如何添加酶切位点
序列分析软件DNAMAN 的使用方法简介
序列分析软件DNAMAN 的使用方法简介DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。
由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。
本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。
打开DNAMAN，可以看到如下界面：第一栏为主菜单栏。
除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，(如左所示：)点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。
每个Channel 可以装入一个序列。
将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。
此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。
本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。
1．将待分析序列装入Channel（１）通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。
（初始为channel1）可以通过激活不同的channel (例如：channel5)来改变序列装入的Channel。
（２）通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 。
通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。
2．以不同形式显示序列通过Sequence//Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示：根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。
对话框选项说明如下：Sequence &Composition 显示序列和成分Reverse Complement Sequence 显示待分析序列的反向互补序列Reverse Sequence 显示待分析序列的反向序列Complement Sequence 显示待分析序列的互补序列Double Stranded Sequence 显示待分析序列的双链序列RNA Sequence 显示待分析序列的对应RNA 序列3．DNA 序列的限制性酶切位点分析将待分析的序列装入Channel，点击要分析的Channel，然后通过Restriction/Analysis 命令打开对话框，如下所示：参数说明如下：Results 分析结果显示其中包括：Show summary（显示概要） Show sites on sequence（在结果中显示酶切位点）Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶切模式图）Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）Ignore enzymes with less than（忽略小于某设定值的酶切位点）Target DNA （目标DNA 特性）circular（环型DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）all DNA in Sequence Channel（选择此项，在Sequence Channel 中的所有序列将被分析，如果选择了Draw restriction pattern，那么当所有的channel 中共有两条DNA 时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上DNA 时，则只能用一个酶分析。
DNAman使用说明
查看文章DNAMAN使用说明书（中文）2008年04月16日星期三下午10:50DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。
由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。
本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。
打开DNAMAN，可以看到如下界面：第一栏为主菜单栏。
除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，(如左所示：)点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。
每个Channel 可以装入一个序列。
将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。
此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。
本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。
1．将待分析序列装入Channel（１）通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。
（初始为channel1）可以通过激活不同的channel (例如：channel5)来改变序列装入的Channel。
（２）通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 。
通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。
2．以不同形式显示序列通过Sequence//Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示：根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用[整理]载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来T连入质粒中的重要目的酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
只能切一个，酶都切不好。
因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如promega的说明书上说，最好隔四个。
我看AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
的酶。
最好使用双酶切有共同buffer最好使用自己实验室有的酶，这样可，ecor1等），最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1以省钱。
的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
的计算，关于TmTm大家可以理解，双链溶解所需的温度。
即是DNA叫溶解温度（melting temperature, Tm），Tm因此，的溶解是没有作用的。
而不互补的区域对DNA 这个温度是由互补的DNA区域决定的，（除时，只计算互补的区域Tm才有贡献。
计算Tm只有和模板互补的区域对对于引物的Tm，过低，是因为他们误把保护碱。
不少战友设计的引物都Tm 非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
DNAMAN中文使用说明
DNAMAN中文使用说明好不容易找到了一个中文说明，希望可以帮助初学使用DNAMAN的朋友，更快的进入状态，当然现在网上也有汉化版的软件了，但是这个说明还是可以起到很好的帮助作用，与大家分享！DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。
由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。
本文以DNAMAN 5.2.9 Demo version 为例，简单介绍其使用方法。
打开DNAMAN，可以看到如下界面：第一栏为主菜单栏。
除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，(如左所示：)点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。
每个Channel 可以装入一个序列。
将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。
此版本DNAMAN 提供自动载入功能，用户只需激活某个Channel，然后打开一个序列文件，则打开的序列自动载入被激活的Channel 中。
本文以具体使用DNAMAN 的过程为例来说明如何使用DNAMAN 分析序列。
1．将待分析序列装入Channel（１）通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。
（初始为channel1）可以通过激活不同的channel (例如：channel5)来改变序列装入的Channel。
（２）通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 。
通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。
2．以不同形式显示序列通过Sequence//Display Sequence 命令打开对话框，如下图所示：根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。
设计引物如何设计酶切位点
经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与0分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。
同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。
我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。
原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
甲基化质粒构建
甲基化质粒构建甲基化质粒构建是基因治疗中的重要环节，其目的是将目的基因插入甲基化质粒载体中，以保护目的基因免受宿主细胞免疫系统的攻击。
本文将介绍甲基化质粒构建的七个方面。
1.目的基因获得目的基因可以通过基因文库、PCR、人工合成等方式获得。
这些方法都可以得到目的基因的DNA序列，但需要对其表达量和纯度进行鉴定。
2.甲基化酶切位点添加为了将目的基因插入甲基化质粒载体中，需要在目的基因和载体中添加适当的甲基化酶切位点。
这些位点可以是一些特定的酶切位点，如SacⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ等。
添加这些位点可以通过一些基因工程手段实现，如通过DNA重组技术将甲基化酶切位点序列添加到目的基因和载体中。
3.甲基化质粒载体构建甲基化质粒载体是携带甲基化酶切位点的质粒，可以将目的基因运送到宿主细胞中。
构建甲基化质粒载体的方法包括将甲基化酶切位点插入到质粒载体的合适位置，并保证其稳定性和可复制性。
插入位点应该选择多拷贝数和高转录效率的位点，以保证目的基因的高效表达。
4.目的基因与甲基化质粒载体酶切后连接将目的基因与甲基化质粒载体进行酶切后，可以使用DNA连接酶将它们连接起来。
这一步骤需要选择合适的连接方式，如通过T4DNA 连接酶进行连接。
同时，连接过程中需要注意温度、pH值、离子浓度等参数，以保证连接的效率和稳定性。
5.连接产物转化连接产物需要在受体细胞中进行转化，以得到甲基化阳性克隆。
转化方法可以是有丝分裂转化或电转化，其中电转化效率较高。
在进行转化时，需要选择合适的受体细胞，如大肠杆菌、酵母等。
同时，需要对受体细胞进行筛选，以得到含有目的基因的阳性克隆。
6.甲基化阳性克隆筛选甲基化阳性克隆是指含有目的基因并且具有甲基化酶切位点的克隆。
筛选这些阳性克隆可以通过一些分子生物学技术，如PCR、DNA 测序等。
初步筛选可以找到一些阳性克隆，但为了确保目的基因的稳定表达和正确甲基化，需要进行进一步鉴定。
7.甲基化质粒大量制备在得到甲基化阳性克隆后，需要进行大量制备以满足后续实验或应用的需求。
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点是一种在分子生物学实验中常用的技术，用于引导限制性内切酶切割特定的DNA序列。
其原理如下：
1. 设计引物：首先，根据需要切割的DNA序列，设计两个引物。
这两个引物通常位于目标序列的两端，其序列会与目标序列的末端互补配对。
引物的设计要求尽可能准确，以确保引物与目标序列的互补配对能够稳定形成。
2. 引物结合：将设计好的引物与待切割的DNA序列加热至高温，使其双链DNA解链。
随后，将体系温度降低，使引物与DNA序列的互补链能够重新结合。
3. 添加限制性内切酶：在引物结合的体系中添加限制性内切酶。
限制性内切酶是一类能够识别并切割特定DNA序列的酶。
它
们通常与特定的核酸序列互作，并在该序列特定的位置引发剪切作用。
4. 酶切：限制性内切酶与DNA序列中的酶切位点结合，以酶
切作用切割DNA链。
由于引物结合形成的DNA序列中引入
了酶切位点，因此限制性内切酶能够在这些位点上发挥作用，导致DNA序列在酶切位点处断裂。
5. 分析：酶切作用后，可通过各种分析方法来检测DNA序列
的切割情况。
常见的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应（PCR）、或者直接观察DNA条带的可见性。
总结起来，在引物加酶切位点的方法中，引物的设计与酶切位点的结合是关键步骤。
通过合理设计引物，并选择适合的限制性内切酶，可以实现精确的DNA序列切割。
这对于分子生物
学研究、基因工程、或者遗传性疾病诊断等领域具有重要意义。
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当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：
a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。
这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。
b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。
如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。
当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
PCR设计引物时酶切位点的保护?
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25
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75
>90
>90注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3。
加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。
但实验证明，大多数限制酶对裸露
的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
下表列举了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。
表中的：(-)?为不能切断；(±)?为
不能完全切断；(+)?为能完全切断。
结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。