微卫星DNA标记技术及其在鱼类中的应用
一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记及其引物对和应用
专利名称：一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记及其引物对和应用
专利类型：发明专利
发明人：秦蛟,程飞,谢松光,张磊
申请号：CN202111470481.9
申请日：20211203
公开号：CN114058715A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于入侵物种种群遗传学DNA分子标记技术领域，本发明提供了一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记及其引物对和应用。
本发明通过构建须鳗虾虎鱼简化基因组文库，进行高通量测序，对基因组中的微卫星位点进行筛选，对其中的14个位点进行大样本种群的多态性实验验证。
首次筛选得到了14个多态性微卫星标记，包括10个高度多态性标记和4个中度多态性标记。
本发明为须鳗虾虎鱼入侵种群遗传学的研究提供分子技术支持，有助于对其进行入侵种群来源、入侵路径的回溯研究。
申请人：中国科学院水生生物研究所
地址：430072 湖北省武汉市武昌区东湖南路7号
国籍：CN
代理机构：北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙)
代理人：周新楣
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微卫星DNA标记分析野生鲤鱼群体的遗传多样性(英文)
微卫星DNA标记分析野生鲤鱼群体的遗传多样性(英文)李大宇;康大海;殷倩茜;孙效文;梁利群【期刊名称】《遗传学报：英文版》【年(卷),期】2007(34)11【摘要】利用30个微卫星分子标记对海南鲤(HN)、长江鲤(CY)、月亮湖鲤(YL)、黑龙江鲤(FY)、呼伦湖鲤(ZL)、贝尔湖鲤(BR)6个野生鲤鱼群体的观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(Ae)等进行了遗传检测,根据基因频率计算遗传相似系数和Nei氏标准遗传距离,χ2检验估计Hardy-Weinberg平衡,用近交系数(FST)和基因流(Nm)分析群体的遗传分化及其来源。
同时,使用PHYLIP3.63软件绘制基于Nei氏标准遗传距离的UPGMA进化树。
6个群体共检测到8,136个扩增片段,长度在125bp～414bp,30个基因座扩增出等位基因数从3～13个不等,共计210个等位基因,平均每个基因座扩增得到7个等位基因。
结果显示:(1)6个野鲤群体的多态性指标均适中,多态信息含量依次0.44、0.52、0.53、0.57、0.63和0.64,有效等位基因数1.04～4.72个不等,平均有效等位基因数依次为2.19、2.60、2.42、2.43、2.45和2.33,无偏期望杂合度平均值为0.50、0.59、0.56、0.56、0.57和0.54;(2)遗传相似系数BR与ZL最高(0.8511),BR与HN最低(0.6688),聚类结果与地理分布呈一定相关性。
【总页数】10页(P984-993)【关键词】分子标记;微卫星;群体多样性;鲤鱼【作者】李大宇;康大海;殷倩茜;孙效文;梁利群【作者单位】黑龙江水产研究所北方鱼类生物工程育种重点开放实验室;大连水产学院生命科学与技术学院【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.斑节对虾3个野生群体遗传多样性的微卫星标记分析 [J], 赵志英;梁丽运;白丽蓉2.山东省三个鲤鱼群体遗传多样性及亲缘关系的微卫星标记分析 [J], 马洪雨;岳永生;郭金峰;公维华;王慧3.许氏平鲉(Sebastes schlegeli)微卫星标记开发及野生、养殖群体遗传多样性分析 [J], 韩承慧;马海涛;姜海滨;刘阳;韩慧宗;王斐4.用微卫星标记分析湘华鲮野生群体遗传多样性 [J], 刘明求;刘臻;李传武;卞伟;余长生;鲁双庆5.运用微卫星DNA标记分析我国野生鹌鹑遗传多样性 [J], 常国斌;常洪;刘向萍;王惠影;徐伟;赵文明;王庆华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
微卫星DNA标记技术的特点及其在动物研究中的应用
基 因 的重 复单 位 数 目是 高 度 变
同 ． 此 微卫 星显 示 了高 度 多 态 性 因 通 过 对 微 卫 星 Ｄ Ａ 态 性 的 研 究 可 在 生 Ｎ 多 产 中选 取 数 个 与 生 产 性 能 相 连 锁 的微 卫 星标 记 。在 这 些 位 点 上 对 所 研 究 的 品 种 或 品 系进 行 分 析 ．计 算 父 本 与母
１２ 微 卫 星 ＤＮ 数 量 多 且 在 基 因组 ． Ａ
尔遗传规律 ．能够稳定地从上一代传
位 点 多态 性 ． 些 特 点 可 以 帮 助 我 们 这 进 行 做 各 种 遗 传 分 析 ．而 且 在 这 些 微 卫 星位 点 中多 数 可 以 为 不 同 动 物 所 共
１１ 微 卫星 标 记 具 有 丰 富 的 多态 性 ． 微 卫 星 结 构 中 各 位 点 上 不 同 等 位
增 发 现 ：在 羊 中５ ％ 的引 物 可 扩 增 出 ６
特 异产 物 ．其 中４ ％ 的扩 增 产 物 表 现 ２
多 态 ．而 在 马和 人 中则 未 扩 增 出多 态
用。 目前 ． 卫 星 标记 技术 已经 被 广 泛 微 运 用 于 遗 传 图谱 的 构 建 、品 系 间 的 遗
物 ． 过 Ｐ Ｒ 增 ． 后 再 通 过 凝 胶 电 通 Ｃ 扩 然
（ 春 学 院 生命 科 学 与资 源 环 境 学 院 ， 西 宜 春 宜 江
中图 分 类 号 ：８５ ￥ １
文献 标 识 码 ： Ｂ
文章 编 号 ：０ ８ ｏ １（ｏ １— ０ ４ ０ １０ 一 ４ ４２ ｌ）２ ０３ — ２ １
大刺鳅（Mastacembelusarmatus）微卫星标记开发及野生群体遗传多样性分析
摘要摘要大刺鳅(Mastacembelus armatus)隶属合鳃目(Symbranchiformes)、刺鳅科(Mastacembelidae)、刺鳅属(Mastacembelus)，是一种广泛分布在我国南部各水系的重要的经济鱼类。
近年来，随着经济的迅猛发展，人为过度捕捞和生存条件恶化等原因，促使大刺鳅野生资源下降，因此，保护大刺鳅的野生资源迫在眉睫。
物种的遗传多样性(genetic diversity)是其适应环境和保持演化潜力的基础，目前有关大刺鳅遗传多样性的研究较少，因此，本研究以不同水系的大刺鳅为研究对象，利用微卫星标记(microsatellite marker)和EPIC(exon-primed intron-crossing)分子标记，对大刺鳅的遗传多样性和遗传结构(genetic structure)进行研究，为其遗传资源保护和利用奠定基础。
本研究的主要内容如下：1.通过PIMA(PCR isolation of microsatellite arrays)法和RAD-seq(restriction-site associated DNA tags sequencing)法两种方法筛选了66对大刺鳅微卫星引物。
每对引物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳进行筛选。
PIMA法开发的6对引物中有4对为多态引物，平均等位基因数N A为2.333，平均期望杂合度H E和观测杂合度H O分别为0.272和0.139，平均多态信息含量(PIC)值为0.234，有4个位点经校正后仍偏离哈迪温伯格(Hardy-Weinberg)平衡(P<0.05)。
RAD-seq开发的60个位点中有30个偏离Hardy-Weinberg平衡，其中有58个位点表现出多态性，平均等位基因数为6.383，平均期望杂合度H E和观测杂合度H O分别为0.602和0.760，平均PIC值为0.537。
2.利用10个微卫星分子标记对中国南部10个大刺鳅群体共283个个体进行了遗传多样性分析。
DNA分子标记技术在水产动物中的研究综述
DNA分子标记技术在水产动物中的研究综述摘要：分子生物学的飞速发展及其各项技术的广泛应用,对水产动物的研究工作产生了很大的影响.DNA分子标记在水产动物研究中的广泛应用,对于优良品种的选育、亲缘关系和品系家系的鉴定、重要经济性状基因的定位克隆以及大规模疾病的防治有重要的作用。
关键词：DNA分子标记；RFLP；RAPD；AFLP；水产动物近年来，由于物种种质退化、病害频繁、养殖环境恶化等问题，严重制约了水产养殖业的发展。
将分子标记技术广泛的应用到水产动物研究，不仅有利于选育优良品种和对养殖品种的遗传改良、野生种质资源的恢复、保护，而且还有利于防止种质退化，使水产动物养殖走上健康养殖的道路。
当前，RFLP、RAPD、AFLP 和微卫星DNA等分子标记技术，已被广泛地应用到水产动物遗传育种、疾病检测及系统发育领域的研究中。
1DNA分子标记技术DNA分子标记技术是以基因组DNA的多态性为基础的一种新型遗传标记技术，它可以直接反映生物个体在DNA水平上的差异。
与传统的遗传标记相比，DNA 分子标记具有标记位点多、遗传信息量大、实验重复性强、不受生物的年龄、发育阶段、性别和养殖环境条件的影响等特性，因此倍受遗传学家和育种学家的青睐，已被广泛地应用于生物的基因定位、基因克隆、遗传育种等诸多方面，并成为分子生物学与分子遗传学研究的主要内容之一。
如今，应用于遗传育种领域的DNA分子标记技术主要有：RFLP；RAPD；AFLP；微卫星DNA。
2 几种DNA分子技术在水产动物中的研究进展2.1 RAPD标记2.1.1 RAPD标记的原理及其特点RAPD即随机增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA），是在PCR 基础上发展起来的一项分子标记技术，是由美国科学家J.Williams和J.Welsh 两个研究小组于1990年几乎同时建立的。
基本原理是用一系列（通常为数百个）不同的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链（一般10bp）作为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。
DNA分子标记技术及其在水产动物遗传上的应用研究
DNA分子标记技术在水产动物遗 传中的应用
1、筛选优良品种
利用DNA分子标记技术，可以快速准确地鉴定出水产动物优良品种。通过对 特定基因或基因组的遗传变异分析，研究人员能够发现与生长速度、抗病能力、 环境适应性等优良性状相关联的基因标记，进而为选育优良品种提供依据。
2、评估养殖品种的亲本来源
DNA分子标记技术的实验方法
1、样本采集
从水产动物的不同组织（如肌肉、肝脏、肾脏等）中提取DNA样本，或收集 受精卵、幼体等不同发育阶段的样本进行实验。
2、实验流程
（1）DNA提取：采用适宜的DNA提取方法，如酚氯仿抽提法、DNA沉淀法等， 从组织样本中提取DNA。
（2）DNA变性：将DNA在特定条件下进行变性处理，以便于进行后续的PCR扩 增。
应用前景和挑战
1、应用前景
DNA分子标记技术在水产动物遗传学领域具有广泛的应用前景。首先，该技 术可用于筛选和培育优良品种，提高水产动物的产量和品质。其次，通过评估养 殖品种的亲本来源，可确保遗传资源的正确利用，保持品种的遗传稳定性。此外， 利用DNA分子标记技术开展遗传连锁分析，有助于深入了解水产动物的遗传机制， 为遗传育种提供更多的理论依据。
DNA分子标记技术概述
DNA分子标记技术主要分为三种类型：限制性片段长度多态性（RFLP）、随 机多态性序列（RAPD）和单核苷酸多态性（SNP）。这些技术的原理是通过对DNA 序列的变异进行检测，从而发现不同个体或品种间的遗传差异。DNA分子标记技 术的特点是具有高分辨率、高灵敏度和客观性，使其成为遗传学研究的有力工具。
结论
本次演示介绍了DNA分子标记技术及其在水产动物遗传上的应用研究。通过 深入了解DNA分子标记技术的原理、特点和分类，我们可以看到其在筛选优良品 种、评估亲本来源和遗传连锁分析等方面的广泛应用。虽然仍存在一些问题和挑 战，但随着技术的不断进步和优化，相信DNA分子标记技术在水产动物遗传学领 域的应用将越来越广泛，为水产业的可持续发展提供更多的理论依据和技术支持。
DNA检测方法在鱼类物种鉴定中的应用
。
２ ２ ０１
０９ 年月 葶 期
ＮＴ ＡＳＥＣＪ ＲＡＯＨｌ版 ＮＥ Ｉ ＡＵ ＬＣＮＥＯ学 Ｌ然ＡＡ １Ｒ． Ｒ Ｉ南 学 Ｎ 自 学Ｎ Ｖ Ｓ＇ 海 大Ｕ 报 Ｆ ＿ Ｕ 科Ｎ Ｉ ’ Ｙ
Ｖ３０ ０Ｏ． １ ３ Ｓ２ ．Ｎ ｅｏ ｐ１ ．２
文章编号 ：０ ４—１２ （０ ２ ０ ０ ９ ０ １０ ７ ９ ２ １ ）３— ２ ３— ６
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海 南 大 学 学 报 自 然 科 学 版
软 件对 序列 进行 亲缘 关 系分析 ， 以确 定物 种． 目前 ，Ｎ Ｄ Ａ序列 分析 的靶 基 因主要 是线 粒体 Ｄ Ａ 的细胞 色素 ｂ基 因 （ ｙ ｂ ． Ｎ Ｃ ｔ ）线粒 体 Ｃｔ ｙ ｂ基 因具 有 相 对 高 的种 间差 异 、 低 的种 内变异 以及 相 当长 的 变化 序 列 ， 较 因而 可通 过 ｃ ｔ ｙ 别 密 切相 关 的物 种 ． ｂ鉴 其
ｌｎｔ ｏｙ ｒｈｓ Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ ） ｅｇ ｐｌ ｐｉ ｈ ｍｏ ｍ， Ｃ ．Ｆ Ｐ 方法 ， 主要 研究 对象 为鳕 鱼 、 鳟鱼 、 鱼 、 丁鱼 、 鲑 鲭 沙 鲨鱼 、 安康鱼 等 ． 对 于鳕 鱼 的 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ ．Ｆ Ｐ鉴 定方 法研究 较 多．０５年 Ａａｉ ｉ 鉴定 了阿拉 斯加 狭鳕 、 ２０ ｒｎｓ 等 ｈ 太平 洋 真鳕和 大 西 洋真 鳕 等 ３种 亲缘关 系较 近 的鳕鱼 ；０ ６年 Ａ ａａｉ 鉴定 了真 鳕 ¨‘２０ ２０ ｋｓｋ等 。；０７年 Ｆｎｚ 将 １ＳｒＮ ｉｉｏ ｉ ６ Ａ基 Ｒ 因 的 Ｐ Ｒ产 物进 行 Ｍｖ Ｂｈ２ ５Ｉ Ｃ ａＩ或 ｓ１８ 酶切 ， 建立 了大 西洋 鳕 、 细长臀 鳕 、 眼舒 鳕 、 状褐鳕 、 鳕 、 鳕 大 鲥 蓝 狭 等 ７个 鳕 鱼 品种 的 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ ． Ｆ Ｐ鉴 别方 法¨ ； 年 Ｐｒｚ 翌 ｅｅ 等扩 增 了细胞 色素 ｂ基 因 ４ ４—４５ｂ ６ ６ ｐ的 片段 ， 然 后对 Ｐ Ｒ产 物进行 酶 切 ， 立 了鉴定 ｌ Ｃ 建 ２种无 须鳕 的 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ ．Ｆ Ｐ方法 ¨ ． Ｐ ＲＲ Ｌ Ｃ ．Ｆ Ｐ技术 在 金枪鱼 的鉴定 中也 发挥 了重 要作 用 。０５年 Ａ ａｉ ｉ ２０ ｒｎｓ 等针 对 日本 市 场 用进 口大 西 ｈ 洋鲭 冒充 日本鲭 鱼 的现象 ， 计 了 ５ 设 ｓ核糖体 Ｄ Ａ非转 录 间隔 区的鲭属 特异性 引 物 ， 行 Ｐ Ｒ扩 增 ， 用 Ｎ 进 Ｃ 再
微卫星标记在水产动物遗传研究方面的应用
卫星 Ｄ Ａ具 有 更 短 重 复 单 元 的 Ｄ Ａ序 列 ， 称 为 微 卫 星 Ｎ Ｎ 被 （ ｉｏ ｔｌ ） 由于其是 几个 （ ～ ） 苷酸 为单 位 ， 次 Ｍｅ ｓｅｉ 。 ｒ ａ ｌｅ ｔ １ ６ ｐ核 ｂ 多 串联 重复 Ｎ Ａ序 列 ， Ｄ 因此 又被 称 之 为 简单 重 复 序列 （ｉ ｅ ｓ Ｓｑｅｃ Ｒｐ ｔ ＳＲ 、 ｅｕ ｅ ｅｅ ｓ Ｓ ）简短 串联重 复 序列 （ｈｎＴｎｅ ｅ ｎ ａ， ｓｏ ａｄｍ Ｒ ． ｐ ｔ ｓＲ） 简 单 序 列 长 度 多 态 性 （ｉｐ ｅ ｅｃ Ｌ嚼 ｈ ｅｓ Ｉ 或 ａ， Ｓ ｌ Ｓｑ ｎｅ ｅ ｍ ｅ ｕ Ｐｌ ｏ ｈ ｍ ＳＬ ）ｊ ｏｍ ｒ ｉ ，ＳＰ ＿。根据重复单 元 的构成 与分布 ， 卫 星 ｙ ｐｓ ｌ 微 Ｄ Ａ序列 被分为 ３ Ｎ 种类 型 ： 一 型 （ｕ ）复 合 型 （ｏｐｕｄ 单 ｐｒ 、 ｅ ｃ ｏ ） ｍ ｎ 和间断型 （ ｔｒ ｔ ） ｉｅｕ ｅ Ｏ由于微卫 星在基 因组 中含量 丰 富 、 ｎ ｒｐ ｄ 分 布均匀且具 有高度多态性 等优点 ， 就发展 为一 种分 子标 很快 记技 术 ， 在 自然种群 的许多研究 中得 到 了广泛应 用 。笔 者 并
重点 对微卫星标 记技 术在 水 产动 物遗 传 研究 中的应 用进 行
的遗传多样性进行研究 ， 明长江流域铜鱼遗传多样性较 表
低， 长江 上游 圆 口铜鱼 遗传 多样 性较 高 ， 未 出现种 群遗 传 均 分 化 ， 示 ＳＲ标记对 圆 口铜 鱼群体 间遗传差 异 的检测更 且显 Ｓ 为灵敏 。杜博等 对 皱纹 盘鲍 和盘 鲍南 方养 殖 群体 遗 传 变 ５ ＿ 异 的微 卫星分 析 ， 发现皱纹盘 鲍和盘 鲍南 方养殖 群体 遗传 多 样 性较 高 ， 有利 于遗 传选 育 ， 与野 生群 体相 比等 位基 因有 但 所丧失 。陈红珊 等 应 用 微卫 星 标记 分 析 了 中华 白海 豚遗 Ｊ 传多样性 ， 利用 ４ 微卫 星标记检 测 中华 白海豚 的多态 信息 个 含量 、 度 和 等 位 基 因数 。结 果 显 示 微 卫 星 座 位 Ｐ Ｃ 、 杂合 Ｍ２ Ｐ Ｃ 可用于 中华 白海豚 遗 传 多样性 水 平 的评 估 ； Ｍ４ 中华 白海 豚 在所采用 的 ４ 个座位ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ中显示 的遗传多样 性程度不 高 。 ２２ 基 因遗传 图谱构建 ． 自 ２ 世纪 ９ 年代 初期 以来 ， 卫 ０ ｏ 微
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收稿日期:2006-09-27作者简介:郭宝英,1980年生,女,山东德州人,硕士研究生,主要从事鱼类遗传学及分子生物学研究。
微卫星D NA 标记技术及其在鱼类中的应用郭宝英,谢从新,熊冬梅(华中农业大学水产学院,湖北武汉 430070)摘要:微卫星存在于几乎所有真核生物的基因组中,且呈随机均匀分布;在染色体上,除着丝粒及端粒区域外,其它区域均有广泛分布。
微卫星能参与遗传物质结构的改变、基因调控及细胞分化等过程,有自身特异结合蛋白,能直接编码蛋白质。
通过PCR 扩增并使用凝胶电泳分离可产生大量含有微卫星DNA 片断。
微卫星DNA 标记技术可应用于分析鱼类物种遗传多样性、分析群体的遗传结构、建立遗传图谱和基因定位、鱼类种质资源的保护、建立微卫星DNA 指纹库、亲子鉴定和血缘关系分析以及种群生态学研究。
关键词:微卫星DNA;分子遗传标记;鱼类;应用中图分类号:Q33 文献标识码:A 文章编号:1003-1278(2007)04-0005-05 微卫星DNA 多态性的研究是继RF LP 之后,近几年发展起来的一种新的分子遗传标记技术。
早在1974年,Skinger 在蟹的DNA 中发现了一类短串联重复列T AGG;随后在人、动物和酵母的基因组中都发现了大量的简单重复序列;因为其比小卫星(10～25bp )短,每个重复单位仅1～6个bp,重复数10～20次,为头尾相连的串联重复序列,故称微卫星(m icr osatellite ),又称为简单序列重复(Si m p le sequence Repeat,SSR )DNA 。
这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中,且呈随机均匀分布;它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中,而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子)。
在染色体上,除着丝粒及端粒区域外,其它区域均广泛分布有微卫星位点[1]。
1 微卫星的特点每个特定位点的微卫星DNA 均由两部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区。
核心区含有1个以上被称为“重复”的短序列,一般该重复单位的碱基对数目不变,而串联在一起的重复单位数目是随机改变的。
如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA 分子切割成限制性片断,该限制性片断中位于核心区的外围即是侧翼区。
微卫星DNA 具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点,而且还可以克服RAP D 、RF LP 等标记方法所有的可能将来自不同位点但大小相同的等位基因混淆的缺点,所以微卫星标记被认为是生物群体遗传结构与变异的研究中极有价值的分子遗传标记[2]。
微卫星位点的多态性在分析物种进化、生物群体内的遗传变异以及种间关系甚至生物个体鉴别等方面均已有成功的报道。
微卫星DNA 具有丰富的多态性,主要表现在核苷酸重复单位数目的多态性和等位基因位点的多态性。
一般认为,一个微卫星DNA 核心序列重复数目越高,其等位基因数目也越多,多态性也越丰富[3]。
微卫星DNA 遵循孟德尔遗传规律,能够稳定地从上一代传给下一代,并且等位基因间呈现共显性遗传的特点。
微卫星标记是共显性的单位点遗传标记,即每次检测的是一种特异的DNA 位点,多数情况下每个位点有多个等位基因且具有较高的杂合性,同时自然选择对其影响较小[4],其结果稳定可靠,尤其对分析物种的进化和遗传方式非常有用。
特别重要的是,一系列单位点数据,可以显示遗传重组事件和基因型之间的关系,从而可以准确估计种群间基因交流的水平[5]。
单位点微卫星标记已经成功地应用于种群遗传结构的研究中。
2 微卫星的功能微卫星的功能目前尚不明了,但普遍认为微卫星能参与遗传物质结构的改变、基因调控及细胞分化等过程,有自身特异结合蛋白,能直接编码蛋白质,是一种非常活跃的碱基序列。
目前较公认的是微卫星充当了基因重组的热点,是基因重组和基因变异的来源。
微卫星的核心序列是高度保守的,它可能参与重组有关的蛋白质连接位点。
微卫星DNA 在促进染色体凝集、染色体结构等方面也有作用,如参与染色体折叠、染色体端粒形成等。
微卫星的序列变化万千,在基因调控中可能通过改变DNA 结构或通过维持特异性结合蛋白等来发挥作用。
3 实践方法通过PCR 扩增并使用凝胶电泳分离产生大量含有微卫星DNA 片断的方法中,用微卫星DNA 两端的保守序列做PCR 的方法比较常用。
3.1 微卫星序列获得准确的微卫星序列信息的筛选是微卫星标记的前提和基础,一般来说以下途径最为常用。
3.1.1 构建小片段基因组文库 通过构建相应物种的小片段(一般小于1000bp )基因组文库,利用特定的微卫星探针或杂交方法从文库中筛选阳性克隆,然后对这些阳性克隆进行测序得到微卫星序列。
为提高效率,可首先对阳性克隆进行微卫星引物的PCR 扩增,然后进行测序。
3.1.2 通过互联网数据库检索 当前3大DNA数据库(GeneBank、E MBL、DDBJ)上有丰富的DNA原序列,通过生物软件的辅助,人们可以非常容易得到需要的微卫星序列。
特别是数据库高速度的更新能力,更是备受生物学家青睐。
3.1.3 从RAP D标记中获得 将RAP D扩增电泳后的产物转移到硝酸纤维素膜上,用放射同位素标记的微卫星探针与其杂交,确定杂交信号所处的位置,然后从琼脂糖凝胶上找到相应位置的条带,回收、连接、测序,获得微卫星序列。
3.1.4 利用近缘种的 利用微卫星引物通用性的特点,通过找出亲缘关系近的物种的微卫星特异引物,扩增微卫星序列,测序分析其微卫星序列。
此方法由于依赖于其近缘种的微卫星研究结果,因而应用大受限制。
3.2 微卫星引物微卫星两侧的序列对于同一物种高度保守,因此可以使用与两侧保守的DNA序列相互补的方式设计特定的寡聚核苷酸引物。
实验室中通常采用两种方式得到所需微卫星引物:可以通过检索GeneBank等数据库查找所研究物种带简单重复的DNA序列,用引物设计软件设计引物;也可以直接应用若干已发表的微卫星标记引物。
在基因组内具有高度专一性的微卫星引物一般为18～24个核苷酸,(G+C)碱基比例接近50%～60%(T m值为60℃左右),退火温度常在55～72℃。
研究表明提高退火温度可以增加引物与模板结合的特异性,特别在最初几次循环中采用严谨的退火温度,有助于PCR特异性扩增。
其次,为了避免引物内二级结构的产生及某个核苷酸的连续出现,3′末端最好富含G和C碱基。
3.3 微卫星PCR扩增由于是特异性扩增,所以其重复性和稳定性相对较好。
但是随着每对引物(G+C)碱基比例的不同和扩增片段长度的不同,与每对引物相对应的合适的扩增条件也不同。
通常采用改变退火温度、缓冲液中M g2+浓度及循环次数等来获得清晰可靠的条带。
Tautz等[6]在研究中发现,当第1对引物扩增到后期时,可通过加入另一个与目标序列互补的引物来去除那些由于引物与其它位点的同源性而产生的非相关性扩增条带。
另外他们还指出,尽管通过多次预实验来改变反应条件,也不能完全避免某些PCR扩增所导致的假带。
3.4 微卫星扩增产物检测微卫星经过PCR扩增所得产物在100～300bp s,而且基因型间的差异仅为几个bp s。
因此一般采用3种方法进行分离[7]:高浓度(3%～4%)的琼脂糖凝胶电泳,利用溴化乙锭染色;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用银染法来检测,分辨率较高;将PCR产物进行荧光标记(如F AM、TET、HEX等),然后经高温变性,在PE App lied B i o2 syste m s310等遗传分析仪上利用毛细管电泳分离,并通过GeneScan和Geno Typer(PE App lied B i osyste m s)等软件进行分析。
3.5 结果的分析以标准相对分子质量作为计量各条带相对分子质量的标准,依据分析软件的具体要求录入数据,计算各位点的等位基因频率以及各种群的多态位点比率、期望平均杂合度、固定系数、遗传一致性、遗传距离、迁移率等种群多态性和分化指标,最后进行聚类分析得到聚类图。
4 微卫星DNA标记技术在鱼类中的应用目前4大分子标记系统的综合效用大小为:AF LP>SSR>RAP D>RF LP。
微卫星标记之所以成为当前研究者最为喜爱的分子生物学方法之一,主要是由于微卫星具有按照孟德尔方式分离、呈共显性遗传、在数量方面没有生物上的限制、多态性高、引物通用性强等特点。
因此,在鱼类研究中微卫星标记用来分析鱼类物种遗传多样性、群体的遗传结构及种群的亲缘关系、遗传图谱的建立和基因定位、种质资源的保护和微卫星DNA指纹库的建立等。
4.1 分析鱼类物种遗传多样性鱼类是世界上最为丰富的脊椎动物类群,无论在形态、行为、生活史、体色以及各种附属器官等多方面均多姿多态,且分布范围极广,并且还有大量的变种和地方品系,遗传多样性十分丰富。
但是,随着人类社会工业化进程的加快,鱼类生存环境的污染日趋严重,栖息地减少、渔业资源过度捕捞以及气候环境的变化,使得鱼类的种类、数目都急剧减少,导致种群内亲缘关系接近的个体交配的几率大大增加,遗传多样性明显下降,相当一些种类面临灭绝的危险。
对资源遗传多样性的保护有着十分重要的意义。
检测遗传多样性的方法是随着生物学研究层次的提高和实验手段的不断改进而逐步发展起来的,如形态学水平、细胞学(染色体)水平、生理生化水平直至分子水平。
目前,一些新的基于核酸分析的分子遗传技术如微卫星DNA标记技术发展迅速,已成为分子水平遗传多样性最好的标记方法。
周莉等[8]利用普通鲤鱼的8个微卫星标记,对银鲫的5个不同雌核发育系的24尾个体进行PCR扩增,结果发现不同的雌核发育系扩增出各自独特的图谱,而同一系内的不同个体间具有高度的遗传同质性,但仍然在个别个体中检测到少量的多态片段,不同品系间的扩增图谱呈现出高度的遗传异质性。
孙效文等[9]用110对斑马鱼的微卫星标记来检测黑龙江野鲤的遗传多样性,结果显示了丰富的多态性,表明黑龙江野鲤依然保留有许多优良的原始性状;黄河野鲤和黑龙江野鲤属于同一亚种,由于生活环境的不同而形成各具特色的地理种群。
梁利群[10]等对我国史氏鲟、达氏鲟、俄罗斯鲟、小体鲟、西伯利亚鲟研究表明,其遗传多样性程度十分低下,并进行了聚类。
常玉梅[11]等发现“江西三红”3个品种间遗传差异较小,兴国红鲤和荷包红鲤的亲缘关系较近(0.93),兴国红鲤和玻璃红鲤亲缘关系次之(0.82),而荷包红鲤和玻璃红鲤亲缘关系最远(0.80)。
廖小林[12]等分析了长江水系草鱼的遗传多样性,四川群体与洞庭湖群体遗传距离最远,而嘉鱼群体与鄱阳湖群体遗传距离较近,长江水系草鱼当前的群体分化很微弱。
A larco′n[13]等利用同工酶、微卫星标记和m t D NA变异对乌颊鱼和海鲷进行了遗传多样性分析,微卫星比同工酶表现出更高的多态水平,m t D2 NA较低的变异对种群分化没有提供依据。