临床微生物：细菌非培养检测方法
CNAS-GL028：2018《临床微生物检验程序验证指南》
CNAS-GL028临床微生物检验程序验证指南Guidance on the Verification of Procedures used in the Clinical Microbiology中国合格评定国家认可委员会前言本文件由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）制定，是对CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》和CNAS-CL02-A005:2018《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明》中有关临床微生物检验程序验证所做的具体解释和指导，供医学实验室和评审员参考使用。
本文件的附录A和附录B为资料性附录。
本文件代替：CNAS-GL41：2016。
本次为换版修订，相对于CNAS-GL41：2016，本次换版仅涉及文件编号改变。
临床微生物检验程序验证指南1 范围本指南适用于申请认可或已经认可的医学实验室规范其临床微生物检验程序验证的技术活动，也可供认可评审员在评审过程中使用。
本指南主要适用于医学实验室临床微生物检验，其他领域的实验室可参考使用。
临床微生物检验程序，也称临床微生物检验方法，在本指南中统一称为临床微生物检验程序（以下简称“检验程序”），包括显微镜检查、分离培养和鉴定、药物敏感试验等各项检验活动。
2引用文件3 术语和定义4 检验程序验证4.1在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。
实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。
实验室进行的独立验证，应通过获取客观证据（以性能特征形式）证实检验程序的性能与其声明相符。
验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关。
细菌鉴定和药敏系统的验证，应按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果符合性进行验证。
注：已确认的检验程序是经国家卫生管理部门批准的体外诊断医疗器械使用说明书中规定的程序，或国际公认标准或指南中的，或国家、地区法规中规定的程序。
医学检验—微生物基础(六)
医学检验—微生物基础（六）培养基一、分类1.营养琼脂：标本及各类细菌的增菌培养。
【基础培养基】2.血平板：各类细菌检验标本的分离。
【营养培养基】3.巧克力平板：疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
【营养培养基】4.中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板：筛选革兰阴性细菌；鉴别发酵型革兰阴性杆菌菌种。
【弱选择培养基】5.麦康凯平板：筛选革兰阴性杆菌和非发酵菌。
【弱选择培养基】6.SS琼脂：筛选肠道致病菌，如志贺菌和沙门菌。
【强选择培养基】煌绿可以抑制大肠埃希菌7.碱性琼脂或TCBS琼脂：从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。
8. 真菌培养基：沙保弱培养基二、血琼脂上的溶血1.α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状。
2.β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的环。
3.γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。
4.双环：双层溶血环，内层为β溶血，外层为α溶血。
如产气荚膜梭菌。
三、气味1.铜绿假单胞菌（生姜气味）2.变形杆菌（巧克力烧焦气味）3.厌氧梭菌（腐败的恶臭味）4.放线菌（泥土味）等。
四、细菌在液体培养基中的生长现象1.浑浊生长：大多数细菌。
2.沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。
3.菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。
五、细菌在半固体培养基中的生长现象1.有鞭毛在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。
2.无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。
六、细菌非培养检测方法1.细菌毒素检测内毒素：鲎试验常见于革兰阴性菌感染外毒素：体内及体外毒力实验常见于革兰阳性菌及部分阴性菌。
2.实验动物①无菌动物：就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。
②悉生动物：给无菌动物引入5-17种正常肠道菌群培育而成的动物③无特殊病原动物:无特定的微生物或寄生虫的动物④清洁动物：不带有人畜共患病原或烈性传染病病原及常见传染病病原的动物⑤常规动物：在自然环境中饲养的带菌动物七、细菌的自动化检测1.自动血培养检测系统基本原理：检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳（C02）来作为血液中有无微生物存在的指标。
微生物限度检测方法
微生物限度检测方法微生物限度检测是指在药品、食品、化妆品等产品中，对微生物的数量和种类进行检测，以确保产品的质量安全。
微生物限度检测方法的选择和执行对产品的质量控制和安全性评价具有重要意义。
本文将介绍常见的微生物限度检测方法及其应用。
一、培养法。
培养法是一种常见的微生物限度检测方法，它通过将样品接种在适当的培养基上，利用微生物在培养基上生长、分裂和形成可见的典型菌落的特性，来检测微生物的数量和种类。
培养法主要包括菌落计数法、膜过滤法等。
菌落计数法是将样品均匀涂布在含有营养物质的琼脂平板上，经过一定时间的培养后，根据菌落的数量来确定微生物的数量。
膜过滤法是将样品过滤到孔径为0.45μm的膜上，然后将膜放置在含有营养物质的琼脂平板上培养，根据在膜上形成的菌落数量来确定微生物的数量。
二、生物学法。
生物学法是利用微生物的生物学特性，通过培养微生物或者利用生物学试剂来检测微生物的数量和种类。
生物学法主要包括酶标记法、PCR法等。
酶标记法是利用酶标记的抗体或抗原来检测微生物的数量和种类，其原理是将酶标记的抗体或抗原与待检测微生物发生特异性反应，然后通过酶反应产生显色物质或荧光物质来进行检测。
PCR法是利用聚合酶链式反应技术，通过扩增微生物的特异基因序列来检测微生物的数量和种类。
三、物理化学法。
物理化学法是利用微生物的生理生化特性，通过测定微生物的生长代谢产物或者利用特定的物理化学性质来检测微生物的数量和种类。
物理化学法主要包括ATP生物发光法、流式细胞术等。
ATP生物发光法是利用微生物在生长过程中产生的ATP来进行检测，通过测定样品中的ATP含量来确定微生物的数量。
流式细胞术是利用流式细胞仪对微生物进行快速、高效的检测和鉴定，通过测定微生物在流式细胞仪中的光散射和荧光信号来确定微生物的数量和种类。
综上所述，微生物限度检测方法多种多样，每种方法都有其适用的范围和特点。
在实际应用中，需要根据产品的特点和检测的目的选择合适的检测方法，并严格按照相应的标准和规范进行执行，以确保产品的质量安全。
检测细菌的方法
检测细菌的方法
1细菌检测方法
细菌是人类致病细菌的主要来源，细菌检测是临床微生物学中极为重要的一项内容。
细菌检测的方法由过去的传统技术，如培养、显微镜检测、血液凝固试验，到近几年出现的DNA测序等分子生物学技术，皆起到了重要作用。
一、培养法
培养法是一种最常见的类型细菌检测方法，它包括用适宜的培养基制备培养基，将样本于培养基上的细菌放置并培养，当细菌生长到一定数量时，进行细菌鉴定分析。
二、显微镜检测
显微镜检测大多借助显微镜来观察细菌，可以观察细菌形态、弯曲度、真菌丝状分裂等，进而确定细菌的特性。
在显微镜检测过程中，通常也会采用特殊的染色来提高细菌的识别度。
三、血液凝固试验
血液凝固试验是检测细菌毒力的一种试验。
原理是将包含有细菌的样本混合血清或血浆的混合液，放置一定时间后测量其凝固时间，从而判断样本中细菌的毒力。
四、DNA测序
DNA测序也是近年来比较火热的检测方法之一，它可以检测出某物种的特异性DNA和细菌基因组，通过对细菌基因组的比对可以快速进行物种鉴定和原菌测定。
以上就是细菌检测的几种常用方法，不同的细菌致病机制及疾病特点，相应的检测方法也不尽相同，所以在进行细菌检测时，应根据检测的内容，选择合适的检测方法，以获得准确的结果。
临床细菌常规检验方法
临床细菌常规检验方法1.样本收集：通常采用微生物标本采集套装，如采血培养瓶、骨髓培养瓶、尿培养瓶、分泌物培养瓶等。
不同类型的标本要按照不同的采集方法进行采集，以确保样本的纯度和无污染。
2.样本处理：在获得样本后，要进行适当的处理，如血液样本要进行离心分离，分离出红细胞和血浆/血清。
尿液样本要进行离心去除悬浊物等。
3.细菌培养：将已处理的样本分别接种到含有适当培养基的培养皿中，并在适当温度和湿度下培养一段时间。
通常常规培养采用的培养基包括血浆琼脂、麦康凯琼脂等。
培养时间通常为24-48小时，特殊细菌可能需要更长的培养时间。
4.细菌鉴定：对培养出的菌落进行初步的形态学鉴定，如观察菌落形状、大小、颜色等。
然后进行革兰染色，观察细菌的形态特征，如是否革兰阳性或革兰阴性。
根据初步鉴定的结果，可以选择进一步的生化试验或分子生物学检测，如氧化/发酵试验、羟基酸钠试验、目标序列扩增等。
最终确定细菌的种类和特征。
5.药敏试验：对已鉴定出的细菌进行药敏试验，以确定细菌对各类抗生素的敏感性。
药敏试验通常采用纸片扩散法或肉汤稀释法，通过观察菌落的生长抑制区域大小来判断细菌对抗生素的敏感程度。
6.结果分析和报告：根据细菌培养和鉴定的结果以及药敏试验的结果，进行结果分析和判断。
最后将结果整理成报告，提供给临床医生参考，帮助临床医生做出正确的诊断和治疗决策。
总的来说，临床细菌常规检验方法包括了样本收集、样本处理、细菌培养、细菌鉴定、药敏试验等步骤。
这些步骤的顺序和方法都有一定的规范和标准，以确保检验结果的准确性和可靠性。
临床细菌常规检验在临床诊断和治疗中起着重要的作用，可以帮助医生选择合适的抗生素治疗方案，提高治疗效果。
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测方法微生物检测是一种重要的实验室技术，用于确定环境中存在的微生物种类和数量。
常见的微生物检测方法包括传统培养法、分子生物学方法、蛋白质组学方法以及现代高通量测序技术等。
下面将详细介绍这些方法。
传统培养法是最常用的微生物检测方法之一、该方法通过将样本涂布在含有适当培养基的培养皿上，并在适当的环境条件下孵化，利用细菌、真菌等微生物的生长特性和形态特征，进行种类鉴定和数量统计。
传统培养法的优点是操作简单，鉴定准确，特异性强。
但也存在一些缺点，比如需要相对较长的孵化时间（通常需要数天到数周），无法培养非可培养的微生物。
分子生物学方法通过检测微生物的核酸序列来进行鉴定和数量统计。
其中，PCR（聚合酶链式反应）是最常用的方法之一、PCR是通过引物特异性与待检测微生物DNA进行扩增，然后通过凝胶电泳或实时荧光PCR进行检验。
这种方法具有革命性的意义，因为它能够扩增极小数量的微生物DNA，提高了检测的灵敏度，并且能够鉴定非可培养的微生物。
蛋白质组学方法是通过分析微生物蛋白质谱图来鉴定和量化微生物。
质谱分析可以通过加样蛋白质提取和分离，并通过质谱仪探针与蛋白质质谱图进行识别和鉴定。
这种方法具有高分辨率和高灵敏度的优点，并且可以同时鉴定多个微生物。
现代高通量测序技术是一种快速、高效的微生物检测方法。
通过将待测样品中的微生物DNA进行扩增、建库和高通量测序，可以获得大量的DNA序列信息。
将这些序列与参考数据库进行比对和分析，可以鉴定微生物的种类和数量。
这种方法被广泛应用于环境微生物学、医院感染控制以及食品安全等领域。
此外，还有一些其他的微生物检测方法，如流式细胞术、电子显微镜等。
流式细胞术通过检测细胞的生物物理性质，如大小、荧光特性等，来鉴定和计数微生物。
电子显微镜是通过高分辨率的电子显微镜观察样本中的微生物形态和结构特征，从而进行鉴定和计数。
这些方法在微生物学研究和实际应用中都有广泛的应用。
综上所述，常见的微生物检测方法包括传统培养法、分子生物学方法（如PCR技术）、蛋白质组学方法、现代高通量测序技术以及流式细胞术和电子显微镜等。
微生物检测方法
微生物检测方法微生物检测是指对环境、食品、药品等中的微生物进行检测和监测的方法。
微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒、藻类等。
它们在自然界中广泛存在，对人类的生产生活和健康造成了一定的影响。
因此，对微生物的检测至关重要。
本文将介绍几种常用的微生物检测方法。
首先，常用的微生物检测方法之一是培养法。
培养法是将待检样品在适当的培养基上培养，利用微生物在培养基上生长繁殖的特性，通过观察培养基上的菌落形态、颜色、大小等特征，来判断待检样品中是否存在微生物。
培养法的优点是操作简单，结果直观，但需要较长的培养时间，且只能检测到能在特定培养条件下生长的微生物。
其次，PCR法是一种快速、高灵敏度的微生物检测方法。
PCR法利用聚合酶链式反应技术，通过扩增待检样品中微生物的DNA序列，从而实现微生物的检测和鉴定。
PCR法具有高度的特异性和灵敏度，能够检测到极小量的微生物，且可以快速得到结果。
但是PCR法对实验条件要求较高，且可能受到污染的影响。
另外，免疫学检测法也是一种常用的微生物检测方法。
免疫学检测法利用抗原与抗体之间的特异性反应来检测微生物。
常见的免疫学检测方法包括ELISA法、免疫荧光法等。
这些方法具有高度的特异性和灵敏度，能够快速、准确地检测微生物的存在。
但是免疫学检测方法需要相应的抗体或抗原，且操作较为繁琐。
最后，基因测序技术是一种新兴的微生物检测方法。
基因测序技术通过对微生物的基因组进行测序分析，来实现微生物的检测和鉴定。
基因测序技术具有高度的特异性和灵敏度，能够对微生物进行全面、准确的检测和鉴定。
但是基因测序技术需要较长的分析时间和较高的成本。
综上所述，微生物检测方法有多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际的微生物检测中，可以根据具体的情况选择合适的检测方法，以确保检测结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的内容对您有所帮助。
微生物学基本实验方法和诊断
五、鲎试验(Limulus test, LT)
鲎试验是利用鲎试剂能与微量内毒素反应形成固态 凝胶来检测内毒素的试验。 鲎试剂是鲎血液中的变形细胞溶解物（Limulus amebocytes lysate，LAT），为白色粉末，易溶于 水和生理盐水中。鲎试剂中含C因子、B因子、凝固 酶原和凝固蛋白原等几种参与级联酶反应的成分。 在一定条件下，微量的内毒素即能激活鲎试剂溶液 中的C因子，活化C因子激活B因子，活化B因子使凝 固酶原转变为凝固酶，凝固酶使凝固蛋白原转变成 凝固蛋白，最终导致凝胶的形成。
培养基的种类—按用途分类
（3）鉴别培养基：在培养基中加入特定的底物 和指示剂，即为鉴别培养基。鉴别培养基用来 作细菌的生化试验，以便鉴定细菌，因此这类 培养基是临床细菌检验常的培养基。如糖发酵 培养基、克氏双糖铁培养基（KIA）、动力－吲 哚－尿素（MIU）培养基等。
培养基的种类—按用途分类
（4）选择培养基：在培养基中加入某种化学物质 或抗生素，以抑制某些细菌种类生长，有助于需要 的细菌种类生长。此类培养基主要用于从含菌种类 （主要是正常菌群）较多的标本（如粪便）中分离 培养专性病原菌。如胆盐培养基、SS琼脂、麦康凯 琼脂、中国兰琼脂、伊红－美兰琼脂用于从粪便中 分离培养志贺菌和沙门菌；庆大霉素琼脂、碱性琼 脂用于从粪便中分离培养霍乱弧菌。 （5）特殊培养基：包括培养细菌L型的培养基，培 养厌氧菌的厌氧培养基。这类培养基用于培养营养 要求和生长条件较特殊的细菌。
细菌L型检查
（一）培养基：培养细菌L型的培养基需 具有丰富的营养和高渗生长条件。培养基 常以心脑浸液及牛肉浸液为基础，加入 1~2％蛋白胨、5％NaCl（使致高渗）， pH7.6~7.8、1％琼脂，高压蒸汽灭菌后制 备成固体培养基，必要时高压蒸汽灭菌后 待至60℃左右加入20％无菌马、羊或人血 浆，制备成固体培养基。
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严重后果
❖院长、副院长及相关医务主管负责人撤职 ❖卫生部通报批评，严令整改 ❖医院营业量一落千丈，“百佳医院”名声
外毒素的检测：待检菌的鉴定，并区分
产毒株与非产毒株
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鲎试验
一种海洋无脊椎动物 蓝色的血液
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鲎试验的发现
❖1956年Johns Hophins 大学动物学家 Frederik Bang发现革兰阴性细菌的粗制 品能使鲎的血细胞凝聚。
❖1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌 引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎 血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种 酶反应。
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核酸杂交在临床微生物检测中的应用
❖细菌分类鉴定 ❖细菌快速鉴定 ❖细菌耐药性的检测 ❖细菌毒素的检测 ❖细菌流行病学调查
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聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）
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PCR扩增产物的分析
❖凝胶电泳分析法 ❖斑点杂交法 ❖酶谱分析法 ❖序列分析法
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PCR产物的分析
特点：高通量、高集成、微型化、平行化、 多样化和自动化
发展迅速，应用日益广泛
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基因芯片的优点
❖短时间分析大量的核酸序列 ❖可25
分子生物学检测应用发展
❖传统方法目前不可替代 ❖快速简便的分子诊断技术越来越普及
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细菌毒素的检测
内毒素的检测：G-细菌感染（鲎试验）
❖已知抗原检测抗体的存在：效价 （或滴度）的升高
❖诊断血清
▪ 多价血清 ▪ 单价血清
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一、链球菌感染
（一）化脓性链球菌 免疫学检查
生物学性状
是引起化脓性疾病的常见细
菌 A群链球菌有较强的侵袭力 可产生多种酶和外毒素
✓ 抗链球菌溶血素“O” ✓ 抗链激酶试验 ✓ 抗透明质酸酶（ADH） ✓ 抗DNA酶B（DNA-B） ✓ 抗链球菌多糖体（ASP）
一）类脂抗原试验 1、性病研究实验室试验（ venereal disease
research laboratory，VDRL） 2、不加热血清反应素试验（unheated serum
reagin，USR） 3、快速血浆反应素试验（ rapid plasma reagin，
RPR） （4）TRUST(甲苯胺红不加热血清试验)
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二）密螺旋体抗体试验 1、荧光密螺旋体吸收试验（fluorenscent
treponemal antibody-absorption， FTAABStest） 2、梅毒螺旋体血凝试验（ treponemal pallidum hemagglutination test，TPHA) 3、ELISA：区分IgM和IgG，判断先天性梅毒 或活动性神经梅毒。
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PCR在临床微生物检验中的应用
❖细菌的快速检测 ❖细菌毒素的检测 ❖细菌的耐药性的检测 ❖细菌流行病学调查
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基因芯片技术
最早的生物芯片
概念源于计算机芯片
1998年度世界10大科技进展之一
基本原理：微阵列技术，核苷酸固定到固体支持物上， 将处理好的样品与其进行杂交，以实现对所测样品基 因的大规模检验。
疗效检验
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医院内感染
医院内感染“西安事件”
事件经过
– 2008年8月28 日至9月16日期间,西安交通大学医学院第一附 属医院新生儿科收治的94名新生儿患者中,有8名新生儿从9月5 日至15日先后死亡 – 临床表现：自9月3 日起相继出现发热、心率加快、肝脾肿 大等临床症状，其中8名新生儿于9月5 日—15 日间发生弥漫性 血管内凝血相继死亡，1名新生儿经医院治疗好转。 –卫生部于9月23 日接到关于该事件的举报信息后，立即组织 专家调查组赶赴该院，与陕西省专家调查组共同开展实地调查。 –经专家组调查，认为该事件是一起严重医院内感染事件。
❖多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行 研究，阐释了凝聚机制
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凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理
——复杂的酶促反应过程
内毒素 二价阳离子
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
（旁路反应）
β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM
活化的G因子
G因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原
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动物实验
❖分离和鉴定病原微生物 ❖测定细菌的毒力 ❖制备免疫血清 ❖建立致病动物模型 ❖取动物的血清配制培养基 ❖用于生物制品或一些药物的安全、毒性、
酶联免疫吸附 试验 (ELISA）
检测伤寒杆菌 的抗原和抗体
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三、结核分枝杆菌感染
生物学性状
分枝杆菌科分枝杆菌属 人型和牛型是人类的主要致病 菌 可诱导抗感染细胞免疫和体液 免疫反应
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免疫学检测方法
✓ 分枝杆菌抗原检测 ✓ 结核特异性IgG的检 测 ✓ 特异性免疫复合物
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梅毒螺旋体
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调查发现
❖儿科建筑布局和工作流程不合理，人流与物流相 互交叉;对部分新生儿使用的物品和器具采用了错误 的消毒方法;医务人员没有规范地进行手卫生; 用于 新生儿的肝素封管液无使用时间标识等。 ❖对部分医务人员的手、病房物体表面、新生儿使 用的奶瓶和奶嘴、新生儿暖箱注水口等进行检测， 发现细菌超标严重，有金黄色葡萄球菌、肺炎克雷 伯菌的明显污染。
7
ASO的临床检测
胶乳凝集 试验
免疫散射 比浊法
8
ASO检测的临床意 义
ASO增高常见于： ➢ 急性咽炎等上呼吸道感染
➢ 风湿性心肌炎 ➢ 心包炎 ➢ 风湿性关节炎 ➢ 急性肾小球肾炎等 ➢ 免疫功能不全ASO可不增高
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二、伤寒沙门氏菌感染
免疫学检测方法
肥达氏凝 集试验
凝集时抗体效 价≥1:80为阳性
细菌非培养检测方法
非培养方法极大节约检验时间
2
主要方法
❖免疫学检测 ❖分子生物学检测 ❖细菌毒素检测 ❖动物实验
3
免疫学检测
Ag+Ab
AgAb
用已知抗体或抗原来检测未知抗原抗体
4
抗原检测
❖凝集试验 ❖免疫荧光技术 ❖ELISA
5
抗体检测
❖临床常用于：TB、梅毒、肺炎支 原体、肺炎衣原体检测
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细菌感染的分子生物学检测
15
细菌感染的分子生物学检测
❖核酸杂交 ❖聚合酶链反应（PCR） ❖生物芯片技术
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核酸杂交
❖核酸探针：带有标记物、能与特定核酸序 列发生特异性互补的已知序列核酸片段。
❖核酸杂交方法：
1.斑点杂交 2.菌落原位杂交 3.Southern印迹 4.Northern印迹