病毒纯化
病毒的分离纯化
病毒的分离纯化
我设计了一套方案，请大家批评指正：
1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。
组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。
2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟
3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。
冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。
4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。
5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。
冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。
6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH
7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。
7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。
8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。
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病毒的超速离心纯化
病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。
实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。
蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。
30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。
1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。
具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。
向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。
此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。
24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。
2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。
3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。
离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。
病毒颗粒的分离与纯化技术研究
病毒颗粒的分离与纯化技术研究自从人类意识到病毒的存在以来，对于病毒颗粒的分离与纯化技术的研究就在不断进行中。
作为生物学领域的重要组成部分，对于研究病毒病的发病机制、疫苗的研制以及医学诊断等方面都有着重要的作用。
本文将对病毒颗粒的分离与纯化技术进行介绍和探讨。
一、病毒的基本结构在病毒颗粒的分离与纯化技术研究中，了解病毒的基本结构是至关重要的。
病毒在基本结构上分为两部分：外壳和内核。
外壳，也称包膜，是由糖蛋白复合物组成的。
不同种类的病毒外壳的成分不同，有的是单层膜，有的是双层膜。
外壳的主要作用是保护病毒和在寄主细胞中实现侵染。
内核由核酸和蛋白质组成，核酸在内核中是紧密包裹在蛋白质中的。
不同种类的病毒核酸的形态、数量和长度各不相同。
二、病毒颗粒的分离技术1、细胞培养病毒实验分离的过程中，需要一种可供病毒复制和扩增的细胞系。
现如今，在市场上已有多种适用于病毒分离和传代的细胞系，例如Hela、MDCK、Vero等。
2、离心法离心法是最常用的病毒颗粒分离技术之一。
离心法依靠对分子量大于小于病毒的物质的密度分离。
病毒和病毒感染的细胞机体通过高速离心后，会分成不同的层次，其中含有病毒的层可以被收集用于之后的纯化工作。
3、凝胶层析凝胶层析是基于分子大小的原理进行病毒分离的技术。
在凝胶层析过程中，样品通过固相填料（玻璃珠、琼脂等），分子大小不同的病毒会被填料区分开来，从而实现病毒分离。
三、病毒颗粒的纯化技术在经过分离之后，病毒的颗粒虽然已经被获得，但是其中仍然存在着大量的杂质，这时就需要使用纯化技术进行进一步的强化和精确纯化。
1、超速离心超速离心是分离和纯化大分子生物学分子的基础技术之一。
病毒分离后，使用超速离心能够有效地将病毒颗粒、残余细胞碎片等异种蛋白分离，从而获得高纯度的病毒制品。
2、薄层电泳薄层电泳是实现病毒纯化和分析的重要技术手段。
其原理是依靠对病毒颗粒电荷和分子量的区别进行分离。
具体操作是将样品加在电泳板上，使之随着电场移动。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
病毒的浓缩和纯化
病毒的浓缩和纯化
收集发病鹅的脾脏、肝脏和肾脏，均浆用1:5稀释(Wt/vol)buffer A (10 Mm Tris-HCl ,100mM EDTA PH=7.2)离心10000 转，30分钟。
再加上双抗（10000LU/ML）青霉素和链霉素(1mg/ml)。
病毒浓缩的方法用的是蔗糖梯度离心方法。
首先，10000转离心30分钟，收集上清液，用三氯三氟代乙烷纯化两次为了除去脂层。
蔗糖溶液用在下一步的操作中，提前准备buffer A。
上清放于30％的蔗糖的溶液中超速离心。
上清重新用buffer A悬浮，放于25％－60％的不间断的蔗糖溶液中，超速离心120000转，16小时。
离心完后，收集密度差别的液体。
测定病毒的浮力的密度。
最后，分离的液体带再用1：3 buffer A稀释，离心2小时，120000转。
病毒小颗粒用悬200微升水。
病毒纯化密度梯度离心法
病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。
病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。
物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。
病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。
免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。
结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒纯化方法:1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。
但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。
2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。
Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。
密度梯度离心法英文名称： density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
病毒空斑纯化步骤
猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案(1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。
(2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。
(3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。
(4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。
(5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
(6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。
(7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。
(8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。
(9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
主要问题：1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。
48h之后有些孔的细胞基本上看不清了，但是这都不是病毒造成的。
（支原体的存在会不会导致这种情况）2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层琼脂糖层？3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。
看不出明显的染色区域，只是有些红色的点点。
5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。
就是不知道自己配制的液会不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。
6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。
7、8、（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）9、。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。
(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。
(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。
(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。
(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。
(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
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现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
在后者中，病毒在离心试管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，离心须要高速，即120000g,且要进行好几个小时，最好是一整夜。
离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来，要检测每一滴的病毒滴度。
在合适的离心条件下，所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中，所以它们是非常纯的。
结晶脊髓灰质炎病毒。
如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。
这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。
本章的部分讲到的脊髓灰质炎病毒的计算机拟合就是从这种高浓度脊髓灰质炎的病毒晶体获得的。