不同代次骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的体外研究
骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究
骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究目的：探索骨髓间充质干细胞膜片的体外构建简便方法，并评估其成骨分化潜能。
方法：将兔骨髓间充质干细胞高密度接种，在成骨诱导条件下连续培养形成细胞膜片。
通过组织学、碱性磷酸酶活性定量检测、透射电镜和扫描电镜等方法，检测细胞膜片的特性。
结果：高密度连续培养及成骨诱导后形成骨髓间充质干细胞膜片。
HE染色证实膜片是一种由多层细胞和细胞外基质组成的聚集体；茜素红染色呈阳性；碱性磷酸酶定量分析含量较高；扫描电镜及透射电镜检查均见基质中大量的矿化结节聚集。
结论：通过体外简单的连续培养和成骨诱导后，可形成具有良好成骨能力的骨髓间充质干细胞膜片。
标签：间充质干细胞；细胞膜片；成骨分化组织工程技术的出现和兴起标志着再造时代的来临，传统的基于细胞的骨组织工程，是利用大量的种子细胞种植在支架材料上，通过活性因子等诱导细胞分化成骨[1]。
但研究发现该方法存在一些缺点，如细胞利用率低、附着效率差；细胞在支架材料上分布不均；常用的蛋白酶消化收集细胞的方法，会改变细胞的表型和生化成分。
并且，培养过程中细胞分泌的细胞外基质及形成的细胞间连接蛋白也常被破坏[2]。
目前这些问题一直未能圆满解决，已成为限制骨组织工程技术应用于临床的瓶颈。
1993年日本学者Okano等[3]首先报道将聚N-异丙基丙烯酰胺应用到细胞培养上，创新性地发明了细胞膜片技术。
应用特殊的外源性温敏聚合物材料提取完整的细胞聚集体，用于组织工程构建。
该技术借助细胞间的连接以片状形式脱附，保留了基质中细胞与细胞间连接、细胞表面蛋白等，细胞生物学行为和功能得以维持[4]。
在本实验中，笔者探讨体外构建骨髓间充质细胞膜片的培养方法并予以改进，试图进一步缩短膜片培养时间，同时增加膜片厚度，以利于构建组织工程骨。
1 材料1.1 实验动物：3月龄成年新西兰大白兔，体重2.5～3.0kg，由乌鲁木齐总医院实验动物中心提供。
1.2 实验仪器设备：倒置相差显微镜及照相系统（Olympas，日本）；酶联免疫检测仪（BIO-RAD680，美国）；JEM-2000EX透射电镜（JEOM Ltd，日本）；S-3400N 扫描电镜（Hitachi，日本）；X-射线能谱分析仪（Oxford，Link ISIS，英国）。
不同代次骨髓间充质干细胞的生物学特性
７９９－８１２． ［１２］ Ｌｅｅ ＫＳ，Ｍｉｎ ＫＨ．ＫｉＩｎ ＳＲ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ［Ｊ］．Ａｉｎ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ， ２００６，１７４（２）：１６１－１７０． ［１３］ Ｋｉｍ ＪＨ，Ｌｅｅ ＳＹ，Ｂａｋ ＳＭ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｔｉｘ
１．４ 免疫荧光鉴定 目 前 还 没 有 直 接 的 方 法 可 以 鉴定 ＢＭＳＣｓ。鉴 定 ＢＭＳＣｓ的 方 法 全 都 是 根 据 细 胞培养 过 程 中 出 现 分 化 表 型 后 逆 推 判 断 是 否 为 ＢＭＳＣｓ，ＢＭＳＣｓ 的 细 胞 阳 性 表 面 标 志 如 ＳＨ－２、 ＳＨ－３、ＳＨ－４、ＳＢ－１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、 ＣＤ１０６ 、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２４ 等，而 ＥＳＡ、ＣＤ１ａ、ＣＤ３１、 ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ５６ 等 为 阴 性［７－８］，第 ２ 代 细 胞表面标志 ＣＤ４４，ＣＤ１０６，ＣＤ１０５均呈阳性表达，其 阳 性 率 分 别 为 ９５．１３％，６２．１２％，３９．１３％；而 ＣＤ３４，ＣＤ４５ 则 呈 阴 性 表 达 ，其 表 达 率 分 别 为０．４３％
中 图 分 类 号 ：Ｒ３２９．２＋７ 文 献 标 识 码 ：Ｂ 文 章 编 号 ：１０００－７４４Ｘ（２０１５）０１－００８３－０４ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ＩＳＳＮ．１０００－７４４Ｘ．２０１５．０１．０３５
间 充 质 干 细 胞 来 源 主 要 有 骨 髓 ，外 周 血 ，脐 带 脂 肪组织，外 周 血，胎 盘 羊 水，其 他 部 位 如 胰 腺、胎 肝、
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
间充质干细胞成骨向分化的分子调控机制探索
间充质干细胞成骨向分化的分子调控机制探索
陆大壮;张萍;周永胜
【期刊名称】《口腔生物医学》
【年(卷),期】2022(13)3
【摘要】本文结合文献复习概述了笔者研究团队在间充质干细胞(MSCs)成骨向分化分子调控机制方面的部分探索工作,从表观遗传调控、泛素化修饰、能量代谢三个方面阐述了对MSCs成骨向分化机制的新见解,拓展了基于改善MSCs成骨向分化能力从而促进口腔骨丢失防治和骨组织工程骨再生效果的策略。
【总页数】7页(P135-141)
【作者】陆大壮;张萍;周永胜
【作者单位】北京大学口腔医学院·口腔医院
【正文语种】中文
【中图分类】R780.2
【相关文献】
1.BMP9调控间充质干细胞成骨分化的分子网络：生物信息学分析
2.miR-449对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的机制研究
3.骨质疏松患者外周血差异表达miR-19b调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制研究
4.骨质疏松患者外周血差异表达miR-19b调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制研究
5.骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的平衡调控机制研究
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骨髓间充质干细胞在骨科中的应用研究进展
多 系 分 化潜 能 ， 分 化 后 各 种 组 织 细 胞 化 成 脂 肪 细 胞 的能 力 。Ａ ｉ 且 ｎｔ ａ等 也 发 生 成 ， 发 现无 抗 体 的 生 成 ， 明 无 免 疫 还 表
有 很 强 的增 殖 能 力 。Ｂ Ｓ ｓ 有 来 源 广 现 ， 着 细 胞 倍 增 倍 数 的增 加 ． 质 细 胞 排 斥 。 Ｗａ ｉ ｎ ｒ 人 的 Ｂ Ｃ Ｍ Ｃ 具 随 基 ｋｔ ｉ 把 ａ ｓ ｌ ＭＳ ｓ种 植 于 泛 ， 以 分化 为更 多 种 类 的 组 织 细 胞 。 可 分 形 成 的克 隆逐 渐 丢 失 成 脂 肪 和成 软 骨 的 Ｈ ／Ｃ Ａ Ｔ Ｐ然 后 移 植 到 免 疫 缺 陷 鼠 体 内 同 离 培 养 较 为 容 易 ． 植 入 反应 较 弱 ． 于 能力 。所 以 ， 果 准 备 在 临床 上 使 用 扩 增 样 发 现 骨 的生 成 。Ｐ ｉ ｒｒ 脉 注 射 Ｂ 且 易 如 ｅｉ ｒ ａｌ ｇ 静 Ｍ— 被 外 源 基 因 转 染 且 稳 定 表 达 ． 认 为 是 培 养 的 Ｂ Ｓ ｓ．验证 其 经 过 大 量 的扩 增 Ｓ ｓ 成 骨 不全 的转 基 因 鼠 ， 个 月 后 发 被 ＭＣ Ｃ 于 一 组 织 Ｔ 程 、细 胞 及 基 因治 疗 理 想 的靶 细 后 是 否 仍 保 持 分 化 潜 能 是 十 分 重 要 的 ． 现 骨 的胶 原 量 和矿 物质 含 量 具 有 明 显 的 胞 。 文对 近 年 来 有 关 Ｂ Ｃ 的生 物 学 经 大 量 扩 增 后 如 何 保 持 Ｂ Ｃ 本 ＭＳ ｓ ＭＳ ｓ的生 物 增 高 ， 同样 直 接 注 射 骨 髓 也 有 相 似 的 结 特 性 及 分 离 、 增 、 定 做 一 简 要 回顾 ， 学 特 性 的 问 题 仍 需 进 一 步研 究 。 扩 鉴 并 重 点 介 绍 其 在 骨 科 中 的 应 用 研 究 进
辛伐他汀刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化
辛伐他汀刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化邢磊;高静媛;汪晓旭;陈俞洁;迟博婧;田发明【摘要】背景:体外研究显示辛伐他汀有明确的刺激骨髓间充质干细胞成骨分化的作用,但机制不清.最新研究显示Hedgehog信号通路是骨髓间充质干细胞成骨分化的重要信号通路.目的:结合Hedgehog通路阻断剂环杷明的应用,观察辛伐他汀体外刺激大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制.方法:4周龄SPF级雌性SD 大鼠8只,分离出股骨和胫骨并去除干骺端,应用全骨髓贴壁培养法提取骨髓间充质干细胞.选取第2代骨髓间充质干细胞随机分成4组:①对照组:用成骨诱导培养基培养;②辛伐他汀组:用含有10-7 mol/L辛伐他汀的成骨诱导培养基培养;③辛伐他汀+阻断剂组:用含5μmol/L环杷明的完全培养基预先阻断2 h后,与辛伐他汀组同时加入含辛伐他汀的成骨诱导培养基培养;④阻断剂组:用含有5μmol/L环杷明的成骨诱导培养基培养.给药第7天行碱性磷酸酶染色,免疫荧光染色法和Western blot 检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达;给药第28天行茜素红钙染色.结果与结论:辛伐他汀组与对照组比较,碱性磷酸酶阳性着色细胞和钙结节增多,Ⅰ型胶原、骨钙素荧光强度和相应蛋白表达增高(P<0.05);除骨钙素荧光强度和蛋白表达外,其他指标在辛伐他汀+阻断剂组显著低于辛伐他汀组(P<0.05);阻断剂组各项指标均低于对照组(P<0.05).结果证实辛伐他汀通过刺激Hedgehog信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化,且不完全被环杷明阻断.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)025【总页数】6页(P3961-3966)【关键词】骨质疏松;骨髓间充质干细胞;辛伐他汀;环杷明;Ⅰ型胶原;骨钙素;成骨分化;河北省自然科学基金【作者】邢磊;高静媛;汪晓旭;陈俞洁;迟博婧;田发明【作者单位】华北理工大学附属医院老年病科,河北省唐山市 063000;华北理工大学附属医院老年病科,河北省唐山市 063000;华北理工大学附属医院老年病科,河北省唐山市 063000;华北理工大学附属医院老年病科,河北省唐山市 063000;华北理工大学附属医院老年病科,河北省唐山市 063000;华北理工大学医学实验研究中心,河北省唐山市 063000【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R394.20 引言 Introduction骨质疏松症是一种以骨量低下、骨组织微结构损坏为特征，最终导致骨脆性增加，容易发生骨折的全身性骨疾病[1-2]。
骨髓间充质干细胞的研究进展
骨髓间充质干细胞的研究进展【关键词】骨髓干细胞骨组织工程学研究内容要紧包括三方面a)种子细胞的研究；b)支架材料的研究；c)组织工程化骨的临床应用。
其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最大体的环节。
作为骨组织工程的理想种子细胞，应具有以下特点：a)结构比较简单，是不具有特定性能的原始细胞；b)取材容易，对机体损伤小；c)体外培育增殖能力强；d)可在必然条件下向特定方向转化；e)稳固表达到骨细胞表型；f)植入人体后能继续产生成骨活性；g)无致瘤性［1～2］。
20世纪70年代中期已证明骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem，BMSCs)具有自我增殖能力和分化潜能，且具有来源普遍、取材简单、分化成骨的潜能强等特点，成为目前骨组织工程种子细胞研究的重点。
1 BMSCs体外增殖的生物学特性及培育BMSCs的体外增殖生物学特性干细胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化为两种以上不同类型组织细胞的细胞；组织干细胞是指发育成熟的个体内具有多向分化潜能的细胞，目前比较明确的能够转化的组织干细胞主若是BMSCs。
对BMSCs的细胞周期研究说明，其大约有20％为静止期细胞，即G0期细胞。
这说明BMSCs具有壮大的增殖能力，每传一代细胞数量就增加2～4倍。
但有文献报导，高度传代(大于25代)的BMSCs中有一部份已经表现出凋亡特性。
BMSCs的体外培育Freiden stein发觉了骨髓培育中有呈纺锤状的少量贴壁细胞，能够分化形成多种中胚层组织，包括：骨、软骨、肌腱、肌肉组织、骨髓基质结缔组织等，这种形成集落的初始骨髓基质细胞被称为成纤维细胞样细胞集落形成单位(Colony forming unit firbroblastic，CFU F)。
Minguell［3］以为BMSCs为存在于骨髓基质中的非造血来源的细胞亚群，Ashton称其为骨髓基质成纤维细胞。
BMSCs对营养条件要求高，而且含量很低，约为％～％，要利用BMSCs就必需实现其体外分离培育及扩增［4］。
不同来源的间充质干细胞治疗骨与软骨组织疾病的研究进展
不同来源的间充质干细胞治疗骨与软骨组织疾病的研究进展JIN Zhenxiong;TANG Dezhi;XIAO Yanhua【摘要】近年来,随着细胞和组织工程技术的发展,间充质干细胞广泛受到关注和研究,具有易分离获取、培养过程相对简单等优点,并且能够自我更新并分化成多种细胞类型,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,是较为理想的种子细胞.在骨髓间充质干细胞大量的研究基础上,脂肪、骨骼肌、滑膜等多种不同来源的间充质干细胞也广泛应用在骨及软骨组织的体内研究和体外研究中.虽然间充质干细胞在基础性研究方面取得了飞跃进展,但在临床推广应用干细胞治疗上还面临着诸多问题,如对间充质干细胞的分化机理尚不明确,对其定向分化无法进行精确调控,且存在诸多限制骨和软骨再生的几个因素,很大程度上影响治疗的效果,故仍需进一步深入研究.【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2019(025)006【总页数】6页(P858-862,879)【关键词】间充质干细胞;骨;软骨;干细胞治疗;组织修复【作者】JIN Zhenxiong;TANG Dezhi;XIAO Yanhua【作者单位】;;【正文语种】中文【中图分类】R336现如今，组织工程技术在骨和软骨、血管、神经、皮肤、肌腱韧带等组织工程领域得到迅速发展。
干细胞(stem cell)是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有自我复制、再生、更新、多向分化等能力的细胞。
正是因为它的多分化能力和再生潜力使其大量应用于干细胞研究和再生医学中［1］。
干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类，成体干细胞又可根据其特定组织来源分为造血干细胞、骨髓及脂肪间充质干细胞、脐血干细胞等。
其中以骨髓及脂肪间充质干细胞在骨科应用较为广泛。
随着年龄的增长，身体健康的下降或其他因素的影响，内在再生潜能下降时，需要在创新疗法方面取得新的进展，因此基于细胞的修复策略已成为有希望的治疗策略［2］。
在正常情况下，它们保持静止状态。
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中图分类号 ： ２．１ Ｒ３ １ ５ ＤｏＩ １ ． ８ ０ ｊ ｉｓ ． ６ ２０ ４ ． Ｏ ２ ０ ． ０ ：０ ３ ７ ／．ｓ ｎ １ ７ — ７ １ ２ １ ． ２ ０ ２
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第 ４ １卷 第 ２ 第 １ ２页 期 ３ ２１ ０ ２年 ４月
华 中科 技 大学 学 报 （ 医学 版 ）
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４ ４ ０ ３ ００
华 中 科 技 大 学 同 济 医 学 院 附 属 荆 州 市 中心 医 院 血 液 科 ， 州 荆 。 南 省 泌 阳县 人 民医 院 肾 内科 ， 阳 河 泌 ４ ３ ０ ６７３
摘要： 目的
观 察 不 同代 次 人 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 （ Ｃ 体 外 成 骨 分 化 能 力 ， 优 化 组 织 工 程 种 子 细 胞 提 供 更 多参 ＭＳ ） 为
Ａｐ ． ｒ ２ ２ ０１
不 同代 次 骨髓 间充 质 干细 胞 成 骨 分 化 潜 能 的体 外 研 究 ＊
张 利铭 。 李秋柏 李新 建。 陈智超 邹 萍 ， ， ， ，
华 中 科技 大学 同 济 医 学 院 附 属协 和 医 院 血 液科 ， 汉 武 ４ ０ ２ ３０ ２
～
＜２ ０岁 组 Ｐ ～ Ｐ １ ５成 骨 分 化 能 力 无 显 著 差 异 （ ＞ Ｏ０ ） ３ Ｐ 低 于 Ｐ 、 ２ Ｐ ｏ ０ ） ＞ ４ １ Ｐ （ ＜ ． ５ ； ｏ岁 组 Ｐ 分 化 能力 下 降更 明显 （ ＜ Ｏ ０ ｒＰ Ｏ ０ ） Ｐ 、 ５ 乎 分 ３ Ｐ ． ５ｏ ＜ ． １ ，４ Ｐ 几
数 。方 法 应 用 全 骨 髓 直 接 贴 壁 法 分 离 培养 １ Ｏ例 健 康 志 愿 者 ＭＳ 依 照 年 龄 将 ＭＳ Ｃ， Ｃ分 为 ４ ， ２ 组 ＜ ０岁 ，ｏ岁 ～ ，Ｏ ２ ３ ～ ４ ｏ岁 ， ４ ＞ Ｏ岁 组 。取 Ｐ （ａｓｇ ） ５ 导 成 骨 分 化 ， 导 分 化 １ １ ｐ ｓａｅ１ ～Ｐ 诱 诱 ４ｄ予 以碱 性 磷 酸 酶 染 色 ， １ｄ茜 素 红 染 色 ， ｇ— ２ Ｉ ｅ ｍａ Ｐ ｏＰｕ 软 件 分 析 细 胞 染 色 阳性 区域 平 均 吸光 度 值 。结 果 ｒ ｌｓ
Ｔｅ ｈｎｏ ｏ ｃ ｌ ｇｙ， ｕｈ ００ ２ ， Ｗ ａｎ ４３ ２ Ｃｈｉ ａ ｎ
Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｆ Ｈｅ ｔｌｇ Ｊｉｚ ｏ ｐ ｒｍｅ ｔｏ ｍａ ｏｏ ｙ， ｎ ｈ ｕＣｅ ｔｒ Ｈｏｐｉａ ， ｎ ｊ Ｍｅ ｃ ｌＣｏｌｇ 。 ａ ｈ ｎ ｎ ｅ ｓ ｔ ｌ Ｔｏ ｇ ｉ ｄｉａ ｌｅ ｅ Ｈｕ ｚ ｏ ｇＵｎ ｖ ｒｉｙ ｏ ｉｅ ｓｔ ｆ
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不 同代 次 的 ＭＳ Ｃ分 化 能 力 具 有 异 质 性 ， 年 龄 有 关 。＞ ４ 与 Ｏ岁 组 ＭＳ Ｃ在 超 过 Ｐ 代 时 ， 胞 倍 增 时 间 明 ３ 细
化 受 阻 。 结论
显 延 长 ， 导 成 功 率 降低 ， 骨 分 化 潜 能 明 显 下 降 ， 择 Ｐ 诱 成 选 ２代作 为种 子 细胞 更 有利 于 细 胞 治疗 的 安 全 及 质 量 控 制 。