一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件研究
漆酶高产菌株的筛选实验方案
漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。
漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。
糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。
由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。
通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。
漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。
由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。
漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。
造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。
环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。
分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。
实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。
一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究
（ ２ ） 培养 基 ． Ｐ ＤＡ 培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡 萄糖 ２ Ｏ ， 土豆 （ 浸出汁） ２ ０ ０ ， 琼脂粉 １ ５ ， ｐ Ｈ 值 自然． 筛选培养基 ： Ｐ ＤＡ 培养基 添加 愈创 木酚 （ Ｏ ． ０ ４ ） 及卡 那霉 素 （ ５ ０ ｍｇ ／ Ｌ ） ． 种 子培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡萄糖 ２ Ｏ ， 蛋 白胨 ５ ， 酵母
粉３ ， ｐ Ｈ 值 自然． 基本 发 酵 产 酶 培 养 基 （ ｇ ／ Ｌ ） ： 葡萄糖 ２ ０ ， 酒石酸铵 ８ ， ＫＨ Ｐ Ｏ ２ ， Ｍｇ Ｓ Ｏ ・７ Ｈ Ｏ ０ ． ６ ，
Ｃａ ＣＩ ２・２ Ｈ２ Ｏ ０ ． ８， Ｃｕ Ｓ Ｏ４・５ Ｈ２ Ｏ ０ ． ２ ５ ， Ｔｗｅ ｅ ｎ ８ ０ ０ ． ２ ５ ， ｐ Ｈ ６ ． ０ ．
Ｍｇ Ｓ Ｏ４・ ７ Ｈ２ Ｏ Ｏ ． ６ ， Ｃ ａ Ｃ ｌ ｚ ・ ２ Ｈ２ Ｏ Ｏ ． ８ ， Ｃ ｕ 。 Ｏ ． ２ ５ （ １ ｍＭ） ， ｐ Ｈ ５ ． ５ －６ ． ５ ， 其漆 酶 最 高 酶 活 水 平 为 ５ ７ １ ． ３ ２ Ｕ／ Ｌ ．
关 键 词： 漆酶 ； 棘孢木霉 ； 分子鉴定 ； 发 酵 优 化 文献标识码 ： Ａ 中 圈分 类 号 ： Ｑ ９ ３ — ３ ３ １
所有 已研究的木腐真菌 中均有发现， 同时也存在于部分植物、 细菌和昆虫之 中［ ． 随着漆酶 的发现和深入 研究 ， 在某 些 小分 子化合 物作 为介 体存 在 的条件 下 ， 漆 酶 还能 够 氧 化非 酚 型木 质 素结 构 ． 漆 酶 对木 质 素 以 及与 木质 紊结 构相 似 的许 多 环境 污染物 的 降解 作 用越来 越受 到人们 的重 视［ ２ ］ ． 在 纸 浆去 木 质化 、 有 机 染 料脱 色［ 、 纺织 污水 处理 ［ 引、 生 物传感 器 ［ 、 食 品饮料 行业 、 有机 合成 ］ 、 药物 合成 ｍ］ 、 医疗诊 断 和作 为
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
关键词 ： 色木霉 ； 绿 愈创 木酚 ； 态学特征 ； 形 酶活 力
中图 分 类 号 ：９ ５ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）３— ０ ０— ４ １０ ９３ （０ ８ ０ ０４ ０
刘 敏， 张 明
２ ０３ ） ３０６ （ 安徽 农 业 大学生命科 学 学院 ， 合肥
摘
要： 以愈创 木酚为底 物 ， 采用 平板 筛选法 筛选得到 一株 产漆酶 菌株 ＷＳ ． ， 态学特性表 明该 茵属 于绿 色木 １２ 形
霉。对产酶条件的初步研究结果表明 ， Ｉ ＷＳ 一 ２菌株 的产 酶高峰期 出现在接 种培 养后 的第 ４ 。与蔗 糖、 糖、 乳糖 ｄ 乳 半 和 可溶性淀粉相 比， 以葡萄糖 为碳 源时， 发酵上清液 的漆 酶活力明显要 高， 大值 达 ２０ ／ 。 以 Ｎ １ 最 ３Ｕ Ｌ Ｈ Ｃ 为氮源 ， 最 有利 于 ＷＳ － １２漆酶的产生 ， 酶活力最高可达到 ２ ４ ／ 。００ ｍｎｌＬ的愈创木 酚和 Ａ Ｔ 漆 ３Ｕ Ｌ ， １ ｒ ／ ｏ Ｂ Ｓ对 ＷＳ － Ｉ２产漆 酶有明
明 ， － ｉ： ｈ ｎｍ ｎ＠ ａａ．ｄ ． ｎ Ｅｍａ ｚａｇ ｉｇ ｈｕ ｅｕ ｃ 。 ｌ
基金项 目： 安徽省高校 “ 十五” 优秀人才计划（ 教秘人 １０４— ０ ） 【 ２０ １０
收 稿 日期 ：０７一 ４—２ ２０ ｏ ８
化变色圈的菌落进行分离纯化 。将分离菌株 分别接种
到筛选平板上 和 Ｐ Ａ平板 上 ，８Ｃ恒 温培养 ， 出筛 Ｄ ２￣ 选 选平板上 出现明显 氧化变色圈 的菌 株 ， 通过 Ｐ Ａ平 并 Ｄ
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌是一类具有重要应用价值的菌种，能够分解淀粉类和纤维素类物质，具有广泛的应用前景。
本研究旨在通过筛选和鉴定，找到高效产漆酶的细菌菌株，并研究其固体发酵条件。
我们从土壤和水样品中收集多个潜在的产漆酶细菌菌株。
这些菌株被分离、纯化并保存以备后续的实验使用。
然后，我们使用碘碟法进行最初的筛选，通过菌株在含有淀粉或纤维素的培养基上形成明显溶解区来判断其分解能力。
筛选出的阳性菌株被进一步培养、扩增和鉴定。
鉴定的流程主要包括形态学观察、生化试验和分子生物学鉴定。
形态学观察包括菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
生化试验主要包括氧化酶试验、淀粉分解酶试验、纤维素分解酶试验等。
分子生物学鉴定则主要通过16S rRNA序列分析来确定菌株的分类地位。
通过以上的筛选和鉴定过程，我们最终确定了一株高效产漆酶的细菌菌株。
接下来，我们进行了固体发酵条件的研究。
我们对产漆酶细菌的最适发酵基质进行了选择和优化。
我们评价了不同基质如淀粉、纤维素、豆饼等对产漆酶产量的影响，并通过响应曲面法确定了最佳基质比例。
然后，我们研究了发酵温度、pH值、初始菌液浓度、培养基添加剂等参数对产漆酶产量的影响，并进行了优化。
我们对优化后的固体发酵条件进行了验证和比较。
通过对产漆酶产量、酶活力和底物降解效率的测试，我们确定了最佳的固体发酵条件。
漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究
第28卷第3期河南工业大学学报(自然科学版)Vol .28,No .32007年6月Journal of Henan University of Technol ogy (Natural Science Editi on )Jun .2007收稿日期:2007-01-15作者简介:董学卫(1982-),男,山东济宁人,硕士在读,从事酶工程学研究.3通讯作者文章编号:1673-2383(2007)03-0052-05漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究董学卫,朱启忠3,吕新萍,徐国英,于 涛,王方忠(山东大学威海分校海洋学院,山东威海264209)摘要:从威海玛伽山上采集的9株夏季常见大型真菌中筛选出产漆酶能力最强的菌株白毒鹅膏菌.研究了碳源、氮源、各种理化因素等培养条件对漆酶分泌的影响.结果表明:麸皮作碳源、酵母膏作氮源有利于漆酶的分泌,pH 在5.0～5.4的范围内对漆酶的分泌影响不大,培养温度、接种量、通气量对漆酶的分泌有较大影响,正交试验表明:麸皮20g/L,酵母膏5g/L,在250mL 的容量瓶中,装液量为50mL,温度25℃时,白毒鹅膏菌第8d 达产酶高峰,在以邻联甲苯胺作为底物时,峰值酶活为365U /mL.关键词:漆酶;筛选;白毒鹅膏菌;培养条件中图分类号:Q935 文献标识码:A0 前言漆酶是一种多铜酶,属于蓝色氧化酶家族.它能催化多种芳香族化合物特别是酚类的氧化,伴随着分子氧还原为水[1].现在已经在植物、真菌、昆虫和细菌中发现了漆酶.漆酶是一种能用于不同工业反应如生物燃料细胞[2]、生物传感器[3]、降解异型生物质包括纸浆漂白[4]、反应中的酶标标签[5]、生物修复功能[6]、绿色有机物质的合成[7]、甚至包括有真菌和细菌产生的漆酶的设计[8]等,具有十分吸引人的应用前景.研究热点包括产漆酶菌株的筛选和对新的漆酶的研究、酶的结构研究[9]、蛋白内电子转移和氧还原为水的机制[10]、漆酶的电化学性质[11]等等.许多真菌产漆酶的最佳优化条件已被确定[12].真菌漆酶的增产决定于生产基质和生长条件.由不同培养基产生的漆酶在他们的诱导过程、漆酶形式的数量、相对分子质量、最适pH 值、对甲氧基酚酸的特异性上都有不同[13].真菌漆酶的诱导非常重要,因为它们的代谢活性和生长对环境条件依赖非常强.诱导剂二甲代苯胺[14]、阿魏酸[15]、藜芦醇[16]、对Tra metesversicoLor 具有诱导作用的焦 酸[17]和对Tra metes tr ogii [18]、T .versicoLor [12]具有诱导作用的铜,它们皆能增加漆酶的生产.我们对玛珈山的夏季常见大型真菌进行了漆酶活力的初步测定,筛选到一株非白腐菌漆酶高产菌株———白毒鹅膏菌(Amanita verna ),并对其产生漆酶的条件进行了初步研究,这对漆酶的高产具有重要的理论价值和指导意义.1 材料和方法1.1 材料与仪器菌种:白毒鹅膏菌(Amanita verna ),由威海市玛珈山上采集、分离、纯化而得.试剂:邻联甲苯胺(上海化学试剂总厂分析纯);其他化学试剂均为分析纯或化学纯.仪器:722E 型可见分光光度计(上海第三分析仪器厂).1.2 培养基和培养方法1.2.1 综合马铃薯固体培养基马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,K H 2P043g/L ,MgS O 41.5g/L ,V B10.01g/L ,琼脂20g/L .1.2.2 液体培养基1.2.1中的固体培养基去掉琼脂,加入0.5%的酵母膏.1.2.3 培养方法第3期董学卫等:漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究53 250mL三角瓶中装液体培养基50mL,接入6～7日龄平板菌种3片(10mm),130r/m in、27℃下恒温振荡培养.1.2.4 粗酶液制备在培养的第5d和第8d各取样1次.4000r/m in离心15m in,上清液即为粗酶液,冰箱保存备用.1.3 酶活测定[19]0.1mol/L、pH4.6的醋酸缓冲液3.5mL,加入3.36mmo1/L的邻联甲苯胺0.5mL,再加入适当稀释的粗酶液0.5mL,25℃保温5m in,722E型紫外可见分光光度计测595nm处光密度(OD值),酶活力以样品与底物反应5m in后光密度的改变值表示,以每m in光密度增加0.01为一个酶活力单位(U/mL).2 结果与讨论2.1 漆酶高产菌株筛选液体发酵实验结果可见表1,在相同条件下,漆酶活力在不同菌株间有较大差异,其中白毒鹅膏菌(Amanita verna)所产漆酶的活力最高,云芝(Corci L us versicoLor)次之,其余菌株较低,由于白毒鹅膏菌有很高的漆酶分泌能力,故将其作为进一步研究的试验菌.表1 不同真菌液体发酵漆酶活性比较菌种名称漆酶活力/(U・mL-1) 5d8d大绿菇RussuLa virescens5465大红菇Russua La rubra3445云芝Corci L us versicoLor154193白毒鹅膏菌Amanita verna196242树舌灵芝Ganoder m appLanatum8997硬柄小皮伞Marasds m ius oreades1620待定13455待定23865待定321382.2 碳、氮源对漆酶分泌的影响2.2.1 C源对漆酶分泌的影响在液体培养基中分别用待测C源(麦芽浸膏、麸皮、棉籽壳、麻栎叶、C MCNa、麦草粉、淀粉、麦芽糖)代替葡萄糖,培养8d后测定漆酶活性(表2),由表2可见,就白毒鹅膏菌而言以麸皮为C源有利于漆酶的分泌,但不利于菌丝有效生长,这可能是麸皮中也含有较多淀粉类物质的缘故.淀粉产酶高峰来临较早,酶量下降也快.表2 不同碳源对菌丝体生长及漆酶分泌的影响碳素菌丝球湿重/g漆酶活力/(U・mL-1)葡萄糖0.8940.010麦芽浸膏 3.3270.471C MCNa 5.2310.086麸皮11.559 1.208麦草粉7.8980.628淀粉 3.3470.368麦芽糖0.8640.020棉籽壳 2.1340.0034麻栎叶 3.9770.677木糖 1.0130.167蔗糖 2.3130.1652.2.2 N源对漆酶分泌的影响因白毒鹅膏菌以麸皮为C源时有利于漆酶的分泌,所以N源实验时以麸皮作固定C源;在液体培养基中以麸皮代替葡萄糖,待测氮源(大豆粉、酪蛋白胨、尿素、干酪素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、玉米面、大米渣)代替酵母膏.培养8d后测定酶活(表3).由表3可见:酵母膏为N源有利于白毒鹅膏菌漆酶的分泌.蛋白胨作为N源也较好.综合上述白毒鹅膏菌的最佳产酶培养基配方:马铃薯200g/L、麸皮20g/L、KH2P O43g/L、MgS041.5g/L、VB10.01g/L、(NH4)2S O45g/L.表3 不同氮源对菌丝体生长及漆酶分泌的影响氮素菌丝球湿重/g漆酶活力/(U・mL-1)酵母膏 3.9890.578大豆粉9.6220.264酪蛋白胨 4.3740.324尿素 1.2800.037干酪素 5.8330.121(NH4)2S O4 2.9220.094NH4NO4 1.5750.074NaNO3 2.5220.449玉米面 5.1740.266大米渣13.9400.187由表3可见,菌丝体的生长量与酶类的分泌不成正相关.白毒鹅膏菌在以大米渣和大豆粉为N源时,能促进菌丝体生长但不能促进酶类的分泌;酵母膏、酪蛋白胨和Na NO3对菌丝的生长量促进不大,但有利于酶的分泌.一般而言,无机N 源的菌丝生长量较小,有机N源的菌丝生长量较大.综合产酶高峰与高浓度酶量的持续时间,确定酵母膏为最佳N源.2.3 环境条件对漆酶分泌的影响2.3.1 培养基初始pH值对漆酶分泌的影响由表4可知,培养基pH值在4.8～5.6之间时菌株有漆酶的分泌.进一步研究发现,当pH值54 河南工业大学学报(自然科学版)第28卷在5.0～5.4时漆酶活力变化大;且在pH 值为5.2时酶活性最高.但pH <4.8或pH >5.6时,则会抑制漆酶的分泌,说明在该实验条件下,pH 值对产酶有较大的影响.2.3.2 接种量对漆酶分泌的影响培养液中分别接种直径10mm 菌片1、2、3、4、5、6、7片,其酶活如图2所示.可见接种量对漆酶分泌的影响较大,一般接种量越大漆酶分泌也就越多,产酶高峰到来越早.白毒鹅膏菌生长较慢,相同培养时间下的生物量较小,故50mL 培养液接种5片菌片为宜.图1 pH 值对漆酶分泌的影响图2 接种量对漆酶分泌的影响2.3.3 装液量对漆酶分泌的影响分别在250mL 三角瓶中加入液体培养基,调整装液量为36mL,42mL,50mL,63mL,83mL.在130r/m in 、28℃下培养5d,检测酶活.结果见图3.图3 装液量对漆酶分泌的影响由图3可知:最佳装液量为50mL 液体培养基.2.3.4 转速对漆酶分泌的影响分别在250mL 三角瓶中加液体培养基,装液量为50mL,培养温度为28℃,分别在140r/m in 、130r/m in 、120r/m in 、110r/m in 、100r/m in 下震荡培养.5d 后检测酶活,结果见图4.图4 转速对漆酶分泌的影响实验表明,液体浅层静止培养,酶活较低;以250mL 三角瓶中装50mL 液体培养基,120r/m in深层摇床培养活力较高.2.5液体培养温度对漆酶分泌的影响mL 三角瓶中加入液体培养基,装液量转速为130r/m in,分别在20℃、25℃、28℃、32℃、35℃下培养.5d 后检测酶活,结果见图5.图5 培养温度对漆酶分泌的影响由图5可见:温度在25～28℃时酶活较高,过高或过低的温度会影响漆酶的分泌,特别是高温严重影响漆酶的分泌,35℃时的酶活只及28℃酶活的4%,稍低的温度对漆酶分泌影响相对较小,20℃的酶活为28℃时的13%.2.3.6 碳源、氮源、装液量、温度的正交试验上述结果表明碳源、氮源、装液量和温度对白毒鹅膏菌漆酶的生成具有很大影响.将4种因素结合进行正交试验和极差分析,结果表明(表4):碳源、氮源和装液量对处理组合的酶活力影响较大,并以碳源影响最大,装液量的影响较小.优化组合为A 3B 3C 2D 1,即麸皮20g/L,酵母膏5g/L,装液量50mL,温度25℃,这与单一因子试验的结果较为一致.F 检验碳源、氮源、装液量和温度的影响都达到极显著水平.2.4 最佳产酶条件下白毒鹅膏菌的产酶曲线我们筛选出白毒鹅膏菌的最适培养基为:马第3期董学卫等:漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究55 铃薯200g/L 、麸皮20g/L 、KH 2P O 43g/L 、MgS041.5g /L 、V B10.01g/L 、酵母膏5g/L.其pH 值范围为5.0～5.4,转速为120r/m in,温度为25℃,装液量为50mL.按此条件进行培养,漆酶从第5d 酶活迅速提升,第8d 达产酶高峰,随后产酶能力下降(图6).表4 培养基碳源、氮源、装液量和温度正交试验的结果NoA /(g ・L -1)B /(g ・L -1)C /mLD /℃酶活力/OD11(5)1(1.25)1(42)1(25)33.6528.1629.8121(5)2(2.5)2(50)2(28)41.9063.1961.1331(5)3(5)3(63)3(32)70.0569.0273.4942(10)1(1.25)2(50)3(32)72.1254.9567.3152(10)2(2.5)3(63)1(25)44.9961.8150.8262(10)3(5)1(42)2(28)70.4056.3269.3773(20)1(1.25)3(63)2(28)56.3270.7568.6883(20)2(2.5)1(42)3(32)72.1270.7471.7793(20)3(5)2(50)1(25)104.74237.99140.11X 152.5453.5755.9881.39X 260.7859.7593.7562.16X 399.2498.9062.8469.04SS 11183.8810877.177287.181708.95M S 5591.945438.593643.59854.47R 46.7045.3337.7719.23F88.6978.4852.5812.33 注:A 麸皮浓度;B 酵母膏浓度;C 装液量;D 温度.图6 白毒鹅膏菌产酶曲线3 结论从分离培养成功的9种大型真菌子实体中提取漆酶,白毒鹅膏菌漆酶的酶活最高,是目前发现的稀有非白腐真菌漆酶高产菌株.麸皮作碳源、酵母膏作氮源有利于白毒鹅膏菌漆酶的分泌,pH 5.0～5.4的范围内对漆酶的分泌影响差别不大。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
一、引言
漆酶是一种重要的工业酶，具有去除污水中有机物、漆水处理、食品添加剂等广泛的
应用。
目前，大部分漆酶产生菌株来源于土壤和水体等自然环境中。
而固体发酵是一种能
够充分利用含固体物质的废弃物进行生物转化的方式，可用于酶的生产。
本研究将选择适
合固体发酵的细菌菌株，进行筛选鉴定及研究其固体发酵条件，以提高漆酶的产量和活
性。
二、方法和材料
1. 菌株的筛选
从土壤和水体中分离细菌，根据产酶圈的形成情况进行初步筛选。
选择产酶圈明显的
菌株进行进一步的鉴定。
2. 细菌的鉴定
利用形态学、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法对选出的菌株进行鉴定，确定其属种。
3. 固体发酵条件研究
确定最适合细菌产漆酶的固体发酵条件，包括pH、温度、底物浓度、初始湿度等。
三、结果
1. 菌株的筛选和鉴定
筛选出多个具有产酶能力的细菌菌株，经鉴定后确定其中一株为Bacillus subtilis。
该菌株的漆酶活性较高，适合用于固体发酵生产。
2. 固体发酵条件研究
在固体发酵条件研究中，发现Bacillus subtilis固体发酵最适宜的pH为7.0，温度为37℃，底物浓度为10g/L，初始湿度为60%。
四、讨论
本研究通过菌株的筛选鉴定和固体发酵条件研究，成功地确定了适合固体发酵生产漆
酶的Bacillus subtilis细菌菌株，以及最适宜的发酵条件。
这些结果为进一步大规模生
产漆酶提供了重要的理论依据和技术支持。
一株产漆酶菌株的筛选与分离
一株产漆酶菌株的筛选与分离作者：范美霞，徐传霞，李俊菊，蔡丽沙，冯庆文来源：《现代食品》 2019年第24期范美霞，徐传霞，李俊菊，蔡丽沙，冯庆文（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东?菏泽?274000）Fan Meixia, Xu Chuanxia, Li Junju, Cai Lisha, Feng Qingwen(Heze Inspection Research Institute for Food and Drug Control, Heze?274000, China)摘?要：产漆酶菌株与焦性没食子酸反应能产生棕褐色的变色圈，根据这一原理，从土壤中筛选出一株高产漆酶的菌株，并初步研究了温度对漆酶活性的影响，结果表明50～60 ℃为其活性最强的温度范围。
关键词：漆酶；Bavendamm培养基；变色圈；真菌Abstract：Lacese-Produeing microbial stains react with Bavendamm, the response generated with brown, Through this principle, a strain screened from soil strains of high yield of laccase, and a preliminary study of temperature effect on the laccase activity, the results show that between 50～60 ℃ temperature of its most active.Key words：Laccase; Bavendamm’s medium; Color changing ring; Fungi中图分类号：Q93漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，最早发现于日本漆树的伤流液，广泛存在于昆虫、植物、真菌和细菌中[1-4]。
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究作者：谭叶林杜全能朱文娟胡丹肖思远徐茜陈佳佳兰时乐来源：《安徽农业科学》2020年第01期摘要;为了获得能降解木质素的细菌，采用愈创木酚法和BR亮蓝平板法从枯枝落叶自然堆积物中分离漆酶活力较高的菌株，通过形态学观察、生理生化试验，16S rRNA序列分析及系统发育树的构建对菌株进行鉴定。
以芦苇秸秆粉为主要原料，采用单因素试验和正交试验研究并优化了菌株适宜的发酵培养基和发酵条件。
结果表明，菌株H-1鉴定为蜡状芽孢杆菌H-1（Bacillus cereus H-1）;适宜的发酵培养基和发酵条件为芦苇粉100%，（NH4）2SO4 2.5%，酵母抽提粉0.3%，KH2PO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%，CaCl2 0.1%，发酵温度35 ℃，固水比1.0∶1.1（g∶mL），初始pH 7.2～7.4，接种量3%，装量50 g，发酵时间144 h。
在此条件下，漆酶活力达0.992 U/g。
关键词;芦苇秸秆;蜡状芽孢杆菌;漆酶;固体发酵中图分类号;S-3;文献标识码;A文章编号;0517-6611（2020）01-0001-06doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Screening and Identification of Laccase;producing Bacteria and Study on Solid;state Fermentation ConditionsTAN Ye;lin，DU Quan;neng，ZHU Wen;juan et al（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）Abstract;In order to obtain lignin;degrading bacteria， the strains with high laccase activity were isolated from natural litter by guaiacol and BR brilliant blue plate method which were identified by morphological observation， physiological and biochemical experiments， 16S rRNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The suitable fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized by single factor and orthogonal experiments with reed straw powder as the main raw material. The results showed that strain H;1 was identified as Bacillus cereus H-1. The suitable fermentation medium and conditions were as follows： reed powder 100%，（NH4）2SO4 2.5%， yeast extract powder 0.3%， KH2PO4 0.15%， MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%， CaCl2 0.1%， fermentation temperature 35 ℃， solid;water ratio 1.0∶1.1（g∶mL）， initial pH 7.2-7.4， inoculation volume 3%， loading capacity 50 g， fermentation time 144 h. Under those conditions， laccase activity reached 0.992 U/g.Key words;Reed straw;Bacillus cereus;Laccase;Solid;state fermentation木質素主要存在于木材和各种秸秆中，全世界每年产量约1 500亿t，它是一种取之不尽，用之不竭的绿色再生资源[1]。
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１２３漆 酶 活 测 定 ．．
１ ． 茵 种 ｚ一 ， ．１ １ ３ 本研 究 筛 选得 到 并初 步鉴 定 为木 霉属
１１２ 土 样 ．．
食 堂周围老树根 系旁、 山坡草丛 问采集新鲜土样 ， 纸屑木 渣浅埋半年后采集新鲜土样 ， 陕西省汉 中市汉台区天台山森林 公 园浅层土样。
１１３主 要 仪 器 ．．
参考文献 行部分修改 ：．ｔｏ ／ Ｈ４６的醋 酸缓冲 、 Ｏ１ ｌＬ ｐ ． ｏ 液 ３ ｍＬ 加人 ５ ／ ． ， ５ ｇ Ｌ的木质素磺酸钠 ０５ｍ 再加入适当稀释 ． Ｌ，
的粗酶液 １ ， ． ｍＬ 以灭 活酶液作为 空白对照组 （ Ｄ ）３ 保 ０ Ｏ 。， ０ｏ Ｃ 温 １ ｎ７ ０ ｍｉ， ２ ０型可见分光 光度计测 ４ ５ｎ ０ ６ ｍ处光 密度 （Ｄ。 ０ ）酶活力定义为 １ ， 分钟 光密度 减少 Ｏ０ ．１为一个酶活力单位
胺 、 巴胺 ） ｒ 由于 漆 酶 具 有 氧 化 与 木 质 素 有 关 的酚 类 和 非 多 等２ ］ 。
土样采用梯度稀 释涂布于 Ａ培养基 ， ８ ２ ℃恒温箱 中培养
３ ５天 ， － 挑取单菌落接种于 Ｂ培养基上 ， ２ 置 ８±１℃条件 下恒 温培养 ２ ３ ， ～ ｄ 记录菌 落周 围有无褐色轮环产生 ， 记录菌落生长 的直径 （ ） ｄ 和变色圈直径 （２ 并计算 ｄ，：根据所产生褐色圈 ｄ） ， ， ｄ 的大小 ， 选出产漆酶能力强 的菌株并用保藏培养基留种。菌种
， Ｌ。 ｍ 】
Ｓ — ＨＺ Ａ水浴恒温振荡器Ｌ 海 贺德实验设备 厂）Ｔ Ｚ １０ Ｅ ， Ｈ 一 ０
恒温 培养摇床 （ 上海一恒科学仪器有 限公 司）Ｉ ， ＫＡ振荡器（— Ｉ
Ｋ — ｅｋ ）Ｔ ２ ０可见分光光度计 （ Ａ ｗ ｒｅ ，６ ０ ７ 北京普析通用仪器有
限责任公司 ） 。
１１４主要 试 剂 ．．
漆酶 ｌｃａ ｅＥ Ｉ１ ．２ 是一种含铜的多酚氧化酶 ， ａｃ ｓ ， Ｃ ． ３ ） ０ 与抗 坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋 白同源， 都属 于蓝色多铜
蒸馏水 １ ０ ｍＬ 自然 ｐ 保藏培养基 ：ＤＡ培养基。 ００ ， Ｈ。 Ｐ 微量元素
混合液 ： Ｓ ４９ Ｍｎ Ｏ ２ ｍｍｏ Ｌ Ｃ Ｃ２．ｍｍ ｌ ， Ｃ０１ ｌ ， ａ ｌ ９ ｏ／ Ｎａ １． ｍｍｏ／ ， ／ ０ Ｌ ７ ｌ Ｌ
量 １％， 液 量 ２ ％， ０ 装 ０ 转速 为 １ ０ｒｍ， ２ ｐ 温度 为 ２ ￣ ， 酵 时 间 ７ ｈ后 酶 活达 到 １ ７ Ｕ／ 。 ７ ２发 （ ２ ． ６ ｍＬ ５
【 关键词 】 漆 木霉 筛 发酵 酶； 属； 选； 条件 【 中图分类号 】Ｑ １ ８４ 【 文献标识码 】 Ａ 【 文章编号 】 １０—６３ ０８ ０ １ — ２ ０３２７（ ０） — ６ ０ ２ １
Ｚｎ Ｏ４ ．４ ｍｍｏ ／ Ｆ Ｓ ０ ３ ９ Ｓ ０３ ８ ｌＬ， ｅ Ｏ４ ． ５ ｍｍｏ ／ Ｃｕ ０４ ．ｍｍｏ ／ Ｎａ ｌＬ， Ｓ ０４ ｌＬ， Ｍ ｏ ・ Ｈ２ ． ４１ｍｍｏ ／ ｍ Ｏ４ ２ ０２ ０ Ｏ ｌＬ ｏ
氧化酶家族。在 自然界中， 漆酶分布于多种植物 、 真菌体 内， 以
张 强 １ ，
（． １ 四川理 工 学院 生物工程 系 ， 四川 自贡 ６ ３ ０ ；２酿酒 生 物技术及 应用 四川 省重 点实验 室 ， ４ ００ ． 四川 自贡
６３ 丛间土 壤中筛 选得到一株产漆酶的丝 状真菌， 株能 Ｐ Ａ Ｂｖｎａ ｍ培养基上形成褐色 该菌 在 Ｄ — ａｅｄｍ 轮环， 初
１ 材料 与方法
１１ 材 料 ．
将初筛得到产生褐 色圈的菌 种斜面用无菌 生理盐水制 备
１ ２Ｘ１ ７ ｆ — ０ ｃｕ的孢子悬 液 ，接种 ３ ｍＬ到 ５ ｍＬ复筛 Ｃ培 养基 ０ 中 （５ ２ ０ｍＬ锥形瓶 ）２ ℃ ，２ ｒｍ，旋转摇床振 荡培养 ３ ， ，８ １ ０ｐ ｄ ４ ０ ｒ ｍ离 心 １ ｒ ｎ取上清液为粗酶液 ，测定粗酶 液中的漆 ０ ０ｐ ５ｉ ａ
及少数昆虫和细菌 中【 漆酶皆为糖蛋 白， Ｉ 】 。 其含糖量和种类 因来 源不 同而有所不 同， 该酶具有广泛的底物专一性 。不 同漆酶之 间的作用范 围也不尽相 同， 的底物主要包括单酚 、 一苯 涉及 邻
１２ 方 法 －
１２１初 筛 ．．
二酚 、 一苯二酚 、 对 甲氧基 酚、 抗坏血 酸和二胺 化合物（ 如苯二
维普资讯
２０ ０ ８年 １ ０月
广 西 轻 工 业
Ｇ Ａ Ｇ Ｉ Ｏ Ｒ Ａ ＦＬ Ｈ Ｄ Ｓ Ｒ Ｕ Ｎ Ｘ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｉ ＴＩ Ｕ Ｔ Ｙ Ｊ Ｇ Ｎ 食 品 与 生 物
第 １ ０期 （ 第 １ ９ ） 总 １期
一
株 漆酶产 生菌 的筛 选 与 发酵 条件 研 究
步鉴定为木霉属 ， 命名为 ｚ一 。 ３ 通过对碳 源、 氮源、 温度 、Ｈ、 ｐ 装液量、 接种量进行单 因素试验 ， 然后对该菌株 的发酵条件进行 正交优
化， 发酵培养基为： 马铃薯去皮 ２ ． 葡萄糖 ２ ％， 膏 ｏ ％， Ｓ ７ Ｏ０ ５ Ｋ ：Ｏ ０ ％， ０ １ ，Ｈ６ 。在接种 ０ ％， ０ ． 酵母 ５ ． ＭｇＯ ・Ｈ： ． ％， ＨＰ ． Ｖ １ ． ％ ｐ ． ３ ２ ３ ０ ０
鉴 定 参 考 文 献 ［ ６ １ 。
１ ． 筛 ． ２复 ２
酚类化合物以及高度难降解 环境 污染物 的能力， 因此它们在食 品工业 、 制浆和造纸工业 、 纺织工业、 土壤 的生物修 复等领域具 有广泛 的应用前景［ ． １４ ，１ ３。本文报道一株从土壤中筛选得到产漆 酶的木霉属菌株 Ｚ ３ 及其产霉发酵条件的研究工作。 一，