染色体免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀（chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种将DNA和相应的转录因子组装到染色质上的一项技术，可用于彻底研究基因表达调节机制。
1. 什么是染色质免疫共沉淀？染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种将DNA和相应的转录因子组装到染色质上的实验方法，用于研究染色质的结构和功能，进而理解基因的表达如何受调控。
它是一种特别有效的去解析染色质和基因表达调节之间的联系的方法，被用于通过生物信息学等方法，研究基因表达调节的蛋白质组织关系。
2. 染色质免疫共沉淀的原理染色质免疫共沉淀的技术根据抗体结合模式可以分为单克隆抗体和聚合物抗体两种，单克隆抗体结合定向抗原，可以较好地用于基因组定点分析，它通过固定DNA模板和抗原抗体相互作用将它们结合到一起，再行沉淀，从而获取DNA模板及其相互作用位点。
聚合物抗体可以扩大辨识特异性，能够克服单克隆抗体的特异性限制，可应用于普适性抗原，可以用于核组学分析，利用共沉淀的方法结合PCR的扩增效应，将小量的DNA模板复制成更多的DNA碱基，以能够清晰地获得与染色质有关的重要信息。
3. 染色质免疫共沉淀的步骤染色质免疫共沉淀的步骤主要有：细胞培养分离、肽激活细胞和抗体免疫沉淀、PCR扩增、核酸电泳分析、数据分析。
首先，要进行细胞培养，用适当的分离方法分离出细胞，接着，激活肽将细胞激活，以提高活细胞中的蛋白质和DNA的表达、组装以及相互作用；然后，添加抗体，抗体结合模板和相应的转录因子，这样可以将抗体和DNA-转录因子复合物结合在一起，继而进行沉淀；接着，将沉淀物进行PCR 扩增，从而将少量的模板复制成多份；接着，使用DNA电泳分析来检测分析结果；最后，利用生物信息学对实验测得的数据进行分析，探索调节染色质和基因表达的蛋白质组织关系及其机制。
以上就是染色质免疫共沉淀的实验步骤。
4. 染色质免疫共沉淀的应用染色质免疫共沉淀在生物学研究方面具有重要的应用价值，在基因组学、核组学、基因表达分析、生物信息学、代谢组学、表观遗传学等方面有着广泛的应用，可用于研究染色质结构，探索基因组变异，鉴定并且定位生物体内转录因子等，是一项重要的新技术。
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）是一种用于研究基因组中蛋白质与DNA相互作用的高通量测序技术。
该技术可以帮助我们了解基因表达、转录调控、染色质结构和功能等方面的信息。
在ChIP-seq技术中，首先需要将某种特定的蛋白质与DNA结合，然后使用抗体将这种蛋白质与DNA复合物捕获下来。
接着，将复合物中的DNA分离出来，并进行高通量测序。
最后，通过对测序结果的分析，可以确定蛋白质与DNA结合的位置和数量，从而了解染色质结构和功能的相关信息。
ChIP-seq技术的应用非常广泛。
例如，可以用于研究转录因子与DNA结合的位置和数量，从而了解基因的转录调控机制。
此外，还可以用于研究组蛋白修饰与基因表达的关系，以及研究染色质结构和功能的变化与疾病的关系等。
虽然ChIP-seq技术具有很多优点，但也存在一些局限性。
例如，该技术需要使用抗体来捕获蛋白质与DNA复合物，因此需要选择合适的抗体，并且可能存在抗体特异性和交叉反应的问题。
此外，该技术也存在一定的误差和假阳性率，需要进行严格的数据分析和验证。
总的来说，ChIP-seq技术是一种非常有用的高通量测序技术，可以帮助我们了解基因组中蛋白质与DNA相互作用的信息，从而深入研
究基因表达、转录调控、染色质结构和功能等方面的问题。
随着技术的不断发展和完善，相信ChIP-seq技术将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
1染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）是一种使用测序技术来研究染色质蛋白结合DNA及与基因表达的调控的新兴基因组学技术。
它是染色质免疫沉淀（ChIP）技术与高通量测序技术的结合。
通过染色质免疫共沉淀测序技术，可以确定细胞中的基因组上的结合位点，研究特定的蛋白质和DNA，及基因转录的调控机制，以及参与蛋白质-DNA结合的相关机制。
染色质免疫共沉淀测序是将蛋白质-DNA复合物通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术进行收集，然后根据分子标记的位点将其测序，并且将其无功的部分暴露出来进行测序分析。
依靠ChIP-seq，可以以一种高效的方式查看某种特定蛋白质在基因组上结合的位置，并且可以分析复杂结构DNA区域位点间结合关系，也可以确定转录因子调控基因表达的路径。
染色质免疫共沉淀技术在进行基因组组学研究、基因组区域结构分析、功能元件检测、基因调控研究及转录组分析中发挥着重要作用。
传统的ChIP技术是所有细胞中的结合位点的相对分析，它们的数据可以用于描述和验证转录调控的路径，但是不能给出定性的结论，而ChIP-Seq则能够获得定性的位置并进行深入的分析。
染色质免疫共沉淀测序技术在研究复杂基因调控网络中发挥了重要作用，它可以更有效地捕捉基因表达状态，帮助研究者对研究对象
的基因表达调控进行深入的研究，使科研数据更为准确可靠，揭示出机体细胞调控的生物学机制。
免疫共沉淀和免疫沉淀
免疫共沉淀和免疫沉淀
“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白，进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。
将蛋白通过微珠（纯化介质）进行富集。
免疫沉淀根据检测的目的可以分为免疫沉淀、免疫共沉淀(Co-IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)和RNA免疫沉淀(RIP)。
免疫共沉淀分析(Co-IP)是免疫沉淀的延伸，基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体；但IP的目标是纯化单一抗原，而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。
如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白,也会被一同捕获及纯化得到,通过SDS-PAGE、Western 和质谱等方法鉴定与靶蛋白结合的蛋白。
染色质免疫沉淀(ChIP)用于鉴定基因组中与靶蛋白(如转录
因子和组蛋白)结合的区域。
将蛋白质与DNA暂时交联固定并剪切DNA,目标蛋白与核酸序列一起被沉淀后通过高通量测序、Southern和PCR等方法进行DNA鉴定。
确定与靶蛋白结合的DNA 片段。
RNA免疫沉淀(RIP)原理与ChIP相似,与靶蛋白结合的RNA被沉淀后,用高通量测序、RT-PCR或Northern等方法对沉淀进行RNA 鉴定。
随着技术的发展,目前磁性微粒已经取代琼脂糖成为免疫沉
淀的首选方法,由于磁性微粒明显小于琼脂糖,因此可以与更多的抗体结合,纯化是可以使用磁力架进行,避免了离心分离可能导致的抗原-抗体结合的破坏,避免了检测目的的损失。
上述各种免疫沉淀的异同总结如下:。
染色质免疫共沉淀实验步骤
染色质免疫共沉淀实验步骤英文回答：Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely used experimental technique that allows researchers to investigate the interactions between proteins and DNA in the context of chromatin. It is commonly used to study protein-DNA interactions, such as transcription factor binding, histone modifications, and chromatin remodeling.The ChIP experiment involves several key steps:1. Cross-linking: The first step is to cross-link the proteins to the DNA in living cells or tissues to preserve their interactions. This is typically done by treating the cells with a cross-linking agent such as formaldehyde. The cross-linking reaction is stopped by adding glycine, which quenches the formaldehyde.2. Cell lysis and chromatin fragmentation: The cross-linked cells are then lysed to release the chromatin. The chromatin is fragmented into smaller pieces by sonicationor enzymatic digestion. The goal is to obtain chromatin fragments of a suitable size range for subsequent immunoprecipitation.3. Immunoprecipitation: The fragmented chromatin is incubated with antibodies specific to the protein of interest. These antibodies recognize and bind to theprotein-DNA complexes. The protein-DNA complexes are then pulled down using protein A/G beads or magnetic beads coupled with antibodies. This step allows for the selective enrichment of the protein-DNA complexes of interest.4. Washing and elution: The pulled-down complexes are washed to remove any non-specifically bound proteins or DNA. The protein-DNA complexes are then eluted from the beads, usually by heat or enzymatic digestion, to release the DNA fragments.5. Reversal of cross-links: The cross-links between proteins and DNA are reversed by incubating the elutedprotein-DNA complexes at high temperature. This step dissociates the proteins from the DNA and allows for the recovery of the DNA fragments.6. DNA purification and analysis: The recovered DNA fragments are purified and can be further analyzed by various techniques, such as PCR, qPCR, microarrays, ornext-generation sequencing. These analyses can provide information about the protein-DNA interactions and the genomic regions bound by the protein of interest.ChIP experiments require careful optimization of various parameters, such as cross-linking conditions, chromatin fragmentation, antibody specificity, and washing conditions, to ensure the accuracy and reliability of the results. It is also important to include appropriate controls, such as negative controls (no antibody or non-specific antibody) and positive controls (known protein-DNA interactions), to validate the experimental conditions and results.中文回答：染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种广泛应用的实验技术，可以帮助研究人员在染色质的背景下探究蛋白质与DNA之间的相互作用。
ChIP实验精讲(做科研的必看)
ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。
交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。
加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。
该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。
一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。
在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。
随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。
2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。
4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。
2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。
3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。
4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。
然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。
2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。
3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，也是
研究细胞基因组结构和功能的重要方法。
该技术可以用来鉴定某个转录因
子或其他核蛋白与某个特定DNA序列的结合关系，从而确定这个DNA序列
在基因表达调控中的重要性。
该技术包括以下步骤：（1）交联；（2）裂解；（3）免疫沉淀；（4）洗涤；（5）离解交联；（6）DNA提取。
在这个过程中，首先将细胞进行交联，使得染色质固定在原位。
之后，将染色质进行裂解并进行免疫沉淀，这里是将特定的抗体与目标蛋白质结合，从而使得目标蛋白质与某些DNA序列结合，并保持在染色质中。
然后
对免疫沉淀后的复合物进行洗涤，去除杂质物质，以提高免疫沉淀的特异
性和纯度。
之后，对免疫沉淀后的复合物进行离解交联，使免疫沉淀的蛋
白质与DNA分别被分解为单独的分子。
最后，从免疫沉淀复合物中提取DNA，用于进一步的分析，例如PCR扩增、Southern blotting、测序等。
该技术的优点是可以在整个基因组范围内寻找目标DNA序列的结合蛋白，相对快速、成本低、灵敏度高，并且可以直接从原位染色质富集DNA
序列。
缺点是免疫沉淀的特异性和纯度可能受到影响，需要对实验进行严
谨控制。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。
这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。
ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
实验步骤：第一步：用甲醛把细胞内的DNA结合蛋白与DNA交联起来
具体步骤与注意事项
1. 准备好一盘细胞量达到1 x 106的培养皿（注意：培养细胞时要适当处理细胞使得目的基因处于被转录的状态）
2. 于培养基中加入适量的甲醛，使甲醛终浓度达到1%，37℃下交联10分钟。
（注意：交联的时间太短或太长都会影响最终的结果）
3. 尽量的去掉培养基，然后用加了蛋白酶抑制剂的预冷PBS清洗细胞两次；
4. 把细胞刮下，置于离心管中，4°C 2000 rpm 离心4分钟；
5. 去掉上清液，加入200微升裂解液（注意：每1 x 106个细胞加200微升裂解液），冰上裂解10分钟；
第二步：用超声波的方法把DNA破碎成合适的大小（250bp至800bp），因为在第一步中用甲醛交联了细胞内的大分子，所以结合蛋白质的DNA片段相对没那么容易被打断。
具体步骤与注意事项
6. 用超声波破碎细胞裂解液中的DNA至DNA的长度为250bp至800bp（注意：整个操作过程必须在冰上进行，破碎中途不断的跑胶检测DNA分子长度是否达到250bp至800bp）
第三步：用特异性抗体与DAN结合蛋白结合，用免疫沉淀的方法法分离出复合体。
纯化出复合体中的小片段DNA
具体步骤与注意事项
7. 把破碎好的细胞裂解液置于冰冻离心机中4°C 13000 rpm 离心10分钟，再把上清转移到2ml的离心管中；
8. 用CHIP稀释液把细胞裂解液稀释10倍，并将此液称为原液（注意：稀释后取出200微升原液作为Input样品）；
9. 为了更好的去掉结果背景，往原液中加入75微升的蛋白A/G琼脂糖珠，4°C孵育30分钟，再稍微离心一下，收集上清液（以下称为A液）；
10. 把A液分为两份，一份加入结合目的基因的蛋白的抗体，一份加入Fl ag标签抗体，4°C孵育过夜；
11. 分别加入40微升的蛋白A/G琼脂糖，4°C摇晃孵育1小时；（注意：孵育的时间不能太长，而且摇晃的速度要快）
12. 700 至1000 r pm 4°C冰冻离心1分钟，去掉上清，反复清洗琼脂糖珠四次（注意：务必把上清液彻底的去掉，否则残留的上清液会造成假阳性）；第四步：用PCR扩增特异DNA序列，以确定目的基因是否与抗原蛋白结合并最终被沉淀下来。
具体步骤与注意事项
13. 即时制备El ution Buffer (1%SDS, 0.1M NaHCO3)；
14. 往琼脂糖珠里加入120微升的Elution Buffer，室温下剧烈摇晃15分钟，2000g离心1分钟取上清液（以下称为B液）；
15. 用PCR纯化试剂盒纯化B液，
16. 纯化过的B液可以进行PCR分析（注意：检测时要带上之前取出的部分原液作为Input对照）；
注意：12步以后的结果可以加入25微升3 x上样缓冲液，沸水变性5分钟，离心取上清做Western Bl ot检测。
染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。
这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。
ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
近年来，这种技术得到不断的发展和完善。
采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。