高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留

高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留摘要:为了建立高效液相色谱-荧光测定畜禽粪污中氧氟沙星､诺氟沙星､环丙沙星､恩诺沙星残留的分析方法,将畜禽粪便样品经乙腈超声提取,再经正己烷液-液萃取,并经氮吹浓缩,乙腈与水混合溶解残渣,过微孔滤膜,采用高效液相色谱-荧光检测,以0.01 mol/L四丁基溴化胺(pH 3.0)/乙腈(94/6,V/V)为流动相,于激发波长280 nm､发射波长480 nm处进行检测｡结果表明,畜禽粪污样品中4种喹诺酮类抗生素的平均回收率为77.8%~98.2%,相对标准偏差为 3.5%~7.2%,检测限为0.005~0.010 μg/kg｡该方法简便､快速,可满足畜禽粪污中4种喹诺酮类兽药残留量的同时检测｡关键词:畜禽粪污;喹诺酮类抗生素;高效液相色谱法;荧光检测Determination of Four Kinds of Fluoroquinolones Antibiotics Residues in Livesotck Feces by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence DetectionAbstract:A reversed-phase high performance liquid chromatography method has been developed for the simultaneous determination of four fluoroquinolones antimicrobial residues in livesotck feces. The samples were ultrasonically extracted by acetonitrile, followed by a double liquid-liquid extraction with n-hexane. After the solvent was vaporized by nitrogen stream, four analytes were analysed by high performance liquid chromatography-fluorimetric detection with excitation and emission wavelength of 280 nm and 480 nm, respectively, using 0.01 mol/L tetrabutyl ammonium bromide(pH 3.0)/acetonitrile (94/6,V/V) as the mobile phase. The average recoveries of the four fluoroquinolones in livesotck feces ranged from 77.8% to 98.2%, and relative standard deviation were 3.5%~7.2%. The detective limit for four quinolones were from 0.005 to 0.010 μg/kg. The results indicated that the developed multiresidues method were easy and fast. It has also demonstrated that the method could meet the requirements for simultaneous determination of four kinds of fluoroquinolones antibiotics in livestock feces.Key words: livestock feces; fluoroquinolones antibiotics; high performance liquid chromatography; fluorescence detect近年来,随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的发展,抗生素作为饲料添加剂等越来越被广泛地应用于畜禽养殖业中｡兽用药物在保障动物健康､提高畜禽生产力和改善人民生活水平等方面都起着重要的作用,兽用药物的种类及用量与日俱增,尽管抗生素作为兽药和饲料添加剂在畜禽疾病防治和生长促进方面发挥了较大的作用,然而,抗生素通过口服或肌肉注射进入动物体内后,仅少量被内脏器官吸收利用,约30%~90%以原药和代谢产物的形式经动物的粪便和尿液进入生态环境中,给环境土壤､表层水体等生态环境带来不良影响[1]｡目前,畜禽养殖粪便及其施肥土壤中的兽用抗生素污染已经达到较为严重的程度,畜禽粪便中抗生素带来的环境污染问题引起了各方面的关注和重视[2]｡喹诺酮类药物是最近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素,是继磺胺类药物之后人类在合成抗生素方面最重要的突破,其抗菌作用是磺胺类药物的近千倍｡氟喹诺酮(Fluoroquinolones,FQs)类药物是第三代喹诺酮类药物,广泛地用于畜禽的细菌､霉形体病防治,已投入使用或即将进人兽医领域的药物有10多种,目前国内外已批准用于动物的FQs包括恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)､诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)､环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)､氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)等[3]｡近年来,氟喹诺酮类抗生素已在水环境､土壤环境和畜禽废物中有不同程度的检出[4-8]｡对水环境､土壤､肉､奶､蛋等中氟喹诺酮类抗生素残留检测技术的研究较多,主要是采用液相色谱-质谱联用方法,但利用高效液相色谱仪分析畜禽粪便中氟喹诺酮类抗生素的报道很少｡为此,本研究建立了高效液相色谱-荧光检测同时测定土壤中4种氟喹诺酮类抗生素的分析方法,旨为畜禽粪便中抗生素兽药残留提供技术支持｡1 材料与方法1.1 仪器与试剂Agilent1100高效液相色谱仪(配荧光检测器),Million-Q超纯水制备系统,超声波清洗器,旋涡混合器,离心机,精密pH计,氮吹仪等｡4种氟喹诺酮类抗生素标准品:氧氟沙星(OFL)､诺氟沙星(NOR)､环丙沙星(CIP)和恩诺沙星(ENR),纯度>99.0%,Sigma公司｡甲醇和乙腈,色谱纯,Fisher公司;其余试剂均为分析纯;实验用水为超纯水｡1.2 试验方法1.2.1 粪尿样品的前处理1)畜禽粪便:准确称取待测鸡或猪粪便10.00 g,置于50 mL离心管中,加20 mL 乙腈和2 g无水硫酸钠浸泡提取,在漩涡混匀器上以2 500 r/min混匀1 min,45 ℃超声25 min,4 000 r/min离心10 min,将上清液转入浓缩瓶中,再重复提取两次,合并上清液,样品上层清液用40 mL正己烷萃取两次,氮气吹至近干,用2 mL乙腈饱和的正己烷溶解残余物,转入10 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min,弃去正己烷层,下层清液用尼龙微孔滤膜过滤,供高效液相色谱仪测定｡2)畜禽尿液及养殖废水:取畜禽尿液及养殖废水30 mL,4 000 r/min离心10 min,将上层清液用40 mL正己烷萃取两次,氮气吹至近干,用2 mL乙腈饱和的正己烷溶解残余物,转入10 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min,弃去正己烷层,下层清液用尼龙微孔滤膜过滤,供高效液相色谱仪测定｡1.2.2 色谱条件Waters色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);激发波长为280 nm,发射波长为480 nm;柱温为40 ℃;进样量为10 μL;流动相为0.01 mol/L四丁基溴化胺(pH3.0)/乙腈(94/6,V/V);流速为1.0 mL/min｡1.2.3 标准曲线分别精确称取0.010 0 g氟喹诺酮类抗生素于100 mL容量瓶中,再加入10 mL 0.03 mol/L氢氧化钠进行溶解,用乙腈定容至刻度,摇匀,得100 μg/mL的标准储备液｡将标准储备液逐级稀释,依次得0.01､0.02､0.05､0.10､0.20､0.50､1.00 μg/mL的标准品工作液,以色谱峰面积对质量浓度作图,得出氧氟沙星､诺氟沙星､环丙沙星和恩诺沙星四种氟喹诺酮类抗生素兽药的标准曲线｡2 结果与分析2.1 色谱条件的选择2.1.1 流动相的选择氟喹诺酮类药物属两性化合物,具有两性官能基团,在水溶液中均以离子形式存在,在流动相中加入离子对试剂可以降低其极性以改善峰形和提高分离度｡研究过程中分别以不同离子对试剂为流动相考察对氟喹诺酮分离的影响｡试验确定了0.01 mol/L四丁基溴化胺与乙腈(94/6, V/V)溶液为流动相,可获得4种喹诺酮类抗生素标准溶液的色谱分离图(图1),25 min内均能达到基线分离｡2.1.2 检测波长的确定氟喹诺酮类药物含苯环结构和共轭大π键,因此有较高的荧光效率,可采用荧光检测器进行定量分析｡采用荧光检测比紫外检测高1~2个数量级｡对4种氟喹诺酮类药物分别进行激发-发射波长扫描,结合其最大吸收波长,实验确定了激发波长为280 nm和发射波长为480 nm为荧光检测条件｡2.2 线性关系和检出限在选定的色谱条件下,取不同浓度的4种氟喹诺酮标准混合溶液分别进样,以峰面积对进样量进行线性回归,4种氟喹诺酮类药物在0.01~1.00 μg/mL范围内,浓度和峰面积呈现良好的线性关系,可以满足定量分析的需要,其线性范围见表1｡以信噪比(S/N)为3计算方法的检出限(LOD),对氧氟沙星､诺氟沙星､环丙沙星和恩诺沙星的检测限分别为:0.010､0.005､0.010和0.010 μg/kg｡2.3 回收率和精密度配制不同浓度的混合标样,分别对畜禽粪污样品和空白样品进行添加回收实验｡4种氟喹诺酮类药物的添加回收率均在77.8%~98.2%之间,其多次测定的相对标准偏差在3.5%~7.2%之间,该方法稳定性和重现性均较好,能满足畜禽粪便中氟喹诺酮类药物残留检测｡回收率和方法的相对标准偏差见表2,空白谱图和添加浓度0.01 mg/kg的色谱图见图2和图3｡3 结论运用所建立的方法对4种氟喹诺酮类药物在各基质中进行检测,平均回收率在77.8%~98.2%之间, 检测限为0.005~0.010 μg/kg,测定的相对标准偏差在3.5%~7.2%之间,且各药物浓度和峰面积呈现良好的线性关系,表明方法的准确性､精密度和灵敏度均符合残留分析要求｡所建立的方法操作简便､灵敏度高,适用于畜禽粪污中4种氟喹诺酮类药物残留的同时测定｡参考文献:[1] SARMAH A K, MEYER M T, BOXALL A. 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