四类微生物的分离、培养及鉴定
四类微生物的分离、培养及鉴定
环境与生物工程学院环科0701班
摘要：本实验介绍了细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法，并阐述了其分离和培养过程。观察和比较分离出来的细菌以及放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，通过染色法对各类细菌进行鉴定。将从土壤中分离出的几种不同微生物，分别接种于不同培养基上，于35 ℃培养24 h、48 h后，观察记录其生长情况。该研究对混合感染时不同培养基的组合与使用，病原微生物的准确分离与鉴定，以及临床细菌日常检验工作均有一定的指导意义。
关键词：微生物，菌落，分离，培养，鉴定
Abstract：This experiment is introduced, mould, bacteria, actinomyces commonly preparation methods of medium yeast, and expounds its separation and training process.Observe and compare the isolated bacteria and actinomyces, yeast and mould colony feature, dyeing method for all kinds of bacteria by identification.Isolated from the soil microorganisms, several different respectively in different media, vaccinations in 35 ° c h, 48 h training and observed after its growth record.The study of mixed infection with the combination of different media, pathogenic microorganisms accurate and separating, and clinical bacteria daily inspection work has certain directive significance.
Keywords:Microbes, Bacteria, Isolation, Culture, Identification
引言
为了深入了解常用选择性培养基对不同微生物的抑制或筛选能力，为了充分利用各培养基的特殊作用，从而给院内感染监测及临床微生物检验工作者选择利用各培养基及其组合时提供有益参考，我们把从土壤中分离出的几种微生物分别接种于常用培养基上，对比研究了它们的不同生长特点。
1仪器与试剂
1.1仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH 试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸，革兰氏染色液，载玻片，显微镜、盖玻片、吸水纸，接种针。
1.2试剂：牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4?7H2O、NaOH溶液（1mol/L），革兰氏染色液，菌源（选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，酵母菌分离采用面曲），肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基，无菌水，无菌培养
皿、无菌移液管、玻璃涂棒、1％重铬酸钾等。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
2 实验方法
2.1肉膏蛋白胨培养基的配制
（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。
（5）分装、加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
2.2高氏一号培养基的配制
（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。
（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lLNaOH溶液调pH至7.2~7.4。
（5）分装、加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
2.3马丁氏培养基的配制
（1）称量：称取培养基各成分的所需量。
（2）溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分。
（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
（4）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。（5）加塞、包扎。
（6）高压蒸汽灭菌20分钟。
（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60℃左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入
3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。
2.4豆芽汁葡萄糖培养基的配制
（1）称取新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100mL水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。
（2）按100ml 10％豆芽汁加入5g葡萄糖。
（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。
（4）分装、加塞、包扎。
（5）高压蒸汽灭菌20分钟。
待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。
2.5细菌分离
2.5.1制备土壤稀释液
称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10－3……10－7顺序编号，放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml10－2土壤稀释液，此为10－3稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成10－4、10－5、10－6、10－7的土壤稀释液。
2.5.2涂布分离
用无菌移液管分别吸取上述10－7、10－6、10－5、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。每个稀释度涂两个平板。
2.5.3．恒温培养
将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。
2.6放线菌分离
2.6.1．称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。
2.6.2．用无菌移液管分别吸取上述10－5、10－4、10－3、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
2.6.3．将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养5～7d后观察结果。
2.7、霉菌的分离
2.7.1．称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。
2.7.2．将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取10－4、10－3、10－2、三个稀释度菌悬液0.1mL，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
2.7.3．将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养3～5d后观察结果。
2.8酵母菌的分离
2.81．称取面曲1g，加入加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，用玻璃帮将面曲捣碎，振荡20min，即成10－2稀释度的面曲稀释液。
2.8.2．用无菌移液管分别吸取10－6、10－5、10－4、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。
2.8.3．将涂好的平板放于30℃恒温培养箱中培养2～3d后观察结果。
2.9.革兰氏染色法
2.9.1. 涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.9.2. 染色
（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
2.10、肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基和豆芽汁葡萄糖培养基分别用于霉菌和酵母菌的分离培养。
用上述培养基对细菌、霉菌、放线菌、酵母菌进行培养，菌落形态特征的观察及细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌落特征的比较。
3 结果
细菌菌落多为光滑型、湿润、质地软，表面结构及边缘结构特征很多，具有各种颜色。
但也有干燥、粗糙的菌落，甚至呈霉状但不起绒毛。
酵母菌菌落呈圆形，比细菌菌落大，表面光滑，质地软，颜色多为白色或红色。 放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基结合紧密，不易被挑取。菌落表面呈粉状或皱褶呈龟裂状，具有各种颜色，正面和背面颜色不同。
霉菌菌落长成绒状或棉絮状，能扩散生长，疏松，很容易挑取。也具有各种颜色，如白色，绿色，灰色等，正面和背面不尽相同。
对细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的菌落特征进行比较，见表3.1
表格3.1四种微生物的菌落特征
3.1 菌体形态
在不同的培养基下培养后的四类微生物菌体形态分别见图3-1、3-2、3-3、3-4
图3-1细菌的菌落形态
图3-2霉菌的菌落形态
图3-3酵母菌的菌落形态
图3-4 放线菌的菌落形态
3.2 染色鉴定
细菌和放线菌经染色后涂片显微观察结果分别见图3-5、3-6。霉菌和酵母菌涂片显微观察的结果分别见图3-7、3-8。
图3-5 细菌显微图片
图3-6放线菌显微图片
图3-7 霉菌显微图片
图3-8 酵母菌显微图片
微生物的接种、分离和培养
实验六微生物的接种、分离和培养 一、目的要求 1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理及操作要领。 2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。 3．了解微生物需氧培养的方法。 4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。 二、实验原理 1. 微生物接种 指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。 2. 微生物分离 指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。 平板分离法的基本原理包括两个方面： （1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入 某 种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 （2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。 因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。 值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 3. 微生物培养 指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。 4. 微生物的培养形状 培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。 菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
模板土壤微生物的分离培养技术实验报告.doc
重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制
一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
土壤微生物的分离纯化与鉴定
土壤微生物的分离纯化 与鉴定 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
目录
摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 关键词 土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养 前言 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的 1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的 方法； 2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法； 3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法； 4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室 培养法观察鉴定未知真菌。
实验原理 一、经典分类鉴定方法 以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。 二、现代分类鉴定方法 1．微生物遗传型的鉴定 （1） DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素： *解链温度法（Tm值） *(G+C)mol%值只能做否定判断； *（G+C）mol%值差别>5，属不同的种； 差别>10，属不同的属。 （2）核酸分子杂交法 *DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专 一性。 结论： I DNA同源性≥ 60% （同种） II DNA同源性≥ 70% （同亚种） III DNA同源性60~ 70% （不同亚种） IV DNA同源性20~ 60% （同属） （3）16s rRNA作为细菌进化的计时器 本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主。 实验整体思路： 在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数； 通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；
微生物的分离与培养
病原物的分离与培养 病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。 －、灭菌与消毒 灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。 (一) 热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。 1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。 进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；
微生物实验报告
微生物实验报告 一环境中的微生物的检测和分离纯化 实验目的： 1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法 2 学习用稀释涂布法分离微生物 3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理 实验材料： 1 土样溶液，无菌生理盐水 2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 实验步骤： A 培养基的制备(已提前制备好) B 周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验 1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。 3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。 4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。 5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。 6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。 C 土壤中分离微生物 1 采土样，制备土壤稀释液(已准备好) 2 取三个平板，每个培养基上用取液器添加100μL的土壤稀释液，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 3 将平板依旧放在35℃的培养箱中培养24h。 D 菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出每个平板上的菌落数量。其中，土样中的微生物含量可用以下式子计算 土壤中的细菌含量(个/g土壤)=菌落平均数×10×稀释倍数 实验结果及数据： 实验结果如附图。
微生物的分离和培养的一轮复习
微生物的分离和纯培养技术 一、培养基 1、培养基的概念：人们按照______________对营养物质不同的_______，配制出供其生长繁殖的________________叫培养基。根据其物理状态，一般分为_______________________和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂_____________后，就能制成__________________ 2、培养基的营养成分：各种培养基的配方不同，但一般都含有__ 、、、和______等最基本的生命物质。在此基础上还要满足微生物生长对_________、特殊营养物质以及_________的要求。 二、无菌技术 1、消毒方法：___________________、__________________、化学药剂消毒法 2、灭菌方法：___________灭菌、_______________灭菌、___________________灭菌 【思考】无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 【思考】请选用合适的方法为下列材料或用具进行消毒或灭菌 （1）培养细菌用的培养基与培养皿。___________（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管。__________ （3）实验操作者的双手。___________ 三、分离和纯培养大肠杆菌的实验操作 1、制备培养大肠杆菌的培养基：即牛肉膏蛋白胨固体培养基，一般步聚：计算、_______、_______、_______、倒平板。 2、接种和纯化大肠杆菌 ①平板划线法：是通过______________在琼脂固体培养基表面划线的操作，将聚集的菌种___________________到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由_____个大肠杆菌繁殖而来的肉眼可见的菌落 ②稀释涂布平板法：是将菌液进行_______________________稀释，再将不同稀释度的菌液_____________涂布到琼脂________培养基的表面进行培养。在涂布稀释度_____________的培养基表面上可获得单个菌落。 课题延伸：对于频繁使用的菌种我们可以采用_______________的方法，但这种方法保存的时间不长，菌种易被污染或产生变异，需长期保存的菌种可采用___________________的方法放在___________℃的冷冻箱中保存。 【讨论】1、平板划线时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的未端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环
土壤微生物的分离鉴定
土壤微生物的分离鉴定 实验报告 09级生科一班（周一下午组） 安明玉 同组者：陈汶灿、程彬、陈肖然、高琳璐、秦瑶 一、实验摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。 二、实验目的 1.学会设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。掌握倒平板和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2.巩固练习显微镜使用方法。 3.明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。 4.复习掌握细菌稀释分离和划线分离技术，平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。 5.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。 6.学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。 三、实验原理 1.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。 本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理包括以下两个方面： (1)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。 2. 显微镜的使用及细胞的简单染色和革兰氏染色 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复试显微镜。 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，对微生物学研究最为重要，直接影响显微镜的分辨率。 与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。这样做
实验二微生物的分离、纯化和接种
实验二微生物的分离、纯化和接种 微生物的分离、纯化 1、目的要求 1.1了解微生物分离和纯化的原理 1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法 2、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。 3、实验材料 3.1培养基 肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。 3.3仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。 4流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5、步骤 5.1平板划线分离法 5.1.1倒平板 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。 5.1.2划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
不同水体中微生物的分离与鉴定
环境微生物 综合性实验实验报告 班级： 组员： 指导教师： 学年：2012 –2013 日期：2013-03-29
不同水体中微生物的分离与鉴定 摘要水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含一定数量的微生物。不同的水体由于受到物理、化学、生物等各个方面因素的影响,使其中所含微生物的种类和数量不同。本实验通过对雨水和湖泊水中微生物的培养、分离与鉴定，了解自然界中的不同水体中存在的微生物的种类和数量，比较两种水体中微生物群落的分布特点，进一步了解不同水体的清洁程度。 关键词微生物雨水鱼塘水种群 SOLATION AND IDENTIFICATION OF DIFFERENT MICRO-ORGANISMS IN WATER Abstract Water is the microorganism widely distributed natural environment. A variety of natural water often contains a number of micro-organisms. Different bodies of water due to the influence of the physical, chemical, biological and other factors, including the type and quantity of microorganisms contained in different. In this study, rain and lake water microbial cultivation, isolation and identification, understanding the distribution characteristics of the microbial community of the types and quantities of the different bodies of water in the nature of the micro-organisms, compare the two water bodies to learn more about the cleanliness of the different water bodies. Key words Microbial Rainwater Fish pond water Populations
微生物实验报告模板
微生物实验报告模板 淀粉与微生物篇一：实验十分离产淀粉酶的微生物 第十次实验分离产淀粉酶微生物 学院：生命科学学院 专业：生物科学类 年级：20XX级 姓名： 学号：1007040085 20XX年XX月XX日 实验十分离产淀粉酶的微生物 一、实验目的 1、熟悉常用微生物培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的配制方法。 2、学习各种无菌操作技术，并用此技术进行为微生物稀释分离、划线分离接种。 3、用平板划线法和稀释涂布平板发分离微生物。 4、认识为微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。 5、掌握分离产淀粉酶微生物的试验方法和步骤，了解产淀粉酶的微生物种类及形态。 二、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般
在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离产淀粉酶的微生物，应该取那些富含产淀粉酶的微生物的土样。从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一类型微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有 1、简单单细胞挑取法 2、平板分离法和稀释涂布平板法 此次实验采取的是平板分离法和稀释涂布平板法结合，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括： 1)稀释后的细胞悬液图不在平板上可以分离得单个菌株 2)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 3)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验
微生物的分离与培养知识点
微生物的分离与培养知识小结与专题训练 一、微生物的培养和分离技术 1.微生物生长需要的营养物质一般都含有水、碳源、氮源、无机盐 牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。 蛋白胨，是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。 对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。 2.培养基的制作合格与否通过未接种的培养基表面是否有菌落生长来验证 3.常用的无菌技术有 ⑴对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 ⑵将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ⑶为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ⑷实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 考点细化： ①灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒是指用较为温和的理化方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，不包括芽孢、孢子。 ②灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，灼烧灭菌用于接种用的金属工具；干热灭菌用于能耐高温的，需要保持干燥的玻璃器皿等；高压蒸汽灭菌用于培养基等 ③消毒的方法有煮沸消毒法，用于液体消毒；巴氏消毒法，用于不耐高温的液体；化学药剂（如用体积分数70%-75%的酒精）或紫外线消毒，用于物体表面的消毒。 4.微生物的纯培养指的是防止外来杂菌入侵。 5.配制固体培养基的步骤：计算、称量、溶化、（调节pH、分装、包扎）灭菌、倒平板 6.微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是纯化的菌落。 ★平板划线法中的注意事项 ①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种分离和鉴定技术 微生物纯培养分离技术获得纯培养物对微生物学研究至关重要。纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。液体培养基菌悬液连续稀释培养容器中仅含1个菌体单个菌体纯培养物固体培养基无菌土豆片1881年很多细菌不能在土豆上生长肉膏蛋白胨培养基明胶固化明胶高温易溶化不能37?C培养琼脂固体培养基1882年一直沿用至今方法冗长结果不稳定易污染微生物纯培养分离技术纯培养物分离方法固体培养基分离涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离单细胞孢子分离选择培养分离涂布平板法1、少量样品加到平板中央1mL2、玻璃三角涂棒浸入酒精3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面适当条件下培养平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法平板划线法斜线法用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条再转动培养皿70?角并将接种环上剩余物烧掉待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。曲线法将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。稀释摇管法适合厌氧菌的纯培养物分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50?左右待分离的菌种用这些试管进行梯度稀释摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后菌落形成在琼脂柱的中间液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中大多数一般应超过95表现为不生长。单细胞孢子分离单细胞或单孢子分离法是采取显微分离法从混
微生物实验报告思考题参考答案
实验一、微生物得简单染色思考题 1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么? 答:油镜在使用时必须在载玻片与物镜之间滴加镜头油。油镜使用过程中要注意两点：(１）、使用后镜头得清洁：镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”(观察完毕,上悬镜筒,先用擦镜纸擦去镜头上得油,然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液)擦去残留得油,最后用擦镜纸擦去残留得二甲苯，后将镜体全部复原）。 (2)、、观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜,最后用油镜。当目视接目镜时,特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器,以免压碎玻片或损伤镜面. 2、使用油镜时,为什么必须用镜头油？ 答：在使用普通显微镜时，当光线由反光镜通过玻片与镜头之间得空气时，由于空气与玻片得密度不同,使光线受到曲折,发生散射，降低了视野得照明度。若中间得介质就是一层油（其折射率与玻片得相近）,则几乎不发生折射,增加了视野得进光量，从而使物象更加清晰。3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不就是直接用高倍镜或油镜观察？ 答：低倍镜视野比较大，能瞧到得范围大，容易找到观察得目标,然后在用放大倍数高得高倍镜或油镜有目得得观察。 实验二、革兰氏染色 (１）为什么必须用培养2４ｈ以内得菌体进行革兰氏染色？ 答：24h以内得菌体处于活跃生长期，菌体细胞壁具有典型特征，而处于老龄得革兰氏阳性细菌壁结构开始发生变化，染色时会被染成红色而造成假阴性 （2）要得到正确得革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步就是关键步骤?为什么? 答：应注意如下几点： 其一,选用活跃生长期菌种染色,老龄得革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性； 其二，涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性; 其三,脱色就是革兰氏染色就是否成功得关键，脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性（3）当您对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 答：当要确证未知菌得革兰氏反应时,可用已知菌进行混合涂片,使二者染色条件保持一致,如果已知菌得结果与预期相符，则证明操作操作正确，结果可靠。 实验三、微生物得显微镜直接计数法 1、在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点? 答:1）优点:直观、快速、操作简单。 2）缺点: 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌得计数; 需要相对高得细菌浓度； 个体小得细菌在显微镜下难以观察； 实验四、微生物大小得测定 1、在不改变目镜与目镜测微尺，而改用不同放大倍数得物镜来测定同一细菌得大小时,其测定结果就是否相同?为什么？ 答:相同；目镜测微尺就是一块圆形玻片,其中央刻有精确等分得刻度，有把５毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100等分.测量时,将其放在接目镜中得隔板上来测量经显微镜放大后得细胞物象。由于在不改变目镜与目镜测微尺，而改用不同放大倍数得物镜来测定同一细菌得大小时，物象得放大倍数与每小格目镜测微尺所代表得长度在变化比例上就是同步得，
大学土壤微生物分离实验报告
从土壤中分离纯化培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据细菌在选择培养基的存活情况，确定该菌种的固氮解磷解钾属性。 【关键词】细菌芽孢杆菌培养基、选择培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物选择培养、分离、纯化，根据菌落的存活状况来判断未知 菌的属性。 实验原理： 菌种来源:选择无机磷农药含量较高的土壤,有机磷农药化工厂 旁边的土壤和排污口区的污水. 培养基的选取：五组选择培养基，分别以辛硫磷、甲胺磷、敌敌畏、草甘膦及五种有机磷农药混合为微生物生长的唯一氮源磷源。 分离纯化微生物：稀释倒平板法、涂布平板法、稀释摇管法、平板划线分离法。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部
分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。 1. 实验器材、试剂与实验方法： 1.1器材： 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液枪、枪头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台, 粉碎机，接种环，移液枪配枪头。 1.2试剂： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、NaCl、95%乙醇、75%酒精，草甘膦，甲甘磷，敌敌畏，辛硫磷。 1.3土样、样品： 取自二十三冶草莓园的土壤，建设北路的大棚蔬菜菜地土壤，化工厂污水口。 1.4 实验方法 1.4.1配制培养基： (一）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基200ml(用2个100ml三角瓶和2支试管分装）牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下：牛肉膏 0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 琼脂 3~4g 水 200ml pH 7.4-7.6 1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白 胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用 玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。 3、调pH 用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH， 边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用１mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的
微生物的分离与纯化
一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （
三.巩固检测 1．获得纯净培养物的关键是( ) A．在无菌环境中培养B．接种纯种细菌 C．接种环灼烧灭菌D．防止外来杂菌的污染 2．巴氏消毒法常用于酒、奶等食品的消毒，该消毒法就是加热到70～75 ℃、保持30 min，或加热到80 ℃、保持15 min，能杀死一般杂菌和病原菌。这与灭菌的要求相比，巴氏消毒法( ) A．不能杀灭芽孢和孢子B．只能杀灭芽孢等休眠状态的细菌 C．能杀灭各种细菌，包括芽孢D．能杀灭各种真菌，包括孢子 3．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部分的微生物（） A．接种环、手、培养基 B. 高压锅、手、接种针 C. 培养基、手、接种环 D. 接种环、手、高压锅 4.下列操作与消毒或灭菌无关的是（） A. 接种前用酒精灯火焰灼烧接种环 B. 接种前用酒精擦试双手 C. 接种在酒精灯水焰旁完成 D. 培养基在冷却到50℃ 时倒平板 5．制备固体培养基的步骤是( ) A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板 6.平板冷却凝固后要将平板倒置，其意义是（） A. 防止菌种死亡B．利于培养基的冷却 C．利于大肠杆菌的接种D．防止皿盖上的冷却水倒流入培养基 7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱培养的目的是（）A．为了检测温度是否最适宜B．检查培养基是否灭菌彻底 C．为了下次接种时再使用D．没必要放入未接种的培养基 8. 下列关于平板划线操作的叙述正确的是（） A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌 B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞10. 稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是（） A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 11. 下列关于平板划线法和稀释涂布平板法纯化大肠杆菌的叙述，正确的是（） ①可以获得单个的菌落②都需要使用接种环进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌． A．①② B. ③④ C.①③ D. ②④ 12. 下列有关实验室中微生物培养和分离的叙述，错误的是（） A. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵 B. 高温灭菌的目的是杀死所有微生物 C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落 D. 稀释涂布平板法可用于计数活菌数目 13. 平板划线法：通过在琼脂固体培养基表面的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是。 14. 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的，然后将不同稀释度的菌液分别 在琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成。 15．大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中含有109 个，且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌，因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。请据此回答下列问题： （1）测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用稀释涂布平板法进行测定。 该方法首先配置LB 培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃，在 旁倒在培养皿中形成平板；对奶茶样品进行一定倍数的稀释，取0.1mL 奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中的数目；该数据比实际数值要(高、低)，原因是 C．将培养皿盖全部打开后，用沾有菌液的接种环进行划线接种 D. 接种时，接种环在培养基上迅速划线后盖上皿盖 9. 在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数，下图是利用平板划线法进行微生物接种过程中的部分操作，有关叙述不正确的是（） A．每次划线前都需要灼烧接种环 B．接种环冷却后从上一区划线的末端开始划线 C．最后一区和第一区要保证不重叠 D．只有在图中的5 区域才可以得到所需菌落 。实验完成后需要对培养基进行处理，然后才能倒掉。（2）若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配置LB 培养基，灭菌后，将在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜环境中培养。
微生物分类鉴定
第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图