小鼠骨髓细胞微核试验
实验五小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞的采集与处理
小鼠麻醉
将小鼠麻醉，并固定在 操作台上。
暴露骨髓
用消毒手术刀切开小鼠 的腿骨，暴露骨髓腔。
采集骨髓细胞
用注射器吸取生理盐水， 冲洗骨髓腔，收集骨髓
细胞。
细胞处理
将采集的骨髓细胞进行 洗涤、离心、分离等处 理，得到所需的细胞样
本。
骨髓细胞的培养与观察
细胞培养
将处理后的骨髓细胞接种在细胞 培养皿中，加入适量的细胞培养 基，在适宜的温度和湿度条件下 进行培养。
率之间存在正相关关系。
本实验为进一步研究致突变物的 致突变作用提供了有力证据，有 助于深入了解致突变物的致癌机
制。
对实验结果的理解与讨论
本实验结果表明，致突变物能够诱导小 鼠骨髓细胞微核的形成，这可能是致突 变物导致基因突变和细胞恶性转化的重 要机制之一。
实验结果还提示，致突变物的致突变作用可 能与其在体内的代谢活化有关，因此需要进 一步研究致突变物的代谢活化过程及其与微 核形成之间的关系。
实验五小鼠骨髓细胞 微核试验
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 结论与讨论
01 实验目的
了解微核试验的原理
微核试验是一种用于检测染色体畸变和DNA损伤的细胞遗传 学方法。它通过观察细胞中微核（微小的细胞核）的数量， 来评估细胞受到的遗传损伤程度。
染色体结构畸变
分析实验组和对照组的染色体结构畸变类型，如断裂、倒位、重 复等。
染色体数目畸变
观察染色体数目畸变情况，包括非整倍体、多倍体等。
畸变类型与实验条件关系
探讨不同实验条件下染色体畸变类型的差异及其与实验条件的关系。
实验结果与预期结果的比较
小鼠骨髓细胞微核试验
注意事项
Giemsa染液pH6.8是细胞染色质量的重要 保证； 推制良好的骨髓涂片是本试验的关键步骤； 正确区分PCE细胞、NCE细胞及白细胞； 正确区分微核与染料颗粒。
材料
试剂：甲醇、冰乙酸、吉姆萨（Giemsa） 染液、小牛血清、磷酸盐缓冲液pH6.8， 环磷酰胺。 器材：晾片架、1ml注射器及针头、载波 1ml 片及推片、显微镜（具油镜头），细胞计 数器。 动物：小鼠，体重24-28g，雄鼠。
试验方法
1、给药：将小鼠称重随机分成二组，一 组为生理盐水组（腹腔注射0.2ml/10g.W)， 一组为环磷酰胺组（腹腔注射 1mg/10g.W)。 2、涂片：给药24h后用颈椎脱臼处死小鼠， 取出股骨，用滤纸擦净，纵形剪去1/4-1/3， 用针头挑出骨髓，放在已滴好一小滴小牛 血清的载波片上（血清宜滴在载玻片的一 端），用眼科镊头将骨髓团充分分散，推 片，在空气中晾干。
小鼠骨髓细胞微核试验 Micronucleus Test for Bone Marrow Cell in Mouse
西南大学药学院
目的
学习小鼠骨髓多染红细胞（ PCE）微核测 定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体 的损伤作用
原理
微核是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核 一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏 仁状。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响 而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质， 因而微核试验能检测药物或其它物质诱导产生的 染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传 学终点。 微核试验可用多种细胞，但在有核细胞中难于与 正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE中 的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分离后 数小时将主核排出而微核被保留下来。
小鼠骨髓细胞微核试验
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4.3 固定
将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇 溶液固定15分钟，取出，晾干。不能及时 染色的涂片也应固定好保存。
4.4 染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的 Giemsa (Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐 缓冲液9份) 染色10~15分钟，冲洗，晾干。
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MN NCE
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红细胞
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电镜
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单个微核
多个微核
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Hale Waihona Puke 16医学ppt17
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3 器材与试剂
3.1 器材 解剖器械，生物显微镜，载玻片 等。
3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析 纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa 储备 液、 pH 6.8磷酸盐缓冲液
3.3 阳性对照物 环磷酰胺
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4 操作步骤
4.1 试验动物及处理
动物选择 小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12
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4.5 观察计数
低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀， 着色适当的区域，再在油镜下观察计数。
多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞 （NCE）呈橘黄色。典型的微核多为单个、 圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致， 呈紫红色或蓝紫色 。
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计 数200个细胞中PCE与NCE的比值。
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化学致突变物
染色体
作用于纺锤丝
无着丝点,片或环
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
小鼠骨髓细胞微核试验讲解学习
染毒途径：经口、经皮、经呼吸道、注射。
染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样） 两次染毒法（第一次染毒24h后进行第二次染毒，6h取样）
五、操作步骤
本次实验染毒处理： 环磷酰胺
剂量：0.8mg/10g 每次染毒(腹腔注射） 次数：多次染毒法（4次）----最佳浓度及作用时间
五、操作步骤
骨髓液制备 ↓
涂片 ↓
染色 ↓
观察与计数
五、操作步骤
骨髓液制备及涂片 猝死：颈椎脱臼、麻醉 取组织：胸骨、股骨 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均匀
五、操作步骤
染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加试剂一5滴，
迅速均匀盖满涂片，染色1.5 min 2. 不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二10滴， 轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后镜检
到严重抑制，实验结果不可靠
2. 微核率：含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表 示
（若一个PCE中出现两个或两个以上微核，仍按有一个微核细胞计数）
3.阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，根据实 验对象的不同，应与相关文献报道或研究历史数 据相一致。
4.统计分析（Poinsson分布、二项分布、X2检验等）
试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时， 可认为受试物为具有遗传毒性。
骨髓微核观察的步骤
取胸骨
擦净血污，剔去肌肉
剪去骨骺端
小牛血清
混匀、推片
晾干
Giemsa应用液 反面冲洗、晾干 细胞计数
六、注意事项
骨髓液制备：迅速。在胎牛血清中迅速制取骨 髓液。
实验三小鼠骨髓细胞微核试验
实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。
二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。
微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。
骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。
三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。
2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。
3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。
4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。
5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。
6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。
7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。
四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。
通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。
为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。
通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。
这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。
2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。
4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。
《动物毒理实验》课件：实验二 小鼠骨髓细胞微核试验
6 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千 分率表示。
• PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组 PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意 义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结 果不可靠。
正常PCE/NCE约为1（正常范围0.6-1.2），如比 值小于0.1，表示PCE形成受到严重抑制；如比 值小于0.05，表示受试物剂量过大，实验结果不 可靠。
4 操作步骤
• 4.1 给药
环磷酰胺生理盐水溶液按50mg/kg剂量腹 腔注射2次，间隔24h。 空白对照：生理盐水
4 操作步骤
• 4.2 骨髓液的制备和涂片
试验动物第二次染毒6小时后用颈椎脱臼 或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污， 剔去肌肉。 在洁净的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺， 用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片， 干燥。
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成
3 实验材料
• 3.1 器材 解剖器械，显微镜，载玻片等。 • 3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析
纯）、Giemsa储备液、pH 6.8磷酸盐缓冲 液、小牛血清、生理盐水 • 3.3 药物 环磷酰胺 雄各半。
4 操作步骤
• 4.3 固定
将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇 液固定5-10min，取出，晾干。不能及时染 色的涂片也应固定好保存。
4 操作步骤
• 4.4 染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa 染液(Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐缓 冲液9份) 染色10-15min，冲洗，晾干。
实验二 小鼠骨髓细胞微核试验
2 实验原理
• 微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规 律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在 细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒 断片或环。它在末期以后，单独形成一个 或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质 内而形成，由于比核小得多故称微核。
毒理学 实验三、微核试验
两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒， 6小时后取样；
多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天， 末次染毒后24小时取样。
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2．骨髓液的制备和涂片
处死：颈椎脱臼法 处理： 取股骨，去掉血污和肌肉，用弯止血钳将骨髓
挤于预先滴有生理盐水的清洁载玻片上，混合均匀后推片
微核试验是观察受试倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
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微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
实验三、小鼠骨髓细胞微核试验
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微核(Micronucleus)的概念
微核的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单 体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色 体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单 独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质 内，因比主核小，故称微核。
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微核试验(Micronucleus test，MNT)的概念
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
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6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
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3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介_百替生物
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介_百替生物小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
微核试验
5．观察计数 先在低倍镜下观察，选择 分布均匀，染色较好的区域，再在油镜 下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染 红细胞（NCE）呈桔黄色。一个细胞内 可出现一个或多个微核。计数200个 PCE中含有微核的PCE数.
结果统计
本试验中只计数PCE中的微核。每一动 物为一观察单位，每组动物分别计算微 核PCE的均值。全班一起用t一检验统计。
什么是PCE?简单的说PCE就是一种刚 排核而未成熟的红细胞。红细胞是在骨 髓中生成的，骨髓中的红系祖细胞经过 数次分裂，最后脱核成为成熟的红细胞。 脱核后早期，红细胞内血红蛋白的主要 成分球蛋白的合成旺盛，因此胞质中存 在大量的核糖体，Giemsa染色呈灰蓝色， 这就是PCE。随着球蛋白合成完毕，核 糖体完全分解，PCE逐渐形成成熟的正 染红细胞。
注意事项
操作时推制良好的骨髓涂片及良好的染 色，是本实验的关键步骤。
熟悉并正确区分各种骨髓细胞。
MN NCE
பைடு நூலகம்细胞
电镜
单个微核
多个微核
（二）器材 晾片架， 1ml注射器及针头，载玻片及 推片，止血钳，显微镜（油镜头），细 胞计数器。
（三）动物 昆明种小鼠，体重24-28g，雄性。
实验方法
1．染毒：每组取小鼠4只，称重随机分 成二组，一组生理盐水组，腹腔注射生 理盐水0.2ml/10g，一组为环磷酰胺组， 环磷酰胺接100mg/kg腹腔注射 （0.2ml/10g）。
2．涂片 给药24小时后用颈椎脱臼方法 处死动物，四肢固定于解剖板，剖开胸 腹部，取下胸骨，剔去肌肉。将胸骨骨 髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，推 片。
3．固定 将推好晾干的标本玻片放入甲醇 溶液固定15分钟，取出晾干。
4．染色 用新鲜配制的10%Giemsa染液染 色15分钟。冲洗后晾干。
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
小鼠骨髓多染红细胞微核试验实验原理微核是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞浆内形成的游离团块物质。
微核实验作为细胞遗传损伤的标志之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。
当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排除，成为多染红细胞，这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血中。
在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。
由于这些细胞没有主核，便于观察微核。
观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。
本次试验的检测终点为染色体损伤。
一、实验动物健康的成年ICR小鼠50只，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，随机分组。
二、试剂与其器材40%工业久效磷，环磷酰胺，PH6.8的小牛血清，甲醇，PH6.8的磷酸缓冲液，Giemsa 染液；注射器、小鼠灌胃针头、动物秤、剪刀、镊子、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜。
三、试验方法1.实验动物：采用配伍组设计法对小鼠进行分组。
每组10只，共5组。
2.剂量分组：设置阳性对照及阴性对照组。
阳性对照物采用120mg/kg环磷酰胺，阴性对照物采用蒸馏水。
此外设计三个剂量组，分别为高中低剂量组。
通常取受试物LD50的1/2,1/4,1/8等剂量。
剂量分别为13.2mg/kg，6.6mg/kg，3.3mg/kg。
3.染毒途径：经口灌胃染毒。
4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。
5.取材：按照上述步骤染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。
用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。
6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定5分钟。
7.染色：用1:9的Giemsa-磷酸缓冲液（PH6.8）染色约10-15分钟，自来水冲洗后，自然干燥。
8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，在低倍镜下观察染色及分散情况。
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剂量及分组
受试物应至少设三个剂量组，最高剂量组 原则上为不产生动物死亡的最大毒作用剂 量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50 剂量。
另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照 组可用环磷酰胺腹腔注射1次。阴性对照组 使用等体积的溶剂。
3 器材与试剂
3.1 器材 解剖器械，生物显微镜，载玻片 等。
3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析 纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa 储备 液、 pH 6.8磷酸盐缓冲液
3.3 阳性对照物 环磷酰胺
4 操作步骤
4.1 试验动物及处理
动物选择 小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12
红细胞
电镜
Hale Waihona Puke 单个微核多个微核5 结果分析与评价
本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分 率表示。
PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组 PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意 义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结 果不可靠。
阴性对照和阳性对照组的微核发生率，应 与相关文献报道或研究历史数据相一致。
MN NCE
染毒途径 腹腔注射
染毒次数及取样时间 一般采用两次或多次染毒。两次染毒：第
一次染毒后24小时进行第二次染毒，6小时 后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续5 天，末次染毒后24小时取样。
4.2 骨髓液的制备和涂片
试验动物一次染毒后，按确定的时间用颈 椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净 血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型止血 钳将骨髓挤于有一小滴小牛血清的清洁载 玻片上，混合均匀后推片。也可在股骨取 骨髓。
化学致突变物
染色体
作用于纺锤丝
无着丝点,片或环
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
于细胞分裂末期细胞质中
微核成因
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成
因此，微核试验用于检测断裂剂和部分非整 倍体致突变剂。
微核可出现在多种细胞中，但在有核细 胞 中较难与正常核的分支相区别，由于红 细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将 主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因 此，通常计数PCE细胞中的微核数。
4.5 观察计数
低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀， 着色适当的区域，再在油镜下观察计数。
多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞 （NCE）呈橘黄色。典型的微核多为单个、 圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致， 呈紫红色或蓝紫色 。
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计 数200个细胞中PCE与NCE的比值。
1 目的
通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染 红细胞（PCE）微核测定方法。
2 原理
微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有 规 律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留 在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝 粒断片或环。它在末期以后，单独形成一 个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞 质内而形成，由于比核小得多故称微核。
阳性及阴性对照组处理方法同上。
4.3 固定
将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇 溶液固定15分钟，取出，晾干。不能及时 染色的涂片也应固定好保存。
4.4 染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的 Giemsa (Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐 缓冲液9份) 染色10~15分钟，冲洗，晾干。