受精卵原核显微注射
转基因动物方法简介
转基因动物方法简介动物转基因办法简介转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。
它是根据预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。
原核显微注射法（原核期细胞：受精卵的两个核未融合时期的细胞）目前最常用的转基因动物生产办法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。
其创始人是Jaenisch和Mintz 等。
Gordon等和Palmiter等先后通过此办法获得转基因动物。
此办法目前应用较普遍，现在的转基因动物讨论大都是在Palmiter等办法的基础上有所改进而举行的。
王敏华(1996)报道用显微注射法转移抗瘟病毒核酸酶基因，获得了转基因兔。
KrimPenfort运用体外培养胚胎再施用显微注射法获得了转基因牛这种办法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因。
它可以直接获得纯系（应当也不一定，如上述鱼的状况），所以试验周期短。
但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状转变，重则致死外源基因整合到受体基因组的时机，将打算转基因动物是否发育成嵌合体，如整合发生在第一次卵裂前，即发生在DNA合成的S期，外源基因将随染色体的分别匀称的分布到每一个细胞，得到的转基因动物是纯合体，反之，得到的将是嵌合体。
显微注射转基因的实践证实，受精卵DNA合成的S期是显微注射的相宜时机。
但因为整合需要一段时光，等目的基因整合至染色体后，受精卵早已分裂多次，故很难得到纯合体。
如鱼类在原肠胚早期才开头整合，而此时细胞已多值几千，此时转植基因在每个细胞内的整合状况不行能全都，所以第一代转基因鱼总是嵌合体。
哺乳动物受精卵的单细胞期阶段较长，还有可能得到纯合体的转基因动物。
胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景
胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景作者：胡骁睿朱志伟黄菁等来源：《安徽农业科学》2014年第08期摘要综述了20多年来转基因猪的研究概况，探讨了各种转基因技术的特点，分析了胞质内单精子注射制备转基因猪技术的特点和优势，并展望了单精子注射与人工染色体载体技术相结合制备大片段转基因猪的应用前景。
关键词转基因；单精注射；人工染色体；猪胚胎中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02337-03The Advantages and Prospect of Producing Transgenic Porcine by Intracytoplasmic Sperm InjectionHU Xiaorui， PAN Jianzhi et al（Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang 321004； Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310021）Abstract The review was about the development of transgenic porcine in the last two decades. And the characteristics of different kinds of transgenic methods are discussed. This paper expounds the advantages of Intracytoplasmic Sperm Injection（ICSI） in producing transgenic porcine， and describes the application of producing large fragments of transgenic pigs by ICSI combined with artificial chromosome vectors technology.Key words Transfer genes； ICSI； Artificial chromosome vectors； Pig embryo猪的转基因技术研究具有重要的理论和商业价值[1]。
细胞显微注射 - 资料中心 - 生物在线
受精卵原核显微注射[实验目的]1 了解受精卵显微注射的基本原理及动物转基因制作过程2 掌握受精卵显微注射基本技术[实验原理]显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。
它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。
由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而是目前建立转基因动物极为重要的方法。
[仪器、材料和试剂]（一）仪器和耗材：1.PN-30拉针仪（Narishige）2. OLYMPUS SZX7实体镜3. EG-400磨针仪（Narishige）4. MF-900 锻针仪（Narishige）5. OLYMPUS IX71倒置显微镜6. Narishige显微操作系统7. JM-250电泳仪（大连捷迈）8 眼科手术器械及显微手术器械（ROBOZ）9. 毛细玻璃管G-100，GC-1（Narishige）10.细胞培养箱（Heraeus）、超净工作台、塑料平皿等。
（二）试剂1.目的基因制备相关试剂1.1 分子克隆相关试剂：TaqDNA聚合酶，DNA 连接酶，各种内切酶等1.2受精卵制备相关试剂：孕马血清（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG），透明质酸酶等1.3 转基因载体制备相关试剂1.3.1 细菌培养基（1）LB培养基（1L）： NaCl 10g，酵母提取物5g，蛋白胨10g ，pH7.0 （2）2×YT培养基(1L)：NaCl 5g，酵母提取物10g，蛋白胨16g1.3. 2 质粒提取溶液配制溶液Ⅰ：L-葡萄糖50mM，Tris-Cl(pH8.0) 25 mM，EDTA(pH8.0) 10mM，121.5℃高压灭菌20min。
功能基因组学主要研究技术
3、寻找新的基因
示例：肿瘤相关新基因的发现
4、大规模DNA测序
基因芯片利用固定探针与样品进行分子 杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品 的序列，这种测定方法快速而具有十分 诱人的前景。
Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针 的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体 基因组序列，准确率达99%。
四、基因芯片制作与应用
美 国
AFFYMETRIX
公
司
的
一
些
产 品
1989年的第一张芯片， 2002年的全人类基因组芯片， 构建在显微镜镜片上 包含33000多个基因位点
一）基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
功能基因组学（functional genomics）是 利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大 规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全 面系统地分析全部基因的功能。
功能基因组学的研究涉及众多的新技术， 包括生物信息学技术、生物芯片技术、转基因 和基因敲除技术、酵母双杂交技术、蛋白质组 学技术、反义核酸技术等技术。
linkage, and genetic variability.
2、基因表达分析
用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地 检测出成千上万个基因的表达情况。
不同时间注射PMSG和HCG对小鼠超排卵效果的影响
不同时间注射PMSG和HCG对小鼠超排卵效果的影响陈喜英;郭永昌;刘田福【摘要】目的探讨不同时间注射孕马血清激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对小鼠超排卵效果的影响. 方法选用40只6周龄F1昆明小鼠,随机分成4组,分别在同一天的11:00,13:00,15:00,17:00注射PMSG 5 IU,48 h后注射HCG5 IU,然后与公鼠合笼;次日晨检查阴栓,阳性者于当日10:00处死取卵,计数受精卵的数量. 结果 11:00,13:00,15:00和17:00组平均每只获取可用受精卵9.8枚、24.8枚、11.5枚、4.7枚. 结论在13:00注射PMSG,48 h后注射HCG对小鼠超排效果最好.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2014(045)001【总页数】3页(P23-25)【关键词】孕马血清;人绒毛膜促性腺激素;超排卵;注射时间【作者】陈喜英;郭永昌;刘田福【作者单位】山西医科大学实验动物中心,太原 030001;山西医科大学实验动物中心,太原 030001;山西医科大学实验动物中心,太原 030001【正文语种】中文【中图分类】R-33近年来，随着转基因技术的迅速发展和成熟，转基因动物在生物医药、生命科学研究领域得到越来越广泛的应用。
国际上报道了多种得到转基因动物的方法，目前真正成熟并可以稳定得到转基因动物的方法主要有三种，即原核显微注射法、精子介导的基因转移法和核移植。
其中，显微注射法是转基因最简单、最常用的的方法，其操作步骤包括受精卵的采集、显微注射和胚胎移植。
要取得原核显微注射的高成功率首先要得到质量好、数量多的原核期受精卵。
小鼠在生理状态下一次排卵10－15颗，远不能满足实验的需要。
为了增加可获得的卵子数量，用孕马血清(PMSG)模拟促卵泡激素，用人绒毛膜促性腺激素(HCG)模拟黄体生成素(LH)可以诱发交配雌鼠排卵多于正常排卵数即超排卵。
超排反应是一个由一系列极其复杂的生理过程累积而产生的结果，影响因素诸多［1］，包括动物遗传特性、体况、营养状态、年龄、发情周期的阶段、卵巢的功能状态、季节、温度以及激素剂量等。
动物基因是如何转移的？
动物基因是如何转移的？作者：冬雪来源：《百科知识》2014年第20期通过基因工程技术把外源性目标基因导入某种受体动物的生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在其染色体上稳定整合，之后经过各种发育途径把外源性基因传递到子代，这就是动物的转基因，或称转基因动物。
外源性基因导入受体动物有不同的方法，同时，由于有不同的受体动物，因此要根据实际情况采用不同的方法对动物进行转基因。
大致而言，动物转基因的方法有：逆转录病毒法、显微注射法、胚胎干细胞介导法、精子载体法和体细胞核移植法（体细胞克隆介导法）等。
通过逆转录病毒转移基因研究人员早就发现，逆转录病毒常常能侵入宿主细胞并整合于细胞中的DNA，因此逆转录病毒被用来当成载体以进行外源性基因的转移。
一般做法是，把外源性基因插入到逆转录病毒，再由逆转录病毒感染受体动物的胚胎。
此后将感染的桑椹期胚胎导入动物子宫，就可发育成携带外源性基因的子代动物。
具体的原理是，逆转录病毒的核酸在逆转录酶作用下会反转录为双链DNA，然后整合到受体细胞核基因组中。
由于逆转录病毒DNA的长末端重复序列（LTR）区域具有转录启动子活性，如果把外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，加入到动物早期胚胎的培养液中，或与胚胎共同培养，或注入囊胚腔中，携带外源性基因的逆转录病毒DNA就可以整合到宿主染色体上，达到外源性基因转移到受体动物胚胎的目的。
2001年，美国哥伦比亚大学的帕克等人利用逆转录病毒将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转入猪的成纤维细胞和耳上皮细胞，然后用这些细胞的细胞核进行核移植，获得了能发出绿色荧光的转基因猪。
与此同时，其他研究人员利用这种方法培育出转基因猴。
但是，逆转录病毒作为载体具有潜在的致癌性，而且载体的构建较为复杂，容纳外源性基因的大小也有限，因此这项技术的应用受到一定限制。
显微注射法转移基因动物转基因的显微注射法又称受精卵原核显微注射法，是用直径约0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受体动物的受精卵的细胞内，将外源性基因注入细胞中，然后通过受体动物基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等，使外源性基因嵌入受体动物的染色体内，最后这样的胚胎移植到代孕母体子宫内并发育成子代个体。
显微注射
[实验目的]1 了解细胞显微注射的基本原理2 掌握细胞显微注射基本技术[实验原理]显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。
它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。
它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。
尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。
显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。
[仪器、材料和试剂]（一）仪器和用具：倒置显微镜（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）；Leitz重型基座（用于安放显微镜和微操作仪）；微操作仪：Leitz（手动系统，安在平台上）或Eppendorf 5171（自动轴向微注射系统，可固定在显微镜的载物台上）；微注射器：Eppendorf 5242，也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉针仪：水平拉针仪P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉针仪720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射针头：可购买厂商拉制好的商品，也可用拉针仪自行拉制（可参照[方法与步骤]中的1.1注射针头的拉制）。
简述胚胎工程技术的发展历程及应用
简述胚胎工程技术的发展历程及应用摘要胚胎工程是我们高中生物的重要知识点，基于对课本知识的进一步理解和相关文献资料的收集整理，文章简述了胚胎工程技术的发展历程，对其在畜牧业上的应用进行了分析，从而让我们对胚胎工程有了更全面的认识和了解。
关键词胚胎工程；移植；分割；转基因1 胚胎工程的定义胚胎工程主要是对哺乳动物的胚胎进行某种工程技术操作，然后让其继续发育获得人们所需要的成体动物的一种技术。
对动物早期胚胎所进行的多种显微操作和处理技术。
包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术[1]。
2 胚胎工程技术的发展历程2.1 胚胎移植哺乳动物的胚胎移植始于1890年，当时英国剑桥大学Heape首次获得兔受精卵移植的成功。
Heape的成功，第一次证实了受精卵在寄主体内发育的可能性，从而奠定胚胎移植的生理学基础和原则。
19世纪30年代以后，胚胎移植成为生物科学研究的主要方向之一，几种家畜如绵羊（1934）、山羊（1949）、猪（1951）、牛（1951）和马（1973）都相继获得移植成功。
但这一时期，胚胎移植主要停留在实验室水平和鲜胚的移植上。
其原因是移植过程中，手术操作常常会对受体和供体造成不良影响，甚至影响供体以后的生殖能力，同时胚胎来源途径少，使移植失去了生产意义。
60年代以后，随着畜牧业的发展和繁殖基础理论研究的深入，人们开始采用激素对供体进行超数排卵处理，对受体进行同期发情处理。
尤其是Sugie（1972 年）设计成功非手术采卵方法，推动了胚胎移植技术的成熟和胚胎移植的商品化。
1971年，世界上出现了第一个胚胎移植的商业运作公司。
2.2 胚胎分割胚胎分割是继冻胚移植之后对胚胎处理的又一新技术。
胚胎分割始于六十年代，它是通过对胚胎进行显微手术，人工制造同卵双胎或同卵多胎是胚胎移植中增加胚胎来源的一个重要途径。
同时，还有利于良种扩群；可培养同卵孪生动物，为药学、医学、生物学试验提供试验动物，获得更准确研究结果，对科学实验和生产应用都有重要意义。