病毒的超速离心纯化
病毒的结构
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病毒纯化的原理
病毒纯化的原理主要基于病毒本身的两个性质： 1. 绝大多数的病毒的外壳都是由蛋白质构成的， 因此病毒体就具有普通蛋白质的性质。 2. 病毒具有一定大小、形态和密度。
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差速离心
• 大小和质量有差别 • 低速和高速的交替循环离心 • 不同的病毒，所选择的低速和高速离心 速率有所不同
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表3-1 部分病毒的基本组成
病 腺病毒2型和4型 苜蓿花叶病毒 禽类成髓细胞白血病病毒 蚕豆斑驳病毒 蚕豆真花叶病毒 雀麦花叶病毒 大肠杆菌噬菌体f1，fd，M13 大肠杆菌噬菌体T2，T4，T6 大肠杆菌噬菌体f2，fr，M12，MS2， R17，Q 脊髓灰白质炎病毒 小鼠K病毒 30 26 19 2 22 35 21 79 12 55 88 40 70 74 93 返回 5 毒 RNA ％ DNA ％ 13 蛋白质 ％ 87 81 62 78 65 35 1 脂质 ％ 非核酸糖 ％
以RNA携带全部遗传信息
• 病毒RNA是生物界中以RNA携带全部遗 传信息的唯一独特现象。 • 在生命本质和生命起源的研究中具有很 重要的参考意义。
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分段基因组
• 在RNA病毒中，有一部分病毒的基因组 不是一分子，而是由数个不同的核酸片 段构成，各段核酸均具有一定的功能。
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环状RNA
• 绝大部分病毒基因组RNA都是线状分子。 • σ肝炎病毒：ssRNA的高度碱基配对区 与单链环相间的共价闭合环状分子 • 布尼亚病毒和沙粒病毒：倒转末端重复 序列存在，可形成链柄状的环状分子。
病毒的核酸含量
• 病毒核酸的含量是因病毒种类的不同而不同
– – – – 流感病毒所含有的核酸仅占整个病毒粒子质量的1% 新城鸡瘟病毒的核酸含量也只占整个病毒颗粒质量的1% T偶数噬菌体的核酸含量则占整个病毒粒子质量的50%以上 类病毒则因整个病毒粒子无蛋白质，核酸占100%
病毒超速离心(8.7--8.9)
一．实验名称：纯化CMV病毒
二．实验目的：将病毒从培养液中超离出来
三．实验步骤
1.将病毒从-80度冰柜中取出于30度水浴锅中化冻，在病毒操作台中用微量加
样枪取270微升小牛血清放入28号超速离心管，.用移液管量取27毫升的病
毒放入28号超速离心管，用注射器吸取5毫升隔离液并轻轻注入离心管底部，
使之出现明显分层。
将各离心管配平。
2.超速离心机的使用：首先将各离心瓶正确安装并仔细检查，放入—设置转速
1,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0万转/min---温度20℃---时间一个半小时---抽气，<20后开
始离心
3.离心结束，观察离心管底部有部分沉淀物，倒掉上清液，加入500微升保护
液冲洗下沉淀物后吸取并保存于小管中，在吸取500微升保护液同上操作。
将病毒标记CMV 转速操作时间后再放回-80℃冷柜保存
四．实验结果：成功分离病毒
五．结果分析与注意事项：乳白色CMV病毒少许沉淀在管底
1病毒操作戴手套2不要点酒精度3针尖替换要规范4配平要谨慎，很重要
5操作后实验垃圾要灭菌
六．计划：规范，谨慎的前提下多动手，熟悉基本操作。
病毒颗粒的分离与纯化技术研究
病毒颗粒的分离与纯化技术研究自从人类意识到病毒的存在以来，对于病毒颗粒的分离与纯化技术的研究就在不断进行中。
作为生物学领域的重要组成部分，对于研究病毒病的发病机制、疫苗的研制以及医学诊断等方面都有着重要的作用。
本文将对病毒颗粒的分离与纯化技术进行介绍和探讨。
一、病毒的基本结构在病毒颗粒的分离与纯化技术研究中，了解病毒的基本结构是至关重要的。
病毒在基本结构上分为两部分：外壳和内核。
外壳，也称包膜，是由糖蛋白复合物组成的。
不同种类的病毒外壳的成分不同，有的是单层膜，有的是双层膜。
外壳的主要作用是保护病毒和在寄主细胞中实现侵染。
内核由核酸和蛋白质组成，核酸在内核中是紧密包裹在蛋白质中的。
不同种类的病毒核酸的形态、数量和长度各不相同。
二、病毒颗粒的分离技术1、细胞培养病毒实验分离的过程中，需要一种可供病毒复制和扩增的细胞系。
现如今，在市场上已有多种适用于病毒分离和传代的细胞系，例如Hela、MDCK、Vero等。
2、离心法离心法是最常用的病毒颗粒分离技术之一。
离心法依靠对分子量大于小于病毒的物质的密度分离。
病毒和病毒感染的细胞机体通过高速离心后，会分成不同的层次，其中含有病毒的层可以被收集用于之后的纯化工作。
3、凝胶层析凝胶层析是基于分子大小的原理进行病毒分离的技术。
在凝胶层析过程中，样品通过固相填料（玻璃珠、琼脂等），分子大小不同的病毒会被填料区分开来，从而实现病毒分离。
三、病毒颗粒的纯化技术在经过分离之后，病毒的颗粒虽然已经被获得，但是其中仍然存在着大量的杂质，这时就需要使用纯化技术进行进一步的强化和精确纯化。
1、超速离心超速离心是分离和纯化大分子生物学分子的基础技术之一。
病毒分离后，使用超速离心能够有效地将病毒颗粒、残余细胞碎片等异种蛋白分离，从而获得高纯度的病毒制品。
2、薄层电泳薄层电泳是实现病毒纯化和分析的重要技术手段。
其原理是依靠对病毒颗粒电荷和分子量的区别进行分离。
具体操作是将样品加在电泳板上，使之随着电场移动。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
流感病毒的收集与纯化标准操作规
流感病毒的收集与纯化标准操作规程（编号：054）1、目的及适用范围该SOP用来规范流感病毒的收集和纯化标准操作。
2、主要仪器试剂超净工作台、冷冻立式超速离心机（BeckmanXL90）、冷冻台式高速离心机、天平、超速离心管、50mL离心管、0.01 mol/L PBS pH7.4、30%、40%、50%、60%蔗糖3、操作步骤3.1将病毒接种于SPF鸡胚，48 h收集尿囊液以5000 rpm（#3334）离心30 min，取上清液；或者将病毒接种于细胞，待细胞基本病变收取上清。
12000rpm（#3332），离心15min，去上清。
3.2 将上清液以100000g（Ti40）离心2 h，将沉淀物用1 mL 0.01 mol/L PBS pH7.4悬浮，振荡均匀；3.3 加至依次由30%、40%、50%、60%蔗糖制成的密度梯度上，以100000g（SW40）离心2h，取沉淀条带；3.4 取沉淀条带加10倍量PBS悬浮、振匀，再次以100000g （Ti80）离心2 h，取沉淀用200μL 0.01 mol/L PBS pH7.4或20 mM Hepes/20mM Mes/130mM NaCl, pH7.5悬浮、振匀，-80℃保存。
4、注意事项4.1 注意对称平衡。
使用天平，进行配平，保证离心对称平衡。
4.2 如离心管盖子密封性差液体就不能加满（针对高速离心且使用角度头），以防外溢。
外溢后果污染转头和离心腔，并失去平衡，影响感应器正常工作。
最高液面查离心机相应说明书。
4.3 SW40超速离心时，液体一定要加满离心管，只余留2mm空间，超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。
4.4 使用角度头时别忘盖转头盖，如未盖，离心腔内会产生很大的涡流阻力和摩擦升温，这等于给离心机的电机和制冷机增加了额外负担，影响离心机的使用寿命。
113。
TGEV细胞培养物超速离心与RT—PCR扩增的研究
（ 海 农 科 院 畜 牧 兽 医 研 究所 ， 海 ２ １ ０ ） 上 上 ０ １６
摘
要 ： 究猪传 染性 胃肠 炎病毒 （ 研 ＴＧＥ 细胞培 养物 的超速 离心及 鉴 定 方 法。将 ＴＧＥ 的 细胞培 养 Ｖ） Ｖ
关键 词 ： 猪传 染性 胃肠 炎病 毒 ； 蔗糖 密度梯度 离心； Ｔ Ｐ Ｒ Ｒ —Ｃ
中 图分 类 号 ：８ ２ ６ ９ ６￥ ５ ．８ ￥ ５ ．５ 、 ；８ ８ ２ 文 献 标识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ７５ ３ （０ ７０ ・０ ００ １ ０—０ ８ ２０ ）４０ ５・３
结 构 中有一 圈 日冕 状的 突起 （ｐｋ ） ｓ ｉｅ 而得名［３， ｚ 而在 － ］ Ｃ 公 司产 品 。 ０
研 究过程 中许 多 学 者 都 发 现 突起 容 易 从 病 毒 上 脱 １ ３ 病毒 培 养及处 理 ．
落［ ， ４ 因此经过 理 化 因素 处 理 后 得 到 冠 状 病毒 很 难 ］
１ １ 病毒 来源 ．
猪传染性 胃肠炎 病毒 由本 实验室 分离保 存 。
有 典型的 电镜 冠状结 构 。
病毒 复苏后 接 种 ４ ８ｈ长 满 单 层 的猪 睾 丸 细胞
（ Ｔ） 病变达 ７ 时 收 获 病 毒 ， Ｏ℃冻 融 ３次 ， Ｓ ， ５ 一２
超速离心 方法是 在病毒 纯化 过 程 中应用 最广 泛 ８０ ０ｒｍｉ离 心 ３ ｎ去 除 细 胞 碎 片 ， 通 过 ０ ／ ｎ ０ ｍｉ 并 的一 种方 法［ ］ ５ 。通 过 超 速 离 心 获得 纯 化 病 毒 后 可 ０ ２ ｍ无 菌滤 器过 滤 。然 后 将 滤 液用 饱和 硫 酸氨 ． ２批 为进 一步分析研 究奠 定基 础 。病 毒 进行 超速 离 心 的 法 浓缩至 １ １ ０体积 ， ／０ 以备 蔗糖 梯度 离心 。
新冠疫苗的灭活工艺
新冠疫苗的灭活工艺新冠疫苗的灭活工艺是一种制备疫苗的方法，通过将新冠病毒进行灭活处理，使其失去活性但仍能激发免疫系统产生抗体，达到预防感染的目的。
一般来说，制备新冠疫苗的灭活工艺主要分为以下几个步骤：1. 病毒培养：首先需要选取适宜的细胞系作为病毒培养基质，毕竟病毒需要寄生在细胞内才能生存和繁殖。
目前制备新冠疫苗的灭活工艺主要采用的是Vero 细胞系（绿猴肾细胞）或其他哺乳动物细胞系。
2. 病毒分离：从感染新冠病毒的患者样本中，如痰液、咽拭子等，分离出并纯化出新冠病毒。
病毒的纯化过程主要通过超速离心、滤过、浓缩等技术实现。
3. 病毒灭活：在病毒分离和纯化完毕后，需要使用灭活剂将病毒失去活性。
常用的灭活剂包括β-普鲁阿拉宁（β-propiolactone）和二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。
这些灭活剂能够与病毒的核酸或蛋白质结合，破坏其功能和结构。
4. 病毒检验：经过灭活处理后的病毒需要进行检验，确保病毒已经完全失去活性。
常用的检验方法包括免疫荧光法、电子显微镜观察等，以确保病毒完全灭活，不再具有传染性。
5. 制备疫苗：灭活的新冠病毒经过检验合格后，可以进一步进行制备疫苗。
研究人员将灭活的病毒进行分装、稀释等操作，制备出疫苗剂型，如注射液、冻干粉等。
6. 免疫接种：制备好的新冠疫苗剂型可以用于临床免疫接种。
接种后，疫苗中的灭活病毒能够刺激人体免疫系统产生特异性的抗体，并形成免疫记忆，为日后遇到真实的新冠病毒感染提供保护。
总体来说，灭活工艺是一种传统而成熟的制备疫苗的方法。
然而，灭活疫苗的制备工艺相对较复杂，需要掌握病毒培养和灭活技术，确保病毒彻底失去活性，同时也需要进行严格的质量控制和病毒检验。
此外，灭活疫苗可能存在较高的副作用风险，比如接种后可能出现发热、局部不适等不良反应。
因此，在灭活疫苗的制备和使用过程中，要做好充分的安全性评估和监测工作，以确保疫苗的有效性和安全性。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
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病毒的超速离心纯化
实验目的
超速离心法纯化A型禽流感病毒。
实验原理
不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各
自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
此法
的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范
围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离
有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
实验设备和材料
专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）
操作步骤
蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。
蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。
30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。
1. 病毒的增殖
使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。
具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。
向各尿囊腔中接种0.2
mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。
此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。
24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。
2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。
3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。
离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。
4. 超离完成后倒掉上清，测上清HA查看病毒是否沉淀完全，并用长注射器抽干上清后，用已高压的PBS洗脱，一般洗脱1 mL左右（根据用量及后面上蔗糖密度梯度离心而定），将重悬的病毒放于一新的EP管中。
5. 梯度离心的蔗糖现配现用，蔗糖浓度分别为30%、40%、50%，用长注射器把不同浓度的蔗糖加入，先加低浓度的，再加高浓度的，加时将针头放于管底缓慢加入。
把已经超离浓缩好的病毒液加入已配制好的蔗糖上面，以40000 r/min、4℃下离心4 h。
6. 去蔗糖：对光找到病毒粒子所在层面（新城疫病毒在40%和50%之间），小心吸走该层面液体于专用超离离心管中，加入PBS填满超离管，以40000 r/min、4℃下离心4 h去蔗糖。
7. 到点上清，吸干后，加入1-2 mL PBS 重悬病毒粒子沉淀，吸出放于新的EP管中，测定HA，并保存在-80℃冰箱中。