TAT-ODD介导的p53融合蛋白的靶向抗肿瘤作用的研究

TAT-ODD介导的p53融合蛋白的靶向抗肿瘤作用的研究中国人民解放军军事医学科学院博士学位论文TAT--ODD介导的p53融合蛋白的靶向抗肿瘤作用的研究姓名：赵宇申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：孙曼霁；王玉霞20100525摘要目前，癌症仍然是危害人类健康的主要疾病之一。

临床数据表明，超过50％的肿瘤的发生均与肿瘤抑制基因P53的突变有关。

P53基因是细胞中重要的肿瘤抑制基因，其编码产物p53蛋白在修复细胞基因组损伤，维持基因组稳定，以及在细胞处于极度应激条件下，发生不可逆损伤后诱导细胞凋亡，防止其由于基因变异发生恶性转化等方面发挥着重要的作用。

因此，p53蛋白被称为细胞中的“基因卫士”。

p53蛋白极易由于基因的突变发生功能的异常。

变异的p53蛋白不仅丧失了阻止正常细胞发生癌变的作用，还由于突变所产生的异常功能(Gain of如nction)启动一些原癌基因的过度表达，促进细胞的恶性转化，加速肿瘤的发生和发展。

因此，p53蛋白已经成为抗肿瘤治疗的热点分子。

虽然目前报道了许多以p53为治疗效应分子或以其为作用靶点的生物类制剂和小分子类化合物，可以通过补充野生型p53蛋白或修复肿瘤细胞中失活的p53蛋白功能抑制肿瘤细胞的增殖，清除癌细胞，但是由于其细胞穿透性和体内运输的靶向性较差，使其抗肿瘤效果很不理想，应用也受到了极大限制。

在恶性肿瘤中，90％以上属于实体瘤。

实体瘤的一个显著病理生理特征是组织内缺氧，即在实体瘤内部由于肿瘤细胞增殖和新生血管形成的速度不平衡，使得其组织内部存在瘤内缺氧区域(Hypoxia)。

处于该区域中的肿瘤细胞被称为缺氧肿瘤细胞(Hypoxic tumor cells)。

这种细胞的特点在于对于传统的放化疗作用具有极强的抗性，不易被彻底清除，是实体瘤发生晚期转移的主要原因之一，与这些细胞内缺氧诱导因子(Hypoxia．inducibIe facto佟，HIFs)的活性特异性增强密切相关。

HIFs家族包括三个主要成员HIF．1，HlF．2和HlF．3，其中HlF．1的结构和功能研究得最详细。

HIF．1是由a和p两个亚基组成的异源二聚体分子。

HIF．1p，在细胞中为组成型表达；HIF．1a由于其分子结构中具有氧依赖性降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)，在常氧条件下，氧依赖性HIF．1多聚羟化酶(HIF．1 proIyhydroxylase，HIF PH)羟化其ODD核心脯氨酸(Pr0 564)，进而通过von Hippel Lindau(VHL)蛋白介导的泛素．蛋白酶体途径降解；而在缺氧条件下，由于氧原子的缺失，HIF PH失活，HIF．1伍亚基可以稳定存在，其可以与p亚基聚合成二聚体，发挥转录因子的作用，调节一系列下游基因的表达，使细胞适应缺氧环境的应激刺激。

因此，如何有效的杀伤缺氧性肿瘤细胞是有效及彻底根治实体瘤的重要环节。

此外，有证据表明，具有突变型P53基因的肿瘤细胞更能适应缺氧环境，具有更高的恶性表型，更易发生转移和侵袭。

蛋白转导结构域(Protein transduction domain，PTD)是一类可以将外源性生物大分子通过跨膜转导作用导入细胞内的一类多肽，包括来自HIV-l的TAT，单纯疱疹病毒的VP22，果蝇头胸足编码序列编码的ANPT，以及其他以这些天然多肽4为模板人工合成的小肽类化合物。

这些肽类的共同特点是，其氨基酸序列中富含碱性氨基酸，并且可以通过与细胞膜上的某些表面分子相互作用，将本身难以通过易化扩散进入细胞的外源大分子类物质输入细胞。

已有研究表明，许多生物大分子，如DNA，siRNA，大分子蛋白质，甚至纳米颗粒都可以在盯D的介导下进入细胞。

这一发现为开发大分子生物治疗性药物提供了技术基础。

在众多PTD中，髓玎是研究最多、应用最广的一个。

通过研究表明，该多肽参与跨膜转导作用的核心结构为47～57残基段。

利用该区域构建的应用于研究或具有生物治疗作用的蛋白包括：秘小EGFP，TAT-HT，¨LT-p27等。

实验证实，这些偶联了TAT的蛋白可以有效的进入细胞或组织，并发挥其应有的生物学活性，为研发更多的W盯融合蛋白类药物提供了可靠的实验证据。

本课题以实体瘤的以上两个显著的生化生理特征为靶标，设计了一种新型的p53融合蛋白，吖mODD．p53，一方面可修复肿瘤细胞中突变的p53蛋白，重建正常的p53功能通路，另一方面有效的杀伤缺氧性肿瘤细胞，有效的切断实体瘤复发和转移的根源。

我们利用具有将外源大分子物质导入细胞的蛋白转导结构域w峨7-57多肽，可以使蛋白具有缺氧靶向稳定性的结构域oDD557．574与人野生型p53融合，构建了TAT-ODD-p53融合基因。

同时我们还构建了p53，吖mp53和”LT-ODD．EGFP 融合蛋白作为该蛋白的对照蛋白。

将上述基因克隆到原核表达载体pET28a载体中，在E∞坛(砚2．『)工程菌中表达。

将表达后的蛋白经变性，纯化和复性，得到高纯度的口爪0DD-p53融合蛋白。

我们利用免疫组织化学染色，免疫荧光染色和WeStem blotting的方法检测了融合蛋白在体外和体内的跨膜转运功能和缺氧靶向稳定性；利用MTT染色法，Annexin v-FITC&PI双染色经过流式细胞仪分析，测定了耵mODD-p53蛋白在不同氧分压下对肿瘤细胞生长的抑制活性和诱导细胞凋亡作用；通过PI单染色细胞流式分析测定了其在常氧和缺氧条件下诱导肿瘤细胞发生周期抑制的作用；通过Wbstem blon．ng在细胞水平检测p53相关下游基因表达水平的变化，对其可能的抑瘤机制进行了探讨。

另外，我们利用裸鼠建立了小鼠人源肿瘤荷瘤荷瘤模型，通过腹腔连续给药的方式，测定了W小ODD．p53的抑瘤活性，同时检测了蛋白在动物体内的分布和稳定性。

应用免疫组化技术，分析了该蛋白对肿瘤组织内p53下游相关基因的表达水平的调节，对其在体内发挥抗肿瘤活性的调节通路进行了研究。

实验结果表明：1．通过分子生物学技术，我们构建了TAT-ODD．p53融合基因，并将其克隆到原核表达载体中，在工程菌BL2l中成功的进行了表达；2．通过包涵体变性复性，并结合亲和层析法成功的得到了大量的高纯度的目的蛋白：3．通过细胞免疫荧光染色和weStem b10ning检测显示，"mODD．p53可以有效的进入肿瘤细胞；与在常氧细胞内相比，TA阳DD-p53在缺氧细胞内的稳定性显著提高，半衰期明显延长；4．细胞生长抑制实验显示，缺氧条件下，WmODD巾53 蛋白可以有效的抑制肿瘤细胞的生长，而在常氧条件下，作用不明显；5．通过流式细胞分析，与常氧条件比较，"LT-ODD-p53在缺氧条件下诱导肿瘤细胞发生凋亡的比例明显提高，更易引发肿瘤细胞生长的周期抑制；6．Westem blotting结果表明，缺氧状态下TAT-ODD．p53发挥其生物活性的主要机制是上调p2l蛋白的表达水平及激活caSpase．3通路诱导细胞凋亡，属于p53蛋白的经典作用途径；7．体内实验结构显示，TAT-ODD-p53蛋白可以选择性的积累于实体瘤内的缺氧区域，与瘤体内HIF．1a高表达区域完全一致，而在正常组织，如肝脏内几乎检测不到；8．通过统计的瘤重和瘤体积的数据表明，与其他对照融合蛋白相比，TAT-ODD-p53可以显著的抑制荷瘤鼠肿瘤的生长，没有观察到任何严重的副作用；9．对治疗后肿瘤组织中p53相关基因以及肿瘤特异性标志蛋白表达水平检测表明，t柞ODD．p53可以显著上调一些p53相关基因的表达，如p2l，PUMA，casp鼬e．3，并下调了肿瘤恶性标志性蛋白的表达，如EGFR和VEGF。

通过以上结果得出如下结论：TABODD．p53可以有效的穿透细胞膜进入细胞内部，并在实体瘤的缺氧区域内稳定存在；通过上调p53相关基因的表达以及抑制肿瘤恶性标志物蛋白的表达，抑制肿瘤细胞增殖，诱导缺氧性肿瘤细胞凋亡，实现其靶向抗肿瘤的作用。

在治疗过程中，通过观察动物日常行为和检测动物的血液生化指标，没有发现mDD-p53对受试动物有明显的毒副作用。

关键词：p53，实体瘤，缺氧，TAT，oDD6坠卫QQ旦企昱的笆三鼬金蛋自的塑自拉贮擅使用的班荭墓塞擅噩1Iargeted antitumor ef．fect of a noVel p53 protein fused with TATand ODD domainAbstractCancer is the major public problem around the world．Increasing clinical rcports suggested that oVer 50％tumors contain the mutant P53 gene．P53 gene is one of the most important tumor suppression genes and its encoding product，p53，plays a central role to inhibit the tumorigenesis，such as sustaining the genomic stabili吼repairing the DNA damage，and protecting the maIignant transfonnation Via inducing apoptosis ofcells which are su虢rcd the irreVersibIeⅫuⅨnerefore，p53 is calIed as“Genome guard”．HoweVer，p53 is highly suscept．ble t0 Various mutations leading to abnomali够Mutant p53 not only fails t0 protect the nornlal cells unde喀oing the tumorigenesis，but also臼iggers the oVer expression of a set of oncogenes t0 promote the cellular carcinogenesis 锄d accelerate the tumor progression．Hence，p53 h舔been a promising the豫peutic ta 唱et of tumor tlIeatlnent．AIthough various reagents haVe been deVeloped for rcstoration of inactiVe p53，tlleir utili妙eXtensiVely limited becau∞of their poor celI pe加eability 卸d low ta唱eting deliVery．MoreoVer，oVer 90％tIImors are S0lid tllmors．1nadequatc oXygenation，known觞hypox氓is the predominant pathophysiologicaI featu他in the solid tumo体．Theunequal balance between extensiVe cell prolif-cration and angiogenesis is the leading c 叫se to the insufficient supplement of oxygen in tale．MaIignant ceIls under thismicroenVironment are hypoxic tumor ce¨s which are extIIemely resistant to traditionaI chemO—and豫diotherapy and陀suIt in the metaSt弱is in the adv柚ced stage Of c柚cers．Hypoxia-inducible f．actors(HIFs)play a piVotaI r0Ie in the∞biological processes．HIFs family consists of three memberS，including HIF-l，HIF·2and HIF-3．HIF-l is we¨-studied．HIF-l is a heterodimer'containing a and p subunits．HIF—l p is conStitutiVe，but H IF-l a i s t he regulato哆subunit．Under n o肿ox氓HIF-1伍is u nstable．1ts oxygen-dependent degradation domain(ODD)couId induce its degradation Via unbiquitin-proteasome pathway mediated by、bn-Hipple Lindau protein(pVHL)．In the hypoxia'howeVer’oxygen is depriVed and HlF-l prolyhydroxylase(HIF PH) become inactiVated，fail to degrade HIF·1仉Via pVHL dependent pathway．The stable HIF-la could combine with p subunit’如nctioning嬲tmnscriptional factor to regulate a set of genes expression for the hypoxic adaption of tumor cells．The他f0佗，how t0thoroughly cle 锄the hypoxic tumor celIs is the key step for the re酉me of solid tumo体．More0Ver'it is suggested that hypoxia could select the subpOpulation of c醐cer cells harboring the mutant p53，which甜e more easiIy tO prone t0 haVe agg陀ssiVe phenotype to promote the progrcssion，inVasion and metastasis of tumors．PI．otein transduction domains，shoned as PTDs，are series of polypeptides which are capable t0 deIiver bio-macromoIecuIes into celIs via cross．memb隐ne transduction，7including 7I’AT peptide of HI、乙l，VP22 f而m HSV antennapedia homeoprotein of drosophila and a set of synthetic polypeptides with cell penneabiIity．The predominant f-eature of these peptides is rich of basic amino acid in the sequence，佗sulting in the inteI．action with sonle bio．nlolecules on the cell suIface to induce the intemalizalion of the macromolecules with poor cell pe加eability，鲫ch as DNA，siRNA，proteins with big molecular weight锄d even nano-particles．This put the promising insi曲t on thedeVelopment of therapeutic p“)tein dmgs．7I’AT is one of the moSt welI-studied andwidely used PTDs．Its minimum mnctional domain is the residue 47—57．Many repots displayed that Various 0f TAT如sed proteins we佗developed for research and，0r therapeutic utilities，such as TAT—EGFP，TAT-HT and TAT—p27，which could play their bio-mnctions deliVered int0 celIs an讹r tissues via 1’AT transportation．TheSe rcSults support the如ndamental info衄ation for向rther creation of TAT-baSed biologicaI reagents．In this study，aiming at rcStoration of dysmnctional p53彻d scaVenging me hypoxic cancer ceIIs iIl soIid tumor'a noVel p53如sion protein，TAT-oDD-p53，was designed forta唱eting ther印y of solid tumorS．This protein w舔如sed with TAT47-57，protein tmnsduction peptide，the minimum向nctional motif of ODD(oDD557-574)and human wild-t)，pe p53 protein．This protein should haVe higher ceII pe咖eabili妙锄dcells selectiVeIy localizes in the hypoxic regions of solid tumor to induce hypoxic tumorapoptosis．FirSt，the encoding genes of p53，1．AT．p53 and 1’AT-ODD-p53 we他constructed and cloned int0 pET28a prol(aryotic expression Vector，respectiVely．Second，these p53亿sion p mtcins we舱expressed in E∞，f，脱2J(D巨；)engineering bacteria．The highly pur砺ed proleins were prepared Via the procedu他of ext豫cti 伽，renaturation．The仃锄smembrane deliVe盯and ta_喀eting denaturation，purification andstabilit)，of 1=ff仆ODD-p53 were邪SesSed by auorescent immunocytochemjst∥舳d Westem blotting in y豇加．MTT as姐y，Annexin V&PI stajning combined with cytometl了狮alysis we陀used for eValuation of tlle c”otoxici妙of this msion protein；1"0DD—p53 induced cell-cycle aITest眦s analyzed using c”omet巧with PI staining．Tb inVestigate tlle mech锄ism of柚ti-tumor aff．ect of 1’AT-oDD-p53，a sct of p53 down蛐re姗genes expression was锄alyzed by WeStem bIotting in’，m1D．on the other h觚d，tumo卜bearing mode w弱established with Balb／c nude mice by subcutaneous injection of H l 299，human non-small Iung cancer cell line，t0 inVestigatcⅡle distribution and tumor suppression actiVity of‘1：AT-ODD-p53．The protein’saccumulation in turnor卸d nomal tissues was detemined aner me ip injection of p53 fhsion pmtein at the dosage of 5 mg／I(g．Tb嬲∞ss the tumor suppression actiVi哆of1IAT．oDD—p53，the proteins werc i．p．injec例to mice at the do鼢ge of 5 mg／l(酣ime for l 2days witll one day’s intemlission．Immunochemical staining w船used to觚alysis the existence of TALT-oDD·p53iII di彘rent tissues柚d itS如ti-tumor mechanism in’，^，D．8Our experimental 代suIts demonstrated that ：1．1Ar-ODD-p53如sion gene w 硒 constI ．ucted ，cloned into pET28a vector ，and successf ．uIly expressed ；2．The fhsion protein was purined via affinity chromatography ；3．1jaLl'-ODD-p53 couId be efl’cctiVely deliVercd into tumor cells and accumulated in the c”oplasm and nucleus ，the protein was more stable in hypoxia than that under no 唧oxia ，the half ．1ife time significantly proIonged ．4．MTT assay dispIayed that 1’AT．ODD·p53 had predominant gro 、vth inhibition on various tumor cell 1．nes under hypoxia ，but had not signifjcant function in the nomaI oxygen tension condition ．5．C”omet 叫analysis suggested that under hypoxia the apoptosis percentage of tumor cells inc 陀ased significantly when the cells were treated with TAT-ODD —p53 at the dose of 30熠／ml with the prolonged time and the cell cycle was blocked in the G 1 phase ．6．Westem blotting displayed that 1Ar-ODD —p53 could up —regulate the p2 l expression 锄d actiVate the caSpase-3 pathway t0 suppress the tumor cell growth in'，j 肋．7．1n 1，fVD ，TAT ．ODD-p53 could selectively∞cumulate in the hypoxic regions of soIid tumor of mice ，but not be dctected in the nomaltissue ，such 弱liver ．The co —localization assessment showed thatTAT ．ODD-p53 could scatter the a 陀a where HIF —l a w 船highly expressed ．8．The weight 觚d Volume oftumor in mice 仃eated with 1：AT-oDD-p53 werc lower th 柚those of other treatment groups ，锄d there werc no 锄y seVere side-efrects observed ；9．The immunochemical staining showed that the p53-associalcd gene expression w 嬲 up-regulated aRer trcatment with 1’AT -ODD —p53，and some proteins inVolVed in tumor locaregionaI spread ，distant me 协stasis 舳d angiogenesis werc down-他gulated in the’tumortissue ．In conclusion ，1孙ODD-p53 has good cell penneabilit)r and selectiVely ∽cumulated in the hypoxic regions of solid tumor ．It e 疏ctiVely cleans the hypoxic tumor ceIls 觚d suppresses the tumor gr0、矶h Via inducing tumor ceIIs unde 唱oing apoptosis Via up-regulatiOn of a set of p53 down·stre 锄genes expI ．ession ．Key 、Ⅳords：p53，solid tIImor ，hypoxia ，Tj 呱ODD9缩略词表英文缩写英文全称中文名称A absorbance 吸光度‘AD activation domain 激活结构域AljT alanine transaminase 谷丙转氨酶氨苄青霉素Amp ampicillinAnpt antennapedia homeoprotein 头胸足同源蛋白AST 舔partate锄inotransfbrase 谷草转氨酶bp baSe pair 碱基对BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白cDNA complementaW DNA 互补DNADAB 3，3’·diaminobenzidine二氨基联苯胺DAPI 4，6-diamidin0·2-phenylindole 二脒基苯基吲哚DBD central DNA-binding co他domain DNA中心结合结构域DMEM dulbecco modified eagIe medium dulbecco改进eagIe培养基DMSO dimethyl sulfoxide 二甲亚砜DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇ECL enhanced chem订uminescence 增强化学发光E Cb以Escherichia coli 大肠杆菌EDl’A ethylene di锄ine tctr锻cetic∞id乙二胺四乙酸EGF epide硼al gro、机h‰tor表皮生长因子EGFP enhanced green fIuoI．cscent pI．otein 增强型绿色荧光蛋白EGFR epidennal gro、矾h f．actor receptor 表皮生长因子受体FITC fIuorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素GSH reduced glutathione 还原型谷胱甘肽GSSG oxidized glutathione 氧化型谷胱甘肽HEPES hydr0Xyethyl piperazine eth锄esulf．0nic acid羟乙基哌嗪乙磺酸HIF Hypoxia-inducible factor 缺氧诱导因子HIv．1 human immunodeficiency virus-l 人类免疫缺陷病毒．1 HRE hypoxia responsiVe eIement 缺氧反应元件HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶腹腔注射ip intraperitonealIPTG isopropyl—卢二D-thiogaIactoside 异丙基．伊D-硫代半乳糖苷lLB Luria．Benani medium LB培养基MDM2 murine double minute gene 2 鼠双微基因2MTT methylthiazolyltc仃讹oIium 甲基噻唑基四唑NBT nitroblue tetrazolium 四唑氮蓝NLS nuclear locaIization signaling domain 核定位信号NP-40 Nonidet P40 乙基苯基聚乙二醇NSCLC non．small cell lung cancer 非小细胞肺癌OD holo．oligomerisati叩domain 同源寡聚化结构域ODD 0xygen—dependent degradation domain 氧依赖性降解区域PAGE polyac拶lamide gel eletrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS phosph a_te buffIened solution 磷酸盐缓冲液PCR polymera∞chain reaction 聚合酶链式反应聚乙二醇20000PEG20000polyethylene glycol 20000PI propidium iodide 碘化丙啶PMSF Phenyl-methyl sulfonyl nuoride 苯甲基氟磺酸PRD proline rich doma．n 富脯氨酸结构域P1D protein n铀sduction domain 蛋白转导区pVHL von Hippel-Lindau tumor suppressor protein pVHL肿瘤抑制蛋白RNA+ monucleic∞id核糖核酸rpm ．rcvolutions pcr minute 每分钟转速SDS sodium dodecvl suleltc 十二烷基磺酸钠siRNA smaU intemring RNA 小干扰I玳ATf叮饥嬲s-activator n铀scription 反义激活转录1’G锕glyceride 甘油三酯TP totel protein 总蛋白TltD t舢scription．activation domain 转录激活结构域THs tri啪ydroxymethyl)锄inometh锄e 三羟甲基氨基甲烷T砌TC tet珊ethyl rhod锄ine isothiocyanate 四乙基若丹明异硫氰酸盐UCH-L1 ubiquitin carboxyl-te舯inalhydrola∞一Ll 泛素羰基末端水解酶Ll UPS ubiquitin．pmte私ome system 泛素．蛋白酶体系统VEGF vaScul盯明dotheIial gr0叭h f；lctor 血管内皮生长因子VEGFR vascu衙endotheJial growtll factor I’cceptor 血管内皮生长因子受体VP22 viml protein 22 单纯疱疹病毒蛋白222、矶p53 wildtype p53 野生型p53--■_-■_●-刖罱．多年来，癌症一直是危害公众健康的重要主要疾病之一。