物和病原体的成分相互作用，具有绑定和凝集病原体的作用；二者也对细菌的生长具有直接抑制作用。
SP-A 和SP-D 与免疫细胞协同激活各种细胞的功能，如SP-A 和SP-D 参于巨噬细胞的吞噬和氧化机制。
此外，通过与细胞表面模式识别受体结合，SP-A 和SP-D 调节炎症细胞反应，如诱导炎性细胞因子的释放。
SP-A 和SP-D 同属于具有凝集素域与胶原结构的胶原凝集素族群，胶原凝集素涉及甘露糖结合凝集素，在先天免疫系统中发挥一定作用。
二者单体具有相似的特征结构：（1）氨基酸末端包含着一个短的亚基间形成的二硫键；（2）重复的GLY-X-Y 组成的类胶原蛋白结构域；（3）一个颈部区域；（4）碳水化合物识别域（CRD ），SP-A 和SP-D 通过CRD 识别特异性的脂质，CRD 良好的特异性使其在各种微生物和PAMPs 的识别中发挥着重要的作用。
布鲁菌毒力因子研究进展
１０ ７ ） ００ １
要： 布鲁菌是一种兼性细胞 内寄生菌 ， 能够严重地导致 人畜共患 布鲁菌病 。本 文就影 响布鲁 菌致病 能力 的毒
力因子进行综述 。
关键词 ： 布鲁 菌 ； 致病性 ； 毒力因子
中图 分 类 号 ： ３ ８５ １ ７ １ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０５５７ （０ ７ ０ －０００ １０ －６ ３ ２ ０ ） １ ５ －４ ０
布 鲁菌 病 （ ｒｃｌ ｓ ）是 世界 上常 见的 ５种细 Ｂｕｅｏｉ ｌ ｓ 菌 性动 物传 染病 之 一 。 据 抗原 性 的差 异 和 第一 宿 根 主的不 同 ， 布鲁 菌属 （ｒｃｌ ）包 含有 牛 布鲁 菌 （ ｂｕｅａ ｌ ．
ａ ｏｔｓ 、 布 鲁 菌 （ ｍ ｌｅｓ ） ｂｒ ） 羊 ｕ ． ｅｉ ｎｉ 、猪 布 鲁 菌 （ ｔ ｓ ．
鲁菌 感染 人后 能 引起 全 身 网状 内皮 系统 增 生 ， 常伴
随菌 血症 、 血症 和神 经 、 疫 、 环 、 毒 免 循 生殖 系统 的损 害 ， 易转 变 成慢 性 感 染 。感 染 动 物后 常 导 致 生 殖 极 系 统 的损 害 ， 成严 重 的经 济 损 失 。 由于具 有 流 行 造 性 以及 目前 的疫 苗 株 安全 性 方 面存 在 缺 陷 ， 够 通 能 过 气溶 胶感 染 ， 布鲁 菌 被 划分 为生 物 安 全 ３级 并 被 作 为潜 在 的生物 恐怖 战剂 ¨ 。 】 布 鲁菌 是 一个 “ 祟 险 恶 的 病 菌 ” 鬼 。布 鲁 菌 基 因组含 有两 个 环形 染 色 体 ， 含质 粒 ， 存 在 Ｉ、 不 不 Ⅱ
布鲁 菌和宿 主细 胞开 始 的接触 显然 是发 生在 细
菌表 面 和细胞 质膜 之间 。 布 鲁菌 的脂 多糖 是毒 力 因子 。该毒 力 因子 的免
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粗糙型布鲁菌激活四型分泌系统诱导巨噬细胞死亡的分子机制
研究
布鲁菌是人畜共患布鲁菌病的病原菌,主要引起动物流产和人的波状热。
布鲁菌的毒力主要体现在入侵吞噬细胞并在胞内存活和复制的能力。
布鲁菌侵入宿主细胞后通过表达一系列的毒力相关因子来完成胞内存活和复制过程,脂多糖（LPS）和Ⅳ型分泌系统（T4SS）是布鲁菌最为关键的两个毒力相关因子。
根据LPS的完整性,将布鲁菌分为光滑型（S型）和粗糙型（R型）。
R型布鲁菌能够诱导巨噬细胞死亡,并且该过程依赖于T4SS。
然而,R型布鲁菌致死巨噬细胞的分子机制还不清楚。
本研究利用Luciferase报告基因、Western blotting、qPCR等方法对其进行了探究,并且利用Label-free蛋白组学技术对T4SS关键效应蛋白进行筛选鉴定。
本研究中,为确定T4SS在R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,我们利用FITC-Annexin V/propidium iodide双荧光染色法和检测乳酸脱氢酶释放量两种方法对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123感染巨噬细胞后的细胞毒性分别进行定性和定量检测。
结果显示,R型布鲁菌ΔrfbE诱导巨噬细胞死亡依赖于T4SS。
为探究T4SS 在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建T4SS分泌蛋白BPE123和VceC的融合Luciferase报告菌株对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123的T4SS分泌水平进行检测,结果表明ΔrfbE融合蛋白BPE123-Luc或Luc-VceC的分泌水平明显高于S2308。
进一步对S2308和ΔrfbE的T4SS表达差异分别用qPCR和Western blotting 进行检测,结果显示,在TSB、酸性和营养匮乏条件下,R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS
表达量显著高于S型布鲁菌S2308。
T4SS启动子virB的Luciferase报告菌株的检测结果表明,ΔrfbE的virB启动子活性显著高于S2308。
上述试验结果表明,T4SS的表达和分泌能力在R型布鲁菌中显著高于S型布鲁菌。
为探究R型布鲁菌ΔrfbE T4SS上调表达的原因,我们利用qPCR分析了T4SS 的调控相关基因的转录水平。
结果显示,与S2308相比,ΔrfbE的VjbR上调表达,MdrA和BlxR下调表达。
为确定VjbR、MdrA和BlxR在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建了ΔrfbE的VjbR缺失株以及MdrA和BlxR的过表达菌株,并对这些菌株的细胞毒性进行了定性和定量检测。
结果表明,ΔrfbE缺失VjbR后不再具有细胞毒性;ΔrfbE过表达BlxR后细胞毒性显著降低;但ΔrfbE过表达MdrA后细胞毒性仍然很强。
为研究VjbR和BlxR对T4SS的调控作用,我们利用qPCR分析了ΔrfbEΔvjbR和ΔrfbE（pBlxR）菌株的virB4的表达水平。
结果显示,VjbR对ΔrfbE的T4SS过表达起到了关键的作用,而BlxR只起到了一定的作用。
R型布鲁菌激活巨噬细胞凋亡或焦亡与细胞内质网压力应激IRE1α信号通路相关,为探究R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS分泌上调对内质网应激的影响,利用Western blotting鉴定了S2308和ΔrfbE感染巨噬细胞后IRE1α磷酸化（p-IRE1α）水平。
结果显示,与S2308相比,ΔrfbE引起更强烈内质网应激。
运用p-IRE1α专性抑制剂4μ8c处理细胞后检测ΔrfbE对巨噬细胞毒性。
结果显示,抑制p-IRE1α后ΔrfbE对巨噬细胞的毒性显著降低。
该系列结果表明,R型布鲁菌通过VjbR上调和BlxR下调表达协同调控T4SS的转录并激活
IRE1α信号通路致死巨噬细胞。
我们对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123进行了差异分泌蛋白质组学分析,以期筛选到致死巨噬细胞中起到关键作用的T4SS效应蛋白。
将三个菌株在RPMI-1640营养缺乏培养基中诱导8 h制备分泌蛋白样品,发现R型布鲁菌的蛋白分泌量明显高于S型布鲁菌。
质谱分析共鉴定肽段数9020个,蛋白质组数1131个。
GO分析发现,差异蛋白主要参与细胞过程和代谢过程等重要的生物学过程,集中分布在细胞和细胞组分,具有催化活性和结合活性的分子功能。
KEGG分析发现,差异蛋白主要位于氨基酸的生物合成、双组份系统、碳代谢、嘌呤代谢、核糖体、NOD样受体信号通路、细菌分泌系统等重要通路。
运用细菌的定向缺失和过表达技术分析了差异分泌蛋白对S型和R型布鲁菌细胞毒性的影响,结果显示,OmpW蛋白（BAB1<sub>1</sub>579）和假定蛋白
（BAB1<sub>1</sub>185）与布鲁菌的细胞毒性密切相关。
同时,我们发现R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞与其T4SS的组分无关,而是T4SS分泌的某些效应蛋白起到了关键作用。
综上所述,本研究揭示了R型布鲁菌ΔrfbE通过上调表达VjbR和virB操纵子的转录而导致T4SS的过表达并分泌过量的T4SS效应蛋白,在VceC、OmpW蛋白（BAB1<sub>1</sub>579）和假定蛋白（BAB1<sub>1</sub>185）等多种分泌蛋白的作用下过激活p-IRE1α引起内质网压力应激最终导致巨噬细胞死亡。
本研究为粗糙布鲁菌诱导巨噬细胞死亡的分子机制提供了新的见解。