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【精品课件教案ppt】实验八 sds-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质24页文档

【精品课件教案ppt】实验八 sds-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
16、自己选择的路、跪着也要把它走完。 17、一般情况下)不想三年以后的事，只想现在的事。现在有成就，以后才能更辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须充满光明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的人只能引为烧身，只有真正勇敢的人才能所向披靡。
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
ห้องสมุดไป่ตู้
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量-21页PPT精品文档

剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度 2.溶液的pH值 3.溶液的离子强度 4.电渗现象 5.温度的影响 6.支持物的影响
四、结果分析
蛋白样品距加样端迁移距离（ c m ）相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离（ c m ）
蛋白质变性
0.1-1% SDS 0.1 M 2-巯基乙醇蛋白质变与SDS分子按比例结合 1 ：1.4
SDS
聚丙烯酰胺凝胶性质
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。
聚丙烯酰胺凝胶性质
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。
2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4℃冰箱贮存不超过48小时。
3.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。
4.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1—2cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。
上样及电泳
浓缩胶 pH 8.6
开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件

精选ppt
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5 .电泳
将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105 105-2×106
核酸(RNA)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
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当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
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图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称
PAGE)。
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聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；

垂直板电泳分离蛋白质--教学PPT课件

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（5）利用特异性的颜色反应使蛋白质着色，这样就可在凝胶中展现出蛋白质条带。
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授课：XXX
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2、仪器设备及试剂
• （1）仪器设备： • 恒流恒压电泳仪及配套电泳槽 • 冷冻离心机及离心管 • 制冰机 • pH计 • 真空机 • 取样器 • 进样器
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授课：XXX
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授课：XXX
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• 固定液
– 甲醇200ml，乙酸50ml，加水定容到ห้องสมุดไป่ตู้00ml.
• 考马斯亮蓝染色液
– 42ml水，58ml磷酸加50g硫酸胺溶解后再加0.6g G250溶解，加水定容到400ml，再加入100ml甲醇
• AP%
– 100mg过硫酸胺溶于1ml水
• 上样缓冲液
– 1g SDS，5ml Glycerol,0.5mg Bromophenol blue,2.5ml 巯基乙醇,10ml 浓缩胶 buffer,dd H2O to 50ml.
• 分离胶buffer(1.5M Tris-HCl buffer， pH 8.8 )
– 18.17g Tris,0.4g SDS,加双蒸水80ml溶解，用HCl 调pH为8.8后定容到100ml，过滤后贮存
• Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3)
– 30g Tris,10g SDS, 144g甘氨酸，加双蒸水800ml 溶解后定容到1000ml
• 0.1%溴酚蓝水溶液
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授课：XXX
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3.SDS-PAGE实验步骤
分离胶的制备浓缩胶的制备
待分离样品的制备
加样
电泳剥胶
2021/3/9

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• 2 配胶
试剂名称表 SDS–不连续体系凝胶的制备配制20 mL不同浓度的分离胶配制10 mL浓缩所需试剂用量/mL 所需试剂用量/mL 7.5% 10% 15% 3% 5.00 6.66 10.0 1.00 2.50 — 0.10 0.20 12.10 2.50 — 0.10 0.20 10.44 2.50 — 0.10 0.20 7.10 — 1.25 0.05 0.10 7.55
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
五、操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两
大类。目前常用的多为圆盘电泳 (如图1)和板状电泳 (如图2)，两者电泳原理完全相同。
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
（c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应
图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-
实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
二、原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 (acrylamide ，简称 Acr) 和交联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 (N ， N— methylene-bisacylamide ，简称 Bis) 在加速剂 N ， N ， N ， N— 四甲基乙二胺 (N ， N ， N ， N— tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称 AP) 或核黄素 (ribofavin 即 vita min B2 ， C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis ，简称 PAGE)。
三、试剂与器材试剂：10%SDS、凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－ HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、 0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床
图2 夹心垂直板电泳槽示意图图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框
4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
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不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) 当进入 pH8.9 的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105 核酸(RNA) 104 104–105 105-2×106 15–20 5-10 2-2.6 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
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PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate, 简称 SDS) ，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量。